层析分离法
层析分离法
第三章层析分离法1. 主要教学目标：学习和掌握柱色谱、纸色谱和薄层色谱法的原理、技术和应用。
2. 教学方法和手段：采用板书及与多媒体课件相结合，课堂上师生互动，采用启发式和提问式的教学方式，并且课堂上学习的表现记入学生的平时成绩。
3. .教学重点及难点：柱层析及基本理论；纸色谱色谱法又称层析法，是一种广泛应用的分离方法。
色谱分析法是在1906年由俄国植物学家Tsweet首先系统地提出，他将叶绿素的石油醚液流经装有CaCO3的管柱，并继续以石油醚淋洗时，发现由于CaCO3对于叶绿素中各种色素吸咐能力的不同而使它们彼此分离，于是管中出现不同颜色的谱带，如图3─1所示。
图3-1 Tsweet的色谱工作图尤如光谱一样，这样就有可能对它们进行定性分析和定量测定，于是他将这种彩色分层物定义为层析谱，而将这种分析方法称为色谱分析法。
色谱法(Chromatograph)这—名词是由希腊字“Chroniatus”(颜色)和“graphein”(记录)二字合并而成。
并发表了“植物界的色素”专论。
到1931年，Kuhn和Leaerer又成功地适用Tsweet的方法分离了植物的色素，才使这一方法得到公认和广泛应用。
1935年人工合成离子交换树脂后，为离子交换色谱的广泛应用提供了物质基础。
1938年苏联的Izmailo等创立了薄层色谱法，主要是用于药物分析，应用于无机物分析则是50年代末才开始的。
应用于稀土元素的分离是1964年由Pterce开始的。
1941年Martin和Synge首先介绍了分配色谱法，并将蒸馏塔板理论应用于色谱分离中，使色谱方法在理论上向前推进了一步。
1944年Consden，Cordon和Martin首先开始了纸色谱法，Martin和Synge并用此法成功地分离了氨基酸的各种成份，获得1952年的诺贝尔奖。
1947年美国的Boyd和Spedng等人发表一系列论文，报告他们应用离子交换色谱法分离裂变产物和稀土元素混合物的情况。
层析法分离色素的原理
层析法分离色素的原理层析法（Chromatography）是一种分离混合物中组分的物理方法，广泛应用于化学、药学、生物学等领域。
层析法分离色素的原理是基于不同组分具有不同亲和性或分配系数的特点，通过将混合物与固相材料接触，利用不同组分在流动相中的分配行为来实现分离。
层析法分离色素的基本原理可以归纳为以下几个方面：1. 分配系数：混合物中的不同组分在流动相和固定相之间分配的行为是层析法分离的基础。
分配系数是指组分在两相之间的相对亲和性或分配程度，不同组分的分配系数差异决定了它们在层析柱中的迁移速度和分离程度。
2. 固定相的选择：层析柱中的固定相材料通常是吸附剂或离子交换树脂。
吸附层析主要通过组分与吸附剂之间的非共价相互作用实现分离，如氢键、疏水相互作用等。
而离子交换层析则是基于组分通过与固相上的离子交换反应实现分离。
3. 流动相的选择：流动相是层析分离中的另一个重要参数。
它可以是液相（液相层析）或气相（气相色谱）。
流动相的性质和组成对色素的分离效果有重要影响。
通常采用不同极性的溶剂或溶剂混合物作为流动相，以调控组分在固定相上的亲和性。
4. 层析条件的控制：控制层析的条件对色素的分离效果也起着关键作用。
例如，固定相材料的选用、流动相的流速和组成、温度等因素都会影响到分离结果。
通过改变这些条件，可以调节色素组分的迁移速度和相对亲和性，从而实现更好的分离效果。
总的来说，层析法分离色素的原理是基于组分之间的亲和性差异，通过调节固定相和流动相的性质以及层析条件来实现不同色素之间的分离。
这种分离方法在实际应用中具有广泛的适用性和操作简便性，被广泛应用于色素的提纯、定量分析和结构表征等方面。
层析分离法
层析分离法《层析分离法》是一项重要的实验分析技术，它可以用来分离和鉴定物质，这种技术被广泛应用于化学分析领域，被用于分离，鉴定和测定物质的组成成分和反应产物。
种技术已被广泛应用在食品、药品安全检测，环境污染监测以及材料表征等领域，因其分离准确、选择性强以及分析时间短等优点，在分析领域具有重要的地位和价值。
层析分离法的基本原理是利用空间分离原理，将能够在特定空间内运动的物质分离出来。
它的空间分离原理是基于物质不同的流体性能，将物质经过预先混合的流体层，然后在某一特定的体积内分道扬镳，从而实现物质的分离。
析分离技术可以有效地分离物质，使得混合物中的组分被完全分离，这种分离准确度非常高，可以达到99%以上，且可以在实验条件下进行重复性实验，更容易获得准确的结果。
层析分离法的基本工艺流程是：先将原料溶液进行调节，利用离子交换和混合，然后将上述溶液注入层析柱中，利用不同流体在层析柱中的运动特性，分离出混合物中的组分，然后使用检测仪器进行定量或定性分析。
在层析分离法分离鉴定时，可以根据不同分析需要，选取不同的柱材料和溶剂，以实现不同的分离结果。
比如，选择极性分子容易沉淀的柱材料和溶剂，可以有效地实现有机物的选择性分离。
另一方面，将非常稳定的离子溶剂和非极性柱材料结合应用，可以有效地实现无机盐类混合物的分离及鉴定。
层析分离法有一定的局限性，最主要的限制是柱材料的种类有限，而且这种方法只能分离出混合物中较大的分子，而小分子可能无法有效地分离出来。
此外，由于溶剂的不稳定性，柱材料的运动可能会受到影响，导致测定结果的不准确。
总之，层析分离法是一种广泛应用的实验分析技术，它的优点是分离准确、选择性强以及分析时间短，可以用于分离，鉴定和测定物质的组成成分和反应产物。
但是，这种技术也有一定的局限性，比如柱材料种类有限，溶剂的不稳定性等。
所以，在应用层析分离技术时，要根据实际分析需要，综合考虑和选择合适的材料，确保测定的准确性。
五种层析方法和原理
五种层析方法和原理五种层析方法和原理1. 列点 1•新华字典定义：层析方法是一种通过分析物质内部不同成分在不同条件下的分布情况，从而推断物质组成、性质和结构的方法。
•原理：层析方法基于物质成分在固定相和流动相之间的分配行为。
固定相通常是固体或涂覆在固体上的物质，而流动相则是向上或向下流动的溶剂。
2. 列点 2•薄层层析法：–原理：薄层层析法是一种将样品溶解在溶剂中后涂覆在薄层板的表面上，然后通过毛细作用将溶剂上升至薄层表面，样品成分分离的方法。
根据样品成分的亲疏水性质和与固定相的相互作用，不同成分会以不同的速度在薄层板上移动，从而实现分离。
–应用：薄层层析法常用于化学品分析、食品检测和药物分析等领域。
3. 列点 3•气相层析法：–原理：气相层析法是利用气体（流动相）和涂覆在固体或涂覆在固体上的涂层（固定相）之间的分配作用，使样品成分在涂层上分离的方法。
样品经过蒸发后进入气化室，在高温和惰性气体的作用下，样品成分分解为气体状态，然后进入色谱柱，通过不同成分与固定相的相互作用，实现分离。
–应用：气相层析法广泛应用于环境监测、食品安全检测和生物医药领域。
4. 列点 4•液相层析法：–原理：液相层析法是通过溶液中样品成分与固定相之间的相互作用，实现样品分离的方法。
当溶液通过柱子时，样品成分会根据其与固定相的相互作用力的强度和性质不同，在固定相上停留的时间也不同，从而实现分离。
–应用：液相层析法广泛应用于药物分析、食品检测和环境监测等领域。
5. 列点 5•离子交换层析法：–原理：离子交换层析法利用带电粒子（离子）之间的静电相互作用，在一定条件下，使样品中的离子与固定相中的带电粒子发生相互作用，从而实现分离。
不同离子会在不同条件下被吸附或释放，从而实现分离。
–应用：离子交换层析法常用于水质分析、药物分析和环境监测等领域。
通过以上列点方式，我们对五种层析方法的原理和应用作了简要的介绍。
这些层析方法在不同领域的分析和检测中扮演重要角色，为我们获取准确的数据和信息提供了有效手段。
层析分离法的基本原理
层析分离法的基本原理层析分离法，听起来挺高大上的，其实说白了，就是一个分开混合物的聪明办法。
想象一下，咱们在厨房里做饭，油和水总是爱分开，层析分离法就是利用这种原理，把不同的东西分开。
这个方法特别适合那些复杂的混合物，比如药品、食品或者天然产物。
它的原理可以说是相当简单，关键在于不同成分的移动速度不同。
就像咱们走路，穿高跟鞋的和穿运动鞋的，走的速度可是天差地别。
说到层析，就不得不提“固定相”和“流动相”这俩个小伙伴。
固定相就像是站在路边的朋友，牢牢地站在那儿不动；而流动相则像是开着车飞驰而过的你。
在分离的过程中，不同的成分在这两者之间进行“争夺战”。
有些成分喜欢固定相，觉得在那儿待着舒服；有些则更喜欢流动，相当于追逐速度的感觉。
经过一番较量，大家都各自找到自己的位置，最终分开了。
这过程就像是生活中那些有趣的小插曲。
比如说，有的人在聚会里总是抢风头，像是极具存在感的流动相；而有的人则安静地待在角落里，默默地吸引着注意，就像固定相。
层析分离法的美妙之处就在于，这种“争夺战”能够让我们看到原本混杂在一起的成分，瞬间变得井然有序。
说到底，科学就是要把混乱变得条理分明，让我们能够一目了然。
层析分离法有很多种类，像气相层析、液相层析等等。
气相层析就好比你在马路上开车，而液相层析则像是在水上划船。
每种方法都有自己的“个性”，有的快速，有的精细。
气相层析适合一些挥发性较强的物质，就像你在煮水时蒸汽迅速跑出来；液相层析则能处理那些不容易挥发的东西，像是你用水煮的食材，慢慢渗透。
层析分离法的应用可谓是无处不在。
药物分析、环境检测、食品安全等领域都少不了它的身影。
比如说，想知道一块巧克力里到底加了多少可可，层析法就能帮你搞定。
想象一下，咱们吃着巧克力，心里却不知道它的成分，真是吃不安心！而层析分离法的到来，让这一切变得透明，变得明了。
它不仅能帮我们了解成分，还能提高产品的质量。
比如在制药过程中，层析法可以用来提纯药物，确保咱们吃进去的药是安全的。
浅谈层析法分离蛋白质
浅谈凝胶柱层析分离蛋白质根据对生物产物分离工程的学习及所做的相关实验，我对这方面的知识有了粗浅的认识。
根据所学知识我发现生物产物分离的方法多种多样，不同产物其分离方法不同，同种产物又有多种分离方法。
就所做的实验而言，我对层析法分离蛋白比较感兴趣。
以下是我对这种方法的了解：层析法是分离蛋白质通用的方法。
其原理都是通过蛋白质在流动相和固定相之间的性质不同而达到分离的效果。
层析法可分为纸层析法，凝胶过滤层析法，离子交换层析法等。
凝胶过滤层析法最为常用，在分离蛋白质时只需要把蛋白质混合液加到凝胶珠的上部，并加少许洗脱液来产生一定的液压是蛋白质能向下运动，在凝胶柱底部用试管接流下来的蛋白质液体，进行比色。
此种方法很简单，不需要贵重仪器，但分离的蛋白质不是很好，这些液体仍然是很多蛋白质的混合液，通过比色来确定目的蛋白含量的最高值。
这种方法只能对蛋白质进行一些粗筛。
近期做了一个实验应用到了凝胶层析即凝胶柱层析分离蛋白质，这个实验主要是运用凝胶层析分离蓝色葡聚糖2000kb和牛徐清蛋白的。
这个实验应注意：1、装柱时要注意凝胶的流速，不宜过快，同时要保证凝胶能充分的沉淀且分布的比较均匀; 2、凝胶溶胀所用的溶液应与洗脱用的溶液相同，否则由于更换溶剂，凝胶体积会发生变化而影响分离效果; 3、样品的浓度和加样量的多少。
是影响分离效果的重要因素。
样品浓度应适当大，但大分子物质的浓度大时，溶液的黏度也随之变大，会影响分离效果，要兼顾浓度与黏度两方面。
加样量和加样体积越少分离效果越好，加样量一般为柱床体积的1%-2%，制备用量一般为柱床体积的20%-30%；4、凝胶用完后可再加入防腐剂低温保存；5、叠氮钠属于有毒性物质，在使用过程中需注意安全。
凝胶层析法适用于分离和提纯蛋白质、酶、多肽、激素、多糖、核酸类等物质。
分子大小彼此相差25%的样品，只要通过单一凝胶床就可以完全将它们分开。
利用凝胶的分子筛特性，可对这些物质的溶液进行脱盐、浓缩、去热源和脱色。
第四章液相层析分离法
Ｂ．点样方法
a先用铅笔在距纸条一端2 ~ 3 cm处划一条直线（ 起始线）并在线上隔一定距离划一“x”号表示点 样位置；见下示意图：
b.点样工具：微量注射器、毛细滴管（Φ＝0.5 mm) ； c.点样方法：用点样工具吸取试液轻轻与“x”号 接触，使点样的斑点直径为0.2 ~ 0.5 cm, 每次点 样2 ~ 20 μl于滤纸上，以冷风吹干；
[定义]:
Rf的计算
Rf的大小取决于溶质在二相间的分配系数 及滤纸的性质. 不同的组分具有不同的分 配系数, 因而也就有不同的Rf. 这就是定 性的依据.
3. 影响Rf的因素
(1). 欲分离物的本性:物质在两相的分配系 数,决定了它的Rf大小;
(2). 层析溶剂:同一组分在不同溶剂中Rf不同。 通常应选这样的层析剂，使溶质的Rf在0.05 0.85之间,不同组分的Rf差值>0.05.
吸水性( 30min 灰分 内水上升mm) g /m2
150 ~ 120 0.08 120 ~ 90 0.08 90 ~ 60 0.08 151 ~ 121 0.08 120 ~ 90 0.08 90 ~ 60 0.08
性能 快速 中速 慢速 快速 中速 慢速
C. 滤纸的处理 以0.1 ~ 0.4 mol/L HCl (或 2 mol/L HAc)浸
量关系；若以F为纵坐标、C为横坐标，则可得
一截踞为2的直线，斜率为K。
1 2 3 4
1－长颈漏斗， 2－滤纸， 3－垫板， 4－抽滤瓶
PC M M s
图1. 反射散射附件的光路示意图 M: 反射镜; S: 样品: PC: 光电管
F. 应用
例１．氨基酸的分离（固定相为水）
流动相
分离情况
正丁醇：2 mol/L HAc 酪氨酸、二碘酪氨酸 =1:1
层析法分离蛋白质的原理
层析法分离蛋白质的原理你知道吗？蛋白质那可是生命的重要组成部分呢！而层析法就是分离蛋白质的一把好手。
咱先来说说层析法到底是咋回事。
想象一下，蛋白质就像是一群性格各异的小伙伴，它们都想找到自己的专属领地。
层析法呢，就像是一个神奇的大舞台，给这些小伙伴们提供了展示自己的机会。
在层析过程中，有一根柱子，这柱子就像是一个神秘的通道。
蛋白质们从通道的一端进入，开始了它们的冒险之旅。
不同的蛋白质有着不同的特点，就像不同的人有不同的性格一样。
有些蛋白质跑得快，有些跑得慢；有些喜欢往高处走，有些则喜欢在低处徘徊。
那为啥蛋白质们会有不同的表现呢？这就得说说层析法的原理啦。
就好比在一场赛跑中，有的选手身轻如燕，跑得飞快；有的选手则比较笨重，跑得慢些。
蛋白质也一样，它们的大小、形状、电荷等特性决定了它们在层析柱中的运动速度和方向。
比如说，凝胶过滤层析就像是一个筛子。
大的蛋白质过不去那些小孔，只能在外面溜达，所以跑得快；小的蛋白质则能钻进小孔里，东逛逛西逛逛，就跑得慢啦。
这不就像我们走路一样吗？走大路肯定比走小路快呀！离子交换层析呢，则是根据蛋白质的电荷来分离它们。
带正电荷的蛋白质会被吸附在带负电荷的柱子上，带负电荷的蛋白质则会被吸附在带正电荷的柱子上。
这就好像磁铁的两极，同性相斥，异性相吸。
你想想，要是两个脾气不对付的人，肯定不愿意待在一起吧？蛋白质也是这样呢。
还有亲和层析，这就更有意思啦。
它就像是一个专门为蛋白质准备的相亲大会。
柱子上有一些特定的配体，只有那些和配体“看对眼”的蛋白质才会被吸附住。
其他的蛋白质呢，就只能继续往前走啦。
这就像我们找对象一样，得有感觉才行呀！总之，层析法分离蛋白质的原理就是利用蛋白质的不同特性，让它们在不同的条件下表现出不同的行为，从而实现分离。
是不是很神奇呢？下次你再看到蛋白质的时候，会不会想起这个神奇的层析法呢？说不定你还能想象出蛋白质们在层析柱里的冒险故事呢！。
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亲和色谱
聚焦色谱
按实验技术分类 低压（小于0.5 Mpa) 中压 (0.5-5 Mpa) 高压 (5-40 Mpa) 电泳 (溶质在电场中移动）
根据固定相形状分类 柱层析、纸层析、薄层层析 根据流动相分类 气相层析、液相层析、超临界流体层析
按制备规格
⑴分析色谱（10mg） ⑵半制备色谱(10-50mg) ⑶制备色谱(0.1-1g) ⑷工业生产规模色谱(>20g/d)
层析材料的准备: 装柱前用溶剂平衡 凝胶层析材料：溶胀 吸附剂：加热或酸处理 离子交换剂：：酸碱处理
在用溶剂平衡时，先使材料沉淀，用倾 泻法除去悬浮的细颗粒，否则由于细颗粒 的堵塞，溶剂的流速将显著降低。
装柱
调糊：50%（缓冲液＋介质）
一次连续加入悬胶液，避免分层 打开出口阀：层析剂沉降
梯度洗脱
0.7 0.6 0.6 0.5
Protein（ mg/ml)
Protein NaCl 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 0 40 80 120
Volume (ml)
0.4 0.3 0.2 0.1 0 160 200 240
NaCl (mol/L)
部分收集
部分收集器：使每管按预定时间或滴数收集 流出液，然后自动移位，下一管再继续收 集。每一部分的蛋白质或核酸的含量可以 让流出液通过一个流动小室测定其280 nm或 260 nm的光吸收来进行连续监测。
纤维素
β -1,4 相连的D-G线性天然高聚物 （1）亲水 （2）微晶与无定型两部分组成，缺乏孔度
应用：离子交换分离蛋白质介质
聚丙烯酰胺
性质： （1）丙烯酰胺与交联剂N, N’-甲叉双丙烯酰 胺共聚 （2）控制交联剂比例可控制网格孔度 （3）亲水性不如多糖介质 （4）机械强度差 应用：凝胶过滤，电泳
层析装置与操作
装置
泵 混合器 层析柱 检测器 记录仪 分部收集器
层析柱
混合泵 蠕动泵 磁力搅拌器
分光光度计
酶试剂 紫外检测器
P-5
酶活性 双笔记录仪 部分收集器
紫外吸收
柱层析分离法的有关装置
柱操作 （1）装柱 （3）上样 （5）洗脱
（2）平衡 （4）洗涤 （6）清洗
（7）再生
清洗与再生
弱酸：HAC 碱：氨水 促溶剂：1-3M KCNS， 6-8 M 尿素，6 M盐酸胍 极性溶剂：20% 乙醇 表面活性剂 缓冲液平衡
亲和层析
亲和层析：利用生物体内存在的特异性相互 作用的分子对而设计的层析方法。 (1) (2) (3) (4) (5) 酶—底物或抑制剂 抗原—抗体。 激素—受体。 糖蛋白与凝集素, 生物素—生物素结合蛋白等
0 0 40 80 120 Elution (ml) 160 200 240
0
NaCl (mol/L)
分步洗脱
0.8 Protein
Protein (mg/ml)
NaCl
0.4
0.6
0.3
NaCl (mol/L)
0.4
0.2
0.2
0.1
0 0 40 80 120
Volume (ml)
0 160 200 240
1941
1952
Martin, Synge
Martin, James
提出色谱塔板理论；发明液-液分配色谱；预言了气体可作 为流动相（即气相色谱）。
从理论和实践方面完善了气-液分配色谱法。
1956
1957 1958 1965 1975 1981
Van Deemter
Golay Giddings Small Jorgenson
分类 特细孔硅胶 (0.8nm以下) 细孔硅胶（1.5—2.0nm ) 中孔硅胶 (4.0一5.0nm) 粗孔硅胶 (10.nm以上)
应用：优先吸附极性分子及不饱和的碳氢化合物
琼脂糖
由海洋生物琼脂提取得到的主要成分 ①中性不带电 ②水溶性线状多糖 ③高亲水性，含大量羟基 ④能制成多孔性凝胶，分离大分子
分配色谱
溶质在固定相和流 分辨力高，重 影响因子多， 用于各种生物 动相中分配系数的 复性较好，能 上样量太小 大 分 子 的 分 析 差异 分离微量物质 鉴定 亲和色谱生物大分 分辨力很高 子与配体之间有特 殊亲和力 等电点和离子交换 分辨力高 作用 一种配体只 各 种 生 物 大 分 能用于一种 子 生物大分子， 局限性大 进口试制昂 蛋白质和酶 贵
B 环氧氯丙烷 （1）形成的共价键稳定,配基不易落脱 （2）自动引入手臂 （3）有更小的非特异性吸附, （4）活化操作简单易行,危险性相对较小 缺点：强碱性条件反应。
环氧氯丙烷活化反应式
环氧基的氨化及偶联配基反应
C 对甲苯磺酰氯活化 （1）用于含羟基基质,将羟基转化为磺酰基, （2）形成稳定化学键。 （3）在无水丙酮环境中进行。偶联配基在有 机相或水相中进行
色层分离法基本原理
分子筛层析示意图
t0
t0
t1
t0
t1
t2
t0
t1
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
t2
t3
分子量： >
>
层析的发展史
年代 发明者 发明的色谱方法或重要应用
1906
1931 1938
Tswett
Kuhn, Lederer Taylor Uray
用碳酸钙作吸附剂分离植物色素。最先提出色谱概念
用氧化铝和碳酸钙分离a-、b-和g-胡萝卜素。使色谱法开始 为人们所重视。 用离子交换色谱法分离了锂和钾的同位素。
制备： （1）去除带电琼胶成分 （2）将溶化的琼脂糖采用悬浮,乳化等方法制得 珠状介质。 （3）采用交联剂增加介质的机械强度
商品种类
Sepharose 2B分离范围:70,000-40 ×106 , Sepharose 4B分离范围：60,000-20 ×106 , Sepharose 6B分离范围（球蛋白）：
10000-4×10 6 颗粒大小：40-165um:最高流速14cm/h 。
经过交联而增加机械强度的琼脂糖 Sepharose CL-2B, Sepharose CL-4B, Sepharose CL-6B 应用 ：水溶液中分离蛋白质
葡聚糖
α -1,6 相连的G聚合物，环氧氯丙烷交联 性质： （1）亲水性比琼脂糖高（羟基数多） （2）化学稳定性及热稳定性好 （3）孔度与机械强度与交联度有关 （4）用于凝胶过滤 应用：水溶液中分离蛋白质等
层析分离法
色谱法(chromatography)——以试样组分在固定
相和流动相间的溶解、吸附、分配、离子交换或其他 亲和作用的差异为依据而建立起来的各种分离分析方 法。
特点： （1） 纯化倍数高 （2） 操作规模小，放大困难 （3） 终产品纯化 （4） 适用于价格昂贵的产品
色层分离法基本原理
基本概念
分配系数； 解离常数； 分离因素； 阻滞因子； 溶出体积 ； 分辨率 ； 溶量因子
基本概念
（1）分配系数：溶质在固定相与流动相浓度比值 （2）解离常数：有效结合位子浓度与溶质在液相的浓度乘积与 溶质在固相中的浓度比值 （3）分离因素：某一瞬间被吸附溶质量占总量的分数 (4) 阻滞因子：分配层析溶质移动速度（距离）与 流动相移动速度（距离）比值
排除空气：沿着玻棒倾注 检查均匀度
关闭出口→用溶剂灌注至1／3体 积→加浆状物→放出过多溶剂 如二次填装，应先在已经沉淀 的表面用玻棒搅拌后再倾注。
用溶剂彻底洗涤层析 柱后使液面降到比层 析床表面略高一点。
上样
样品处理： (1）溶解 A 调整浓度：减少样品溶液体积，使区带狭窄 B 盐 C pH (2) 过滤：除去不溶物 流速：根据样品浓度与吸附速度而定 上样量：80%吸附容量
淋洗（去除残留在介质中的杂质）
盐浓度 pH 表面活性剂（0.1-0.5%) 淋洗体积：根据流出液杂蛋白浓度而定 防止产物丢失又要除去杂质
洗脱方法
按操作方式 a 恒定洗脱 (isocratic elution) b 分步洗脱 (stage elution) c 梯度洗脱 (gradient elution) 逐渐改变溶剂的性质，形成一个离子强 度、pH或极性的递增梯度从而使各组分依次 被洗脱 优点：减少拖尾现象
同种组分的分子分布离散(sepreading)：
入口处组分分布在一狭窄区带内，随着分子在柱
内迁移，分布区带不断展宽，同组分分子迁移速度出 现差异，主要是因为流体分子运动的速率差异造成， 不是平衡分布不同引起。
层析介质
要求： （1）不溶于流动相 （2）化学稳定 （3）机械强度 （4）大的表面积 （5）粒度均匀 种类： 无机（氧化铝，硅胶，活性碳） 有机（琼脂糖，纤维素，聚丙烯酰胺）
(5) 洗脱（容积）溶出体积 ： 在柱色层分离中，使溶质从柱中流出时所通过的 流动相体积 (6) 分辨率 ：两峰之间的距离与两峰宽的平均值之比 (7) 溶量因子： 固定相中溶质总量与流动相中溶质总量之比
色谱体系中样品运行特点
不同组分的差速迁移(differential migration):
混合物各组分在两相分配系数不同，分配系数大 的迁移速度慢，使同时进入色谱柱的各组分得以分离。
按洗脱机理 专一性洗脱（specific elution） 非专一性洗脱（nonspecific elution） 添加剂：乙二醇, NaCNS 、脲素、盐酸胍 洗脱体积：5倍床体积