引物退火温度与Tm值的关系tm退火温度公式
引物设计之退火温度
Tm值就是DNA熔解温度，指把DNA的双螺旋结构降解一半时的温度。
不同序列的DNA，Tm值不同。
DNA中G－C含量越高，Tm值越高，成正比关系。
退火温度（Annealing Temperature）为引物和模板结合时候的温度参数，当50%的引物和互补序列表现为双链DNA分子时的温度·它是影响PCR特异性的较重要因素。
在理想状态下，退火温度足够低，以保证引物同目的序列有效退火，同时还要足够高，以减少非特异性结合。
合理的退火温度从55℃到70℃。
退火温度一般设定比引物的Tm低5℃。
在模板变性后温度快速冷却至40℃～60℃(某个退火温度)的时候，可使引物和模板发生结合。
由于模板DNA 比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞，这就使PCR后期的过程成为可能。
计算方法核酸Tm值（解链温度）计算评价标准是核酸所吸收的光线量达到其所增加吸收260nm光线的量的两倍达到的温度，当核酸达到Tm值时，其260nm吸收量可增加百分之四十（紫外吸收量随解体程度而增加，直至完全解体。
长度为25mer以下的引物，Tm计算公式为：Tm = 4℃(G + C)+ 2℃(A + T)对于更长的寡聚核苷酸，Tm计算公式为：Tm = 81.5 + 16.6 x Log10[Na+] + 0.41 (%GC) – 600/size公式中，Size = 引物长度。
2温度时间退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度。
对于20个核苷酸，G+C含量约50%的引物，55℃为选择最适退火温度的起点较为理想。
引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适的温度：Tm值(解链温度)=4(G+C)+2(A+T)复性温度=Tm值-(5～10℃)在Tm值允许范围内，选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性。
复性时间一般为30～60sec，足以使引物与模板之间完全结合。
PCR的退火温度选择
熔解温度(Tm)是引物的一个重要参数。
这是当50%的引物和互补序列表现为双链DNA分子时的温度・Tm对于设定PCR退火温度是必需的。
在理想状态下，退火温度足够低，以保证引物同目的序列有效退火，同时还要足够高，以减少非待异性结合。
合理的退火温度从55* 到7(TC。
退火温度一般设定比引物的Tm低5它。
设定Tm有几种公式。
有的是来源于高盐溶液中的杂交，适用于小于18碱基的引物。
有的是根据GC 含量估算Tm。
确定引物Tm最可信的方法是近邻分析法。
这种方法从序列一级结构和相邻碱基的特性预测引物的杂交稳定性。
大部分计算机程序使用近邻分析法。
根据所使用的公式及引物序列的不同，Tm会差异很大。
因为大部分公式提供一个估算的Tm 值，所有退火温度只是一个起始点。
可以通过分析几个逐步提高退火温度的反应以提高特异性。
开始低于估算的Tm5°C,以为增量，逐步提高退火温度。
较高的退火温度会减少引物二聚体和非特异性产物的形成。
为获得最佳结果，两个引物应具有近似的Tm值。
引物对的Tm差异如果超过5。
(2,就会引物在循环中使用较低的退火温度而表现出明显的错误起始。
如果两个引物Tm不同，将退火温度设定为比最低的Tm低5它或者为了提高特异性，可以在根据较高Tm设计的退火温度先进行5个循环，然后在根据较低Tm设计的退火温度进行剩余的循环。
这使得在较为严紧的条件下可以荻得目的模板的部分拷贝。
当引物长度低于20个bp可以根据Tm=3GC+2AT,对于更长的寡聚核昔酸，Tm计算公式为：Tm = 81.5+ 16. 6 x LoglO[Na+] + 0.41 (%GC) - 600/size公式中，Size =引物长度。
退火温度取决于引物长度及序列，GC含量越高退火温度越高，引物的Tm值减去5-8度即是引物的退火温度，引物的Tm值一般都会在引物合成单上体现，如果没有的话可以在网上搜个引物退火温度计算器输入序列就可以了。
退火时间一般都是30秒。
引物tm值与退火温度
引物tm值与退火温度哎呀，今天咱们聊聊引物的Tm值和退火温度，听起来有点复杂，但其实这就是分子生物学中的小玩意儿，咱们把它轻松地捋一捋。
想象一下，咱们就像一位厨师，想要做出美味的菜肴，得先掌握好食材的火候。
引物和Tm值就像咱们的调味品和烹饪温度，掌握好了，结果自然不在话下。
引物就是那小小的DNA片段，常常被用来帮助咱们在实验中识别特定的DNA序列。
它们就像是你在派对上找朋友的“名片”，没它们，咱们可能找不到对的那一位。
Tm 值，就是引物在熔解时的温度，简而言之，就是它们在多高的温度下才会“分开”，像情侣在争吵后需要冷静一下。
这个Tm值对于引物的设计至关重要，想想，如果引物在过高的温度下分开，那可真是“家无宁日”了。
说到退火温度，这可真是个有趣的概念。
简单说，就是在PCR过程中，引物跟目标DNA结合的温度。
就像约会时的氛围，太冷了，谁也不愿意靠近；太热了，可能又会让人受不了。
理想的退火温度是Tm值稍微低一点的温度，这样引物就能顺利地和目标DNA“约会”上了，彼此结合得更牢靠。
有趣的是，Tm值和退火温度并不是一成不变的，它们受引物长度、GC含量的影响。
你想想，GC碱基对就像是“胶水”，能把引物和目标DNA牢牢粘在一起。
GC含量越高，Tm值自然也就越高。
也就是说，如果你做的引物里有不少GC，就可以适当提高退火温度。
可不要小瞧这点，正确的Tm和退火温度可是一道“科学之门”，推开后，成功的实验就在眼前。
Tm值的计算还不是一件简单的事。
有很多方法可供选择，从简单的公式到复杂的算法，各种“秘籍”层出不穷。
就好比你在选择做菜的食谱，总有几本你觉得特别有用，简单易懂的。
然而，实战中总会遇到各种情况，甚至一些小误差也是常有的事。
引物设计出错、温度设置不当，实验结果都可能让你哭笑不得。
所以，仔细设计引物，精确设置退火温度，这可是分子生物学的“生死攸关”之事。
Tm值和退火温度就像咱们生活中的调和剂，处理得当，生活自然就和谐。
同源重组pcr引物退火温度-概述说明以及解释
同源重组pcr引物退火温度-概述说明以及解释1.引言1.1 概述同源重组PCR是一种重要的分子生物学技术，广泛应用于基因工程、基因组学和生命科学研究中。
在同源重组PCR反应中，引物的设计和退火温度的选择是非常关键的步骤。
引物退火温度的选择直接影响了PCR反应的特异性和扩增效率。
引物退火温度是指PCR反应中的温度条件，用来使引物与模板DNA 序列结合，以便进行DNA扩增。
引物的退火温度应适当高于其Tm（退火温度）值，以保证退火反应能够充分进行。
同时，引物退火温度也需要低于DNA链的解链温度，以避免在退火过程中引物与DNA链的解链，影响扩增效率。
引物退火温度的选择需要考虑多个因素。
首先，应根据引物的序列特性来确定其Tm值。
Tm值是DNA双链解链的温度，通常由引物的碱基组成、长度和浓度来决定。
较长的引物和富含GC碱基的引物通常具有较高的Tm值。
其次，引物的退火温度应根据模板DNA的GC含量来进行调整。
高GC含量的模板DNA需要较高的退火温度，以增加引物与模板DNA 的结合力。
最后，应该考虑反应体系的缓冲条件、引物浓度和DNA模板浓度等因素，以获得最优的引物退火温度。
通过合理选择引物退火温度，可以提高同源重组PCR反应的特异性和扩增效率。
较高的退火温度可以增加引物与目标序列的结合力，减少非特异性扩增产物的形成。
同时，适当的退火温度可以提高扩增效率，加快PCR 反应的速度。
总之，引物退火温度在同源重组PCR反应中起着至关重要的作用。
合理选择引物退火温度可以提高反应的特异性和扩增效率，为基因工程和生命科学研究提供有力的技术支持。
1.2文章结构文章结构指的是文章的整体框架和组织方式。
在本文中，我们将遵循以下结构来撰写和组织文章内容：1) 引言部分:a. 概述：介绍同源重组PCR的基本原理和应用背景；b. 文章结构：说明本文的整体组织结构和各个章节的内容；c. 目的：明确文章的研究目标和意义。
2) 正文部分：a. 同源重组PCR引物的意义：介绍同源重组PCR引物在相关研究领域的重要性和作用；b. 引物退火温度对同源重组PCR反应的影响：探讨引物退火温度在同源重组PCR反应中的作用机制和影响因素。
PCR参数
〔PCR的循环参数〕1、预变性（Initial denaturation）．模板DNA完全变性对PCR能否成功至关重要，一般95℃加热3-5分钟。
2、引物退火（Primer annealing）退火温度一般需要凭实验（经验）决定。
退火温度对PCR的特异性有较大影响。
Tm值(解链温度)=4(G+C)＋2(A+T)复性温度=Tm值-(5～10℃)在Tm值允许范围内，选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性。
复性时间一般为30～60sec，足以使引物与模板之间完全结合。
3、引物延伸引物延伸一般在72℃进行（Taq酶最适温度）。
延伸时间随扩增片段长短而定。
PCR反应的延伸温度一般选择在70～75℃之间，常用温度为72℃，过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。
PCR延伸反应的时间，可根据待扩增片段的长度而定，一般1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min是足够的。
3～4kb的靶序列需3～4min；扩增10Kb需延伸至15min。
延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现。
对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些。
4、循环中的变性步骤循环中一般95℃，30秒足以使各种靶DNA序列完全变性：变性时间过长损害酶活性，过短靶序列变性不彻底，易造成扩增失败。
每完成一个循环需2～4分钟5、循环数大多数PCR含25-35循环，过多易产生非特异扩增。
6、最后延伸在最后一个循环后，反应在72℃维持5-15分钟．使引物延伸完全，并使单链产物退火成双链。
PCR反应的延伸温度一般选择在70～75℃之间，常用温度为72℃，过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。
PCR延伸反应的时间，可根据待扩增片段的长度而定，一般1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min是足够的。
3～4kb的靶序列需3～4min；扩增10Kb需延伸至15min。
延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现。
对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些。
引物设计常见问题与解答
引物设计常见问题与解答先看一下Tm的定义：Tm = Temperature at which 50% of a given oligonucleotide is hybridized to its complementary strand. In the absence of destabilizing agents, like formamide or urea, Tm will depend on 3 major parameters: The sequence: a GC-rich sequence has a higher melting temperature. The strand concentration: high oligonucleotide concentrations favor hybrid formation, which results in a higher melting temperature. The salt concentration: high ionic strength results in a higher Tm as cations stabilize the DNA duplexes.引物设计软件都可以给出Tm，引物长度，碱基组成，引物使用缓冲的离子强度有关。
长度为25mer以下的引物，Tm计算公式为：Tm = 4℃(G + C)+ 2℃(A + T)对于更长的寡聚核苷酸，Tm计算公式为：Tm = 81.5 + 16.6 x Log10[Na+] + 0.41 (%GC) – 600/size公式中，Size = 引物长度。
Tm叫溶解温度（melting temperature, Tm），即是DNA双链溶解所需的温度。
大家可以理解，这个温度是由互补的DNA区域决定的，而不互补的区域对DNA的溶解是没有作用的。
因此，对于引物的Tm，只有和模板互补的区域对Tm才有贡献。
PCR的退火温度选择
熔解温度（Tm）是引物的一个重要参数。
这是当50％的引物和互补序列表现为双链DNA分子时的温度.Tm对于设定PCR退火温度是必需的。
在理想状态下，退火温度足够低，以保证引物同目的序列有效退火，同时还要足够高，以减少非特异性结合。
合理的退火温度从55℃到70℃。
退火温度一般设定比引物的 Tm低5℃。
设定Tm有几种公式。
有的是来源于高盐溶液中的杂交，适用于小于18碱基的引物。
有的是根据GC含量估算Tm。
确定引物Tm最可信的方法是近邻分析法。
这种方法从序列一级结构和相邻碱基的特性预测引物的杂交稳定性。
大部分计算机程序使用近邻分析法。
根据所使用的公式及引物序列的不同，Tm会差异很大。
因为大部分公式提供一个估算的Tm 值，所有退火温度只是一个起始点。
可以通过分析几个逐步提高退火温度的反应以提高特异性。
开始低于估算的Tm5℃，以2℃为增量，逐步提高退火温度。
较高的退火温度会减少引物二聚体和非特异性产物的形成。
为获得最佳结果，两个引物应具有近似的Tm值。
引物对的Tm差异如果超过5℃，就会引物在循环中使用较低的退火温度而表现出明显的错误起始。
如果两个引物Tm不同，将退火温度设定为比最低的Tm低5℃或者为了提高特异性，可以在根据较高Tm设计的退火温度先进行5个循环，然后在根据较低Tm设计的退火温度进行剩余的循环。
这使得在较为严紧的条件下可以获得目的模板的部分拷贝。
当引物长度低于20个bp可以根据Tm=3GC+2AT,对于更长的寡聚核苷酸，Tm计算公式为：Tm = 81.5 + 16.6 x Log10[Na+] + 0.41 (%GC) – 600/size公式中，Size = 引物长度。
退火温度取决于引物长度及序列，GC含量越高退火温度越高，引物的Tm值减去5-8度即是引物的退火温度，引物的Tm值一般都会在引物合成单上体现，如果没有的话可以在网上搜个引物退火温度计算器输入序列就可以了。
退火时间一般都是30秒。
试试下载一个Oligo6.0，这个软件挺不错的，在计算出来的退火温度基础上上下幅度一点是没有什么问题的bioxm2.6 更专业软件很小很方便更能还挺强大我们刚做了PCR实验，当引物长度小于25bp时，退火温度通过（Tm-5）℃计算，Tm=4（G+C）+2（A+T）增加PCR的特异性：1. primers design这是最重要的一步。
Tm值
Tm值就是DNA熔解温度，指把DNA的双螺旋结构降解一半时的温度。
不同序列的DNA，Tm值不同。
DNA中G－C含量越高，Tm值越高，成正比关系。
Tm是PCR引物设计中
一个非常重要的参数.是指引物与模板之间精确互补并且在模板过量的情况下有50%的引物与模板配对,而另外50%的引物处于解离状态时的温度,Tm值一般高于55度,,设计引物时要注意使两个引物的Tm值相近,否则两个引物不能同时达到退火温度,将影响PCR的扩增结
果!!
计算方法
核酸Tm值（解链温度）计算
评价标准是核酸所吸收的光线量达到其所增加吸收260nm光线的量的两倍达到的温度，当核酸达到Tm值时，其260nm吸收量可增加百分之四十（紫外吸收量随解体程度而增加，直至完全解体。
（1）长度为25mer以下的引物，Tm计算公式为：Tm = 4℃(G + C)+ 2℃(A + T)
（2）对于更长的寡聚核苷酸，Tm计算公式为：
Tm = 81.5 + 16.6 x Log10[Na+] + 0.41 (%GC) – 600/size
公式中，Size = 引物长度
影响Tm值的因素：
①DNA碱基组成：C-G含量越多，Tm值越高；A-T含量越多，Tm值越低。
②溶液的离子强度：在低离子强度中，Tm较低，而且解链的温度范围较宽；在高离子强度中，Tm值较高，解链的温度范围较窄。
③PH值：溶液的PH值在5~9范围内，Tm值变化不明显，当PH>11或PH<4时，Tm值变化明显。
④变性剂：各种变性剂主要是干扰碱基堆积力和氢键的形成而降低Tm值。
⑤DNA双链本身的长度。
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引物退火温度与T m值
的关系t m退火温度公
式
Document serial number【UU89WT-UU98YT-UU8CB-UUUT-UUT108】
退火温度与Tm值
①在Tm值允许范围内，选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性。
复性时间一般为30～60sec，足以使引物与模板之间完全结合。
②引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适的温度：
Tm值(解链温度)=4(G+C)+2(A+T)复性温度=Tm值-(5～10℃)
③Tm对于设定pcr退火温度是必需的。
在理想状态下，退火温度足够低，以保证引物同目的序列有效退火，同时还要足够高，以减少非特异性结合。
合理的退火温度从55℃到70℃。
退火温度一般设定比引物的Tm 低5℃。
④引物退火温度
退火温度决定PCR特异性与产量;温度高特异性强，但过高则引物不能与模板牢固结合，DNA扩增效率下降;温度低产量高，但过低可造成引物与模板错配，非特异性产物增加。
一般先由37℃反应条件开始，设置一系列对照反应，以确定某一特定反应的最适退火温度。
也可根据引物的(G+C)%含量进行推测，把握试验的起始点，一般试验中退火温度
Ta(annealing temperature)比扩增引物的融解温度Tm(melting temperature)低5℃，可按公式进行计算：
Ta = Tm - 5℃= 4(G+C)+ 2(A+T) -5℃
其中A，T，G，C分别表示相应碱基的个数。
例如，20个碱基的引物，如果(G+C)%含量为50%时，则Ta的起点可设在55℃。
在典型的引物浓度时(如μmol/L),退火反应数秒即可完成，长时间退火没有必要。