转基因大豆检测手段
PCR扩增检测转基因大豆、玉米
【实验步骤】 基因组DNA浓度和纯度的鉴定
取5μL样品溶于95μL三重蒸馏水中，用 Biophotometer分 析DNA的浓度，通过它对提取大豆DNA测OD值。并记 录数据。由OD260nm/OD280nm判定基因组DNA的浓度， 其比值在1.7~2.0之间较好，符合PCR检测要求。
聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction, PCR)是 一种选择性体外扩增DNA的方法，其基本原理类 似 于 DNA 的 天 然 复 制 过 程 。 它 包 括 : 变 性 (Denature) 、 退火(Anneal)和延伸(Extension)三个基
外源基因( EPSPS)特异性扩增 12 3 4567M 12
外源终止子(NOS) 特异性扩增
外源启动子(CaMV35S)特 异性扩增
1 未加模板对照 2 转基因大豆、玉米 3~7 非转基因大豆、玉米
PCR假阳性结果 1． 引物设计不当，应调换引物 2． 循环参数不合适，导致非特异性扩增 3． 靶序列的交叉污染
大豆凝集素(Lectin)基因、玉米特异性内源基
因IVR为内参 ？
西医学是最近三四百年来建立在解 剖学、 生物学 及现代 科学技 术基础 上、发 展起来 的一门 以“解 剖人、 肉体人 ”为概 念的、 新兴的 现代医 学科学 理论体 系。主 要采用 科学实 验方法 ，从宏 观到微 观，直 至目前 的分子 基因层 次水平 ，发展 极为迅 速，超 过其它 任何一 门医学 科学， 成为世 界医学 史上的 主流。 医学、比较医学、后现代医学、行为 医学等 所谓“ 医学” ，都称 不上一 门独立 的医学 科学， 关于这 一点在 灵魂医 学有关 章节中 将有相 关点评 。
【实验步骤】
大豆、玉米DNA 提取--改良的CTAB法
实验三 PCR-荧光探针法鉴定转基因大豆
实时荧光定量PCR Quantitative Real-Time PCR
（一）Real-time qPCR原理
实时定量PCR原理
• 实时定量PCR技术（real-time quantitative PCR） 是指在PCR反应体系中加入荧光染料，实时监测 荧光染料 整个PCR过程中荧光信号的累积强度，并利用特定 数学原理对未知模板进行定量分析的方法。
基因组DNA分离纯化中的注意事项
保证基因组DNA的完整性和纯度 提高DNA的洗脱效率 DNA的储存
（二）转基因大豆鉴定 — CaMV35S基因核酸检测试剂盒杂交试剂盒
• 采用实时荧光PCR技术，针对CaMV35S基因核 酸序列设计特异性引物和荧光探针，通过实 时荧光PCR（Taqman探针法）对转基因成分 CaMV35S基因进行检测。
特异性高 多重PCR检出
要求反应的特异性 不能进行多重PCR
Probe设计要求高 Probe合成费用高
常用于mRNA表达量分析等
常用于SNP解析，病毒、病原菌检测
（三）Real-Time qPCR主要概念
非探针 扩增曲线
化学原理
实时定量PCR
两个重要图形
探针
熔解曲线
Real-Time qPCR曲线的意义
106 105 104 103 102 10
荧光强度---循环数曲线
初始模板量对数---C(T)循环数标准曲线
三、实验内容
• 大豆DNA提取 • PCR-荧光探针法检测CaMV35S基因
四、实验材料和用品
大豆 大豆DNA提取试剂盒 CaMV35S基因核酸检测试剂盒 仪器：荧光定量PCR仪 台式离心机等
DePure Plant DNA Kit 基于硅胶 柱纯化方式。样品经液氮或研磨仪匀 浆后，在裂解液中裂解，DNA 释放到 裂解液中。经高盐溶液沉淀去除多糖 等杂质后，加入乙醇，转移至柱子中 过滤，DNA 被吸附到柱子的膜上，而 蛋白质则不被吸附而去除。柱子经 Buffer GW2 洗涤去除盐分，最后 DNA 经 Buffer AE洗脱。
食品中转基因成分检测(大豆)
食品中转基因成分检测第12章ELISA方法定量检测抗农达® (RoundupReady®) 转基因大豆F．Eyquem食品中转基因成分检测 第12章2ELISA 方法定量检测抗农达® (Roundup Ready®) 转基因大豆 目 录第12章ELISA 方法定量检测抗农达® (Roundup Ready®) 转基因大豆引言 3酶联免疫吸附分析 (ELISA) 技术 7 实验部分 10参考文献 20食品中转基因成分检测 第12章3ELISA 方法定量检测抗农达® (Roundup Ready®) 转基因大豆 引言本章介绍一种用免疫学技术检测转基因植物的方法，这种方法是基于对转化事件中转入基因产生的新蛋白的检测。
但是，值得注意的是，基因修饰并不总是直接特异地对应于产生新蛋白，蛋白表达量水平也并不总是足够用于检测的目的。
另外，某些蛋白可能仅在植物的特定部位表达 (如：组织特异性启动子)，或者在不同部位或不同生理时期其表达量水平也不一样。
有报道称植物中转基因产物表达量水平占总可溶性蛋白的0~2%，甚至在一些强启动子植物中也是如此 (Longstaff ，1995)。
然而，在许多情况下，文献资料报道的转入基因蛋白表达量水平 (如：批准的GM 作物) 一般低于2%的表达上限 (henner ，1997)。
免疫学分析是一种用抗体作为检测试剂的分析测定系统。
抗体是一种从动物血清中分离得到的特异性蛋白，它可特异性地结合于诱导它们产物的底物，即抗原。
抗体的制备是通过将待检测的底物 (如：CP4 EPSPS ，是一种产生农达除草剂抗性的蛋白) 注射到动物如兔子或者老鼠体内，然后动物体内的细胞会将此底物识别为外来物质并产生抗体与之对抗。
抗体经过纯化，并用可检测的标记与之连接，然后可作为检测目标底物的试剂。
免疫学检测方法发展和应用的先决条件是：得到可直接和待检测新蛋白作用的高特异性抗体。
大豆转基因检测
本实验采用定性pcr方法检测大豆是否为转基因。Fra bibliotek实验结果
1.大豆基因组提取质量检测 1.1琼脂糖电泳：
图一 吸光值检测：DNA浓度=OD260/OD280=1.85 在1.7-2.0之间，符合PCR的标准。
PCR结果：
由于第一次结果不是很好，本实验经过两次pcr结果。 第一次：
讨论：
本次实验基本达成实验目的，有些地方需要注意。 （1）提取DNA的时候要仔细，DNA的质量高低影响后续实验。 比如蛋白质等物质需要除尽。 （2）使用RNArase需要注意，不然容易导致实验失败。 （3）在配制PCR体系的时候，发现配制母液再分装到各个管 时，导致最后一管的体积不够，导致之后影响PCR。 （4）跑电泳前 使用氯仿异戊醇擦拭电泳槽发现结果较好。 （5）本实验使用EB染色，但个人认为可以尝试核酸染料，感 觉本次实验染色不如以前使用核酸染料效果佳。
L L
C C
M M
图二
第二次：
图三
实验结果分析
如图一：（1）提取出的大豆基因组成色较好。电泳条带 清晰。但颜色较淡，可能是点样的体积过少。
（2）跑电泳前使用氯仿/异戊醇擦拭电泳槽面检 测DNA的结果较好
图二：此为第一次跑PCR的电泳图。
图中有明亮且清晰的条带，但Maker跑的质量不是很好。 经分析可能是凝胶的质量不够好，或者是点样点的不好。 图三：为第二次PCR产物电泳，效果较好，有清晰明亮条带， 能看清。
谢谢
大豆转基因检测标准
大豆转基因检测标准1. 背景介绍大豆是世界上最重要的农作物之一，它不仅是一种重要的食物来源，还被广泛用于饲料和工业原料。
然而，随着转基因技术的发展，转基因大豆的种植和使用逐渐增多。
转基因大豆不仅在农业上具有重要意义，还引发了广泛的争议。
因此，制定一套严格的大豆转基因检测标准对于保障食品安全和消费者权益至关重要。
2. 转基因技术概述转基因技术是指通过人工手段将外源基因导入到目标生物体中，并使之在目标生物体中表达。
在大豆中引入外源基因可以使其具有抗虫、抗草甘膦等特性。
然而，转基因技术也引发了人们对食品安全和环境影响等问题的担忧。
3. 国际转基因检测标准为了保证食品安全和国际贸易畅通，国际上制定了一系列关于转基因检测的标准。
其中最为知名且被广泛采用的是国际贸易法组织（Codex Alimentarius Commission）制定的转基因食品检测指南。
该指南包括了转基因检测的样品准备、检测方法、结果解释等方面的要求，为各国制定转基因食品标签要求提供了依据。
4. 国内大豆转基因检测标准现状在国内，大豆转基因检测标准的制定和执行也取得了一定进展。
2002年，中国农业部发布了《农业转基因生物安全管理办法》，其中包括了对农产品生产和加工中使用的转基因生物的监管要求。
此外，中国质量认证中心还发布了《农产品质量安全监督管理规范》，其中涉及到对大豆及其加工产品中转基因成分的监管。
5. 大豆转基因检测方法为了准确、可靠地检测大豆中是否存在转基因成分，科研人员开发出多种不同的检测方法。
目前常用的方法包括PCR法、ELISA法和质谱法等。
PCR法是一种通过扩增目标DNA片段来判断是否存在特定外源DNA 序列的方法；ELISA法是一种通过特异性抗体与外源蛋白质结合来判断是否存在特定外源蛋白质的方法；质谱法则是通过检测样品中特定外源蛋白质的氨基酸序列来判断是否存在转基因成分。
6. 大豆转基因检测标准的制定制定一套严格的大豆转基因检测标准对于确保食品安全和保护消费者权益至关重要。
实验三 大豆中转基因成分定性PCR检测
大豆中转基因成分定性PCR 检测一、 实验目的 (1)DNA 的原理和操作技术。
(2)DNA 的纯度、含量与分子大小。
(3)学习PCR 的基本原理和操作方法。
(4)掌握高速冷冻离心机、微量移液枪、水平电泳仪、PCR 仪等仪器设备的使用。
二、 实验原理由于现有的商品化转基因产品中绝大多数含35S 启动子和NOS 终止子。
故转基因食品的检测一般基于聚合酶链式反应(PCR)35S 启动子和NOS 终止子进行筛选。
聚合酶链反应(PCR)是近年来常用的一种快速、灵敏的检测转基因产品的方法,但要求待分析的基因组DNA 样品尽可能纯化。
PCR 技术的基本原理类似于DNA物。
PCR 由变性、退火、延伸三个基本反应步骤构成。
三、 PCR 引物设计表1 引物序列及扩增产物长度四、 转基因大豆抗草甘膦转基因大豆品种京引D-1 、京引D-2 、京引D-3 、京引D-4获市面上购买的转基因大豆，万能粉碎机粉碎。
五、 DNA 的提取 1、称取约0.1g 2ml 离心管中；2、加入600μl CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)缓冲液震荡均匀，65℃水浴保温30min；3、加入500μl 酚：三氯甲烷：异戊醇(25:24:1)，振荡均匀，12000r/min离心15min；4、吸取上清液，放入另一新管中加入500ul的异丙醇，12000r/min离心10min。
5、弃去上清液，加入70%乙醇溶液洗涤，12000r/min离心1min。
6、弃去上清液，干燥，用50μl TE缓冲溶液溶解沉淀。
7、加入5μl RNA酶溶液，37℃水浴保温30min。
8、加入400μl的CTAB缓冲溶液，振荡均匀。
9、加入250μl的三氯甲烷：异戊醇(1:1)，振荡均匀，12000r/min离心15min。
10、吸取上清液，放入另一个新管中，加入200μl的异丙醇，12000r/min离心10min。
11、弃去上清液，干燥，用50μl TE缓冲液溶解沉淀。
转基因大豆检测方法及标准概述
转 基 因 大 豆 是 商 品 化 最 早、 推 广 应用速度最快、种植面积最广的转基 因粮食作物。由于转基因大豆产品可 能存在潜在的环境污染、食用安全及 生态风险，对人类健康和自然环境带 来不利影响 [1]，因此需要加强对转基 因大豆产品的有效监督、监测和管理。
1 转基因大豆检测技术研究进展
农业农村部公告第 111 号 -9-2018
SN/T 3767.16-2014
SN/T 3767.17-2014
SN/T 3767.18-2014
SN/T 3767.19-2014
3 讨论与建议
目 前， 我 国 转 基 因 大 豆 的 检 测 方 法主要以 PCR 方法为主。PCR 实验成 败的关键在于模板 DNA 的提取质量， 对于不同加工过程的产品，应选择不 同 的 DNA 提 取 方 法， 同 时 采 用 紫 外 分光光度计给出 DNA 的浓度及 A260 nm/A280 nm 的比值，以判断其是否 适合进行 PCR 检测。实验中还应该注 意污染问题，建议实验过程中注意添 加阴性和空白对照。实验室的布局以
及检测工作应严格遵循国家标准中转
基因通用标准的规定。
参考文献 [1] 王南 , 李海燕 . 转基因大豆概况
及其安全性 [J]. 吉林农业 ,2016(19):118. [2] 王颢潜 , 陈锐 , 李夏莹 , 等 . 转基
因产品成分检测技术研究进展 [J]. 生物 技术通报 ,2018,34(3):31-38.
农业部 1485 号公告 -8-2010
GB/T 19495.4-2018
农业部 1782 号公告 -1-2012
GB/T 19495.5-2018
农业部 1782 号公告 -4-2012
大豆转基因成分测定能力验证结果与分析
大豆转基因成分测定能力验证结果与分析本次实验采用了双重PCR-RFLP方法，通过解析MET1和GlyBPTI-II转基因标记基因，来鉴定转基因大豆中转基因成分的含量。
实验中，首先选取了24份来源于多家市场的大豆样品，其中，12份是符合国家标准要求的非转基因大豆样品，另外12份是符合国家标准要求的转基因大豆样品，并通过按照上述实验方法测定其中转基因序列含量。
结果表明，实验的重复性良好，可信度较高，各样品的PCR检测结果相符，RFLP切片结果与PCR结果完全一致。
实验结果表明，其中12份转基因大豆样品的转基因成分含量均大于0.9，证明这些大豆样品属于纯转基因大豆；12份非转基因大豆样品的转基因成分含量均小于0.3，证明这些大豆样品为纯非转基因大豆。
综上所述，本次实验能够有效地通过PCR-RFLP方法，测定转基因大豆中转基因成分的含量，从而有效的判断大豆的转基因状态。
从可靠性分析上看，数据显示，MET1和GlyBPTI-II基因在大豆中的检测正确率高达100%，且结果误差小于5%，整体来看实验结果稳定可靠。
在可操作性分析上，实验用时仅需要7小时，耗材量少，元器件质量高，实验操作简单，可以有效支持大规模鉴定。
另外，从测定准确性分析上看，实验中样品检测结果与质控结果相吻合，质控结果呈明显的双峰样式，表明转基因成分的定量测定可靠性较好，准确性较高。
同时，综合表征分析转基因大豆中转基因成分含量的分布情况及差异情况，即MET1/GlyBPTI-II标记基因的分布差异，表明不同样品在两个基因的比值是不同的。
综上所述，通过本次的实验能够准确、可靠地测定转基因大豆中转基因成分的含量，并能够有效地支持大规模转基因大豆审核工作。
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转基因大豆检测手段的研究
【摘要】中国很多大豆制品是利用进口转基因大豆进行加工的，产品中一定含有转基因大豆的成分，但是却未被标明，所以亟待对转基因大豆进行检测的手段，本文对转基因大豆的几种检测方法进行了综述。
【关键词】转基因大豆成分 pcr sds-page 基因芯片酶联免疫吸附分析技术
我国为大豆的原产国也是大豆的主产国之一，但是近年来，国外的转基因大豆大量涌入中国，中国国产大豆失去了价格优势，很多企业选择低成本的转基因大豆作为原料。
中国是个饮食文化上很依赖大豆的国家，各种大豆制品充斥着我们的餐桌，但是由于转基因大豆可能存在安全性问题，很多消费者选择不食用转基因食品，但是有调查显示我国存在很多大豆制品中是使用转基因大豆制作的，但是都没有进行标示，所以在食品安全监测方面，亟待一种有效的检测产品中是否含有转基因成分的手段。
本文列出几种大豆制品的转基因成分的检测方法，并对其优缺点进行了综述。
1 pcr法
1.1 pcr（polymerase chain reaction）
目前，种植最广的是抗草甘膦大豆由美国孟都山公司生产的转基因大豆，转基因大豆的外源基因epsps（5-enolypyruvy lshikimate-3-phosphate synthase，来源于a.tumefaciens菌株cp4），调控元件上游为花椰菜花叶病毒camv35s启动子，下游终止
子为nos，检测时主要针对这三种基因进行检测，而且还包括大豆的内源基因lectin，用于鉴别大豆。
利用这四个基因片段的特异性基因序列，利用primer premier5.0设计四对引物，进行扩增，可以初步确定大豆中是否含有转基因成分。
有研究结果表明，利用ctab法提取大豆的总dna，对大豆的camv 35s启动子和内源基因lection pcr扩增，扩增片段长度为118bp和195bp，表明了大豆中有转基因成分。
另有研究利用gus标记基因和nos终止子的
pbi221质粒作为pcr检测的阳性对照，在转基因大豆中扩增出了阳性结果，并利用southern杂交验证了结果的可靠性。
这些研究都证明了利用pcr对转基因大豆进行检测是简便可靠的一种检测手段。
1.2 巢式（nested pcr）和半巢式pcr
在食品检验领域，很多时候我们要面对的是大豆制品，其中的dna被破坏，可供我们利用的有效的模板少，所以利用普通pcr无法检测出是否含有转基因大豆成分。
巢式pcr是设计2对引物，其中1对引物在另1对引物扩增产物的片段上，通过2次pcr反应对某个基因进行检测。
通常第1次采用能扩增较大片段的引物，经过20～30 次循环扩增后，将第1次扩增的产物作为模板进行第2次扩增。
半巢式pcr的原理与巢式pcr基本相同，只是半巢式pcr只有1对半引物，有1个引物被用于2次pcr反应中。
这2种方法不但可以减少假阳性的出现，而且可以使检测的下限下降几个数量级。
从理论上来说，用巢式和半巢式pcr可以检测到低于10-11g/
μl的dna模板量。
2 基因芯片
基因芯片是采用光导原位合成或显微印刷等方法，将大量dna
探针片段有序地固化于支持物的表面，然后与已标记的生物样品中dna分子杂交，再对杂交信号进行检测分析，就可得出该样品的遗传信息。
一次可以检验大量样品，但是造价较高，还有待开发。
3 酶联免疫吸附技术
酶联免疫吸附分析是指：应用一个酶标记的免疫反应物和一个免疫吸附剂的酶免疫分析，通过不同的方法，可用于测定未知样品的浓度。
lipp等人在2000年建立测试和验证了基于elisa的抗草甘膦转基因大豆的特异性检测方法，这个方法利用cp4-epsps（5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶）蛋白特异性抗体，初步研究表明，此方法可以检测大豆原料中的转基因成分含量范围在0.3%-5%之间。
4 蛋白质sds-page电泳
研究表明：利用sds-page蛋白电泳，发现转基因大豆中有一条分子量约为45ku的蛋白带的表达量明显比非转基因大豆强，这样可以在蛋白检测中，从表达量的大小来区分转基因大豆与非转基因大豆，但是，这个实验中，由于无法引进转基因大豆对应的原始非转基因大豆品种，只能与中国的大豆进行比对，所以结果仅作参考，但是这为转基因大豆的检测提供了一个新思路。
5 结语
转基因大豆的检测方法多种多种，各有其优点和缺点，在实际的检测工作中，要根据具体情况，选择一种行之有效的方法。
参考文献：
[1]蒋原，祝长青，林宏.利用pcr技术检测转基因大豆 round upready的研究.检验检疫科学，2001，11（4）：11-13，20.
[2]刘光明，李庆阁，王群力等.多重荧光pcr同时检测转基因成分35s和nos方法的建立.厦门大学学报，2002，41（4）：493～496.。