第四章液相层析分离法详解
液相色谱分离过程
液相色谱分离过程液相色谱是一种基于物质分配行为的分离技术，适用于需要高分离度和高灵敏度的生化分析和制药工业。
液相色谱分离过程可以分为样品预处理、样品进样、分离柱、检测器、数据处理等几个部分。
1. 样品预处理：在进行液相色谱分离之前，需要对样品进行预处理。
预处理过程中可以通过固相抽提、离心、滤过、稀释等方法去除浊物和杂质，并将目标化合物纯化和浓缩至所需的浓度。
2. 样品进样：样品需要经过自动或手动进样器进入分离柱。
通常使用自动进样器，它可以精确控制样品的体积和时间，并且能够进行多次连续进样，提高检测灵敏度。
3. 分离柱：分离柱是液相色谱分离的核心部分，通过填充材料将化合物分子分离。
填料材料通常为高分子质量为1000至4000的微小颗粒，具有均匀的孔隙结构和高比表面积。
填充材料的选择可以根据不同的分离目的进行，例如反向相色谱、离子交换色谱和尺寸排除色谱等。
4. 检测器：分离柱后的化合物需要经过检测器检测，通常使用紫外光检测器或荧光检测器。
紫外光检测器通过测量物质吸收或发射的紫外线信号来检测化合物，荧光检测器则测量化合物的荧光信号。
其他的检测器如质谱检测器、电化学检测器和折射率检测器等也可以用于液相色谱分离。
5. 数据处理：液相色谱分离产生的信号需要进行处理和解释。
数据处理可以通过计算机软件进行，以获取化合物的保留时间、峰面积和峰高度等数据。
这些数据可以用于定量分析和质量控制，比如确定化合物浓度和出现异常峰的原因等。
液相色谱分离过程是一个复杂的过程，需要根据实际需求进行优化和改进。
随着科技的不断发展，液相色谱分离技术将会逐渐成熟，并且在生命科学、制药和环境监测等领域中得到广泛应用。
层析分离技术
4.2 吸附层析
吸附层析（Adsorption Chromatography ）是以吸附剂 为固定相，根据待分离物与吸附剂之间吸附力不同而 达到分离目的的一种层析技术。
按吸附剂和吸附物之间的作用力不同，吸附可分为三 种类型： 物理吸附：范德华力，吸附解吸速度快，选择性较差 化学吸附：生成化学键，达到平衡慢，选择性较好 交换吸附：极性分子或离子之间发生交换吸附…….
的活性物质提取分离，如维生素B12、四环素、土霉 素等，还可用于污水处理、糖浆脱色等。
大孔吸附树脂的选择和使用
选择依据： 吸附剂及吸附物的极性
一般来说，非极性吸附剂易从极性溶剂中吸附非极性 物质；极性吸附剂易从非极性溶剂中吸附极性物质； 中等极性的吸附剂对上述两种情况都具有吸附能力。 吸附物质的大小 吸附物分子较大的，应选择大孔树脂中孔径大的。
常用吸附剂按其化学结构可分两类
有机吸附剂，如：活性炭、纤维素、大孔吸附 树脂、聚酰胺等
无机吸附剂，如：硅胶、氧化铝、硅酸镁、硅 藻土、羟基磷灰石等
常用吸附剂简介
硅胶 是一种极性吸附剂，又是一种弱酸性阳离子交换
剂，其表面上的硅醇基能释放弱酸性的氢离子， 遇较强碱性化合物，则可因离子交换反应而吸附 碱性化合物； 应用于萜类、固醇、生物碱、酸性化合物、磷脂、 脂肪、氨基酸等的吸附分离。
HA的吸附机理
HA机理的主要观点是：HA的Ca2+和生物分子表 面的负电荷基团的结合，对生物分子的分离起重 要作用；而HA的磷酸基团与生物分子表面的正 电荷基团的结合，则起次要作用。
大孔吸附树脂
特点 大孔型颗粒，其孔隙、骨架结构和极性可按需要选
高效液相层析
c.液 —液分配色谱法的缺点：尽管流动相与固定相的极性要求完全不同，但固定液在流动相中仍有微量溶 解；流动相通过色谱柱时的机械冲击力，会造成固定液流失。上世纪70年代末发展的化学键合固定相（见后）， 可克服上述缺点。应用很广泛（70~80%）。
近来研究出许多新型固定相，使分离效率大大提高。
高效液相色谱已广泛采用高灵敏度的检测器，进一步提高了分析的灵敏度。如荧光检测器灵敏度可达10-11g。 另外，用样量小，一般几个微升。
气相色谱法与高效液相色谱法的比较：气相色谱法虽具有分离能力好，灵敏度高，分析速度快，操作方便等 优点，但是受技术条件的限制，沸点太高的物质或热稳定性差的物质都难于应用气相色谱法进行分析。而高效液 相色谱法，只要求试样能制成溶液，而不需要气化，因此不受试样挥发性的限制。对于高沸点、热稳定性差、相 对分子量大（大于 400以上）的有机物（这些物质几乎占有机物总数的 75% ～ 80% ）原则上都可应用高效液相 色谱法来进行分离、分析。据统计，在已知化合物中，能用气相色谱分析的约占20%，而能用液相色谱分析的约 占70～80%。
特点
1
高压
2
高速
3
高效
4
高灵敏度
5
适应范围宽
液相色谱法以液体为流动相（称为载液），液体流经色谱柱，受到阻力较大，为了迅速地通过色谱柱，必须 对载液施加高压。一般可达150～3.5万KPa。
流动相在柱内的流速较经典色谱快得多，一般可达1～10ml/min。高效液相色谱法所需的分析时间较之经典 液相色谱法少得多，一般少于 1h。
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生物发酵产物的分离与提纯
生物发酵产物的分离与提纯随着科技的不断发展，生物技术的应用越来越广泛。
生物发酵工艺是一种将微生物用于工业生产的方法，它可以大规模合成各种有机物、制备药品、食品、饲料及化工产品。
但是，在面对液态发酵产物或者分离纯化复杂混合物时，我们不得不面对一些分离提纯的困难。
因此，如何有效地分离提纯生物发酵产物成为了一个值得研究的问题。
一、分离生物发酵产物的方法基本上，生物发酵产物分离的方法可以分为两类：物理方法和化学方法。
1、物理方法物理方法是指利用产物的物理性质（如电性质、磁性质、温度等）进行分离提纯的方法。
（1）过滤分离法过滤是通过将混合物通过限制孔径大小的分离膜，进行分离提纯的方法。
其主要适用于固态物质的分离。
（2）离心分离法离心分离是将混合物置于离心机内，通过离心作用把混合物分离开的方法。
其主要适用于分离液态或半固态物质。
（3）蒸馏分离法蒸馏分离法是将混合物加热到沸腾，利用不同物质在不同温度下的沸点差异，把混合物组分分离开来。
2、化学方法化学方法是指通过对混合物中的分子进行化学改变，使得分离成分发生变化而达到分离提纯的目的。
（1）沉淀法沉淀是指通过化学反应，在混合物中加入一定的物质，使得其产生不相溶的固体颗粒沉淀下来。
沉淀可以通过离心或者过滤的方法进行分离提纯。
（2）萃取法萃取法是指通过溶剂把混合物中想要提取的成分萃取出来。
（3）层析分离法层析分离法是指将混合液置于吸附剂上，通过对吸附剂的选择和操作条件的调节来实现分离。
二、生物发酵产物的提纯方法生物发酵产物的提纯方法主要有以下几种：1、压力液相色谱技术压力液相色谱技术是一种基于分子大小、化学性质、电荷和亲和力的分离技术，其操作简单，分离效果好，且提纯效率高，成本较低。
该技术可以用于分离和提纯各种生物发酵产物，如蛋白质、荷尔蒙和抗生素等。
2、凝胶过滤法凝胶过滤法通过将混合物置于凝胶中，通过物质分子大小的差异实现分离。
它可以分离和提纯各种生物分子，如DNA、RNA、酶和蛋白质等，但是对大分子的分离效果不佳。
液相色谱分离过程
液相色谱分离过程
液相色谱（LiquidChromatography，简称LC）是一种基于化学
分子间相互作用和物理化学性质差异的分离方法。
液相色谱的分离原理是在固定相和液相的作用下，溶液中的物质在固定相表面上被吸附、分离、吸附和洗脱。
液相色谱的分离过程可以分为样品进样、流动相进样、固定相吸附、洗脱和检测几个步骤。
首先，待分离物质被进样器吸入，随后被送入流动相中。
流动相通过固定相时，待分离物质会在固定相表面进行吸附，然后通过不同的洗脱条件，把吸附在固定相上的不同成分分离开来。
最后，各组分被检测器检测出来。
液相色谱的分离过程主要受到以下因素的影响：
1. 流动相的选择：流动相的性质直接影响着样品的分离情况。
因此，在选择流动相的时候，需要考虑样品的特性和分离条件。
2. 固定相的选择：固定相的特性决定了分离过程中样品在固定
相表面的吸附情况。
不同的固定相会对不同的样品产生不同的分离效果。
3. 洗脱条件的选择：洗脱条件的选择会直接影响各组分的分离
效果。
总的来说，液相色谱的分离过程是一个复杂的过程，需要综合考虑多种因素。
在实际应用中，可以通过调节流动相、固定相和洗脱条件等参数，来实现对待分离物质的高效分离。
- 1 -。
高效液相层析法及其在生化研究中的应用
02 高效液相层析法实验技术
样品前处理方法
提取法
利用相似相溶原理，将目标化合物从样品基质中提取出来。
沉淀法
通过加入沉淀剂，使杂质沉淀下来，达到分离目标化合物的目的。
衍生化法
对目标化合物进行化学修饰，引入易于检测或分离的基团。
色谱柱选择与使用技巧
硅胶柱
适用于非极性和中等极性化合物的分离。
混合模式柱
行业标准制定需求
统一实验方法和操作规范
制定统一的实验方法和操作规范，保证不同 实验室之间数据的可比性和准确性。
标准化样品制备和处理流程
建立标准化的样品制备和处理流程，减少人为操作 误差，提高实验结果的可靠性。
质量控制和质量评价标准
制定严格的质量控制和质量评价标准，确保 高效液相层析法在生化研究中的准确性和可 靠性。
临床医学
用于疾病标志物检测、诊断试剂研发和临床 治疗效果评价等。
生物技术
支持基因工程产品、细胞培养产物和生物酶 等的分离纯化及分析。
04 实验操作注意事项与问题 解决方案
实验操作规范及安全注意事项
严格遵守实验室规章制度，确 保实验环境安全、整洁。
操作前仔细阅读仪器说明书， 了解仪器性能和使用方法。
高效液相层析法及其在生化研究中 的应用
目录
• 高效液相层析法简介 • 高效液相层析法实验技术 • 生化研究中应用案例分析 • 实验操作注意事项与问题解决方案 • 未来发展趋势和挑战
01 高效液相层析法简介
定义与原理
定义
高效液相层析法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）是一种高效、快速的分离和分析技 术，利用不同物质在固定相和流动相之间的分配系数差异进行 分离。
微生物技术应用：第四章 微生物发酵产物的分离与纯化
三、分离纯化方法的综合运用与工艺优化
应作好工序间的衔接工作，从加工产物质量、 产物收率与纯度的平衡、时间与经济性等角度出 发，对影响工艺流程整体纯化效果的加工条件进 行优化：
1 收率与纯度之间的平衡 2 经济性考虑 3 工艺放大 4 纯化过程中对产品的检测
1 收率与纯度之间的平衡
发酵产品有效成分分离纯化过程中，产品的 纯度与产率之间是一对矛盾的关系。比如，微生 物发酵产物为药品时，其有效成分的纯度是衡量 其质量优劣的重要指标，特别是非肠道药物，其 纯度的高低直接关乎用药的安全性。纯化产品产 率的提高往往伴随着纯度的下降，反之对产品纯 度要求的提高意味着纯化成本的提高和产物收率 的降低。
微生物发酵产物的分离纯化
第二节 分离纯化技术
一、细胞破碎技术 二、沉淀分离纯化技术 三、离心分离纯化技术 四、膜分离纯化技术 五、层析分离纯化技术 六、萃取技术 七、冷冻干燥技术
第二节 分离纯化技术
一、细胞破碎技术
（一）发酵液的预处理和固液分离 目的：分离菌体和其他悬浮颗粒(细胞碎片、核 酸和蛋白质的沉淀物)；除去部分可溶性杂质和 改变滤液性质，以利于提取和精制的顺利进行。 方法：高价无机离子的去除方法，杂蛋白质的去 除，发酵液的凝聚和絮凝。
一、建立分离纯化工艺的根据
1.微生物发酵产物的特点
➢另一个特点是欲提取的生物物质通常很不 稳定，遇热、极端pH、有机溶剂会引起失 活或分解。
➢发酵或培养都是分批操作、生物变异性大， 各批发酵液不尽相同，要求下游加工有一 定的弹性。
一、建立分离纯化工艺的根据
2.原理
（1）物理性质 ① 力学性质：重力、离心力、筛分； ② 热力学性质：状态变化、相平衡； ③ 传质性质：粘度、扩散、热扩散； ④ 电磁性质：电泳、电渗析、磁化；
液相色谱法知识点详解
2.纸色谱法（paper chromatography）
纸色谱法是利用滤纸作固定液的载体， 把试样点在滤纸上， 然后用溶剂展开，各 组分在滤纸的不同位 置以斑点形式显现， 根据滤纸上斑点位置 及大小进行定性和定 量分析。
1.吸附色谱法 ( adsorption chromatography )
利用吸附剂表面对不同组分物理吸附 性能的差别而使之分离的色谱法称为吸附 色谱法。
2.分配色谱法 ( partition chromatography )
利用固定液对不同组分分配性能的差别 而使之分离的色谱法称为分配色谱法。
§2 气相色谱的基本理论
容量因子k决定于组分及固定相的热力学性质
，随柱温、柱压的变化而变化，还与流动相
及固定相的体积有关。 分配系数比(α):
k K Vs Vm
K2 k2 t'R2
K1 k1 t'R1
t’R2≠t’R1是混合物分离的首要条件
小结：
（1）色谱条件一定时，K或k值越大 ，则组分的保留值也越大。
（2） 两个组分的K或 k值相等，
基线宽度Wb=4
色谱流出曲线的意义
由色谱流出曲线可以实现以下目的：
（1）根据色谱峰的数目，可以判断试样中 所含组分的最少个数。
（2）根据色谱峰的保留值进行定性分析。 （3）依据色谱峰的面积或峰高进行定量分
析。
（4）依据色谱峰的保留值以及峰宽评价色 谱柱的分离效能。
7、分配系数和容量因子
1. 分配系数（distribution coefficient）
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C. 滤纸的处理
以0.1 ~ 0.4 mol/L HCl (或 2 mol/L HAc)浸 泡数小时, 除去无机杂质后, 取出用蒸馏水 洗净, 再将滤纸放在丙酮-乙醇( 1 : 1 )中浸泡
一周时间, 除去有机杂质, 再取出风干备用.
固定相 纸层析－以吸着在纤维素上的水作固定相。 反相纸层析－用甲酰胺、二甲基甲酰胺、丙 二醇等作固定相。 若分离芳香油等非极性物，以石蜡油、硅油 作固定相。
若前后二次展 开剂选择适当， 可使各种组份完 全分离。例如， 氨基酸的分离可 用此法。双向展 开法也可以二次 使用同一种展开 剂展层。
D. 显色
展层后，将滤纸从层析缸中取出，用铅笔在溶剂 前沿作记号 a. 有色物：直接观察各个色斑 b. 无色物： 物理法显色：用紫外灯照，观察有无吸收或发 出各种不同颜色的荧光斑点，并用铅笔画下斑 点的位置及大小。
(2). 试样 A.试样的溶解 尽量避免用水。一般用乙醇、丙 酮、氯仿等，最好采用与展开剂极性相似的溶剂。 液体样，直接点样。
Ｂ．点样方法 a先用铅笔在距纸条一端2 ~ 3 cm处划一条直线（ 起始线）并在线上隔一定距离划一“x”号表示点 样位置；见下示意图：
b.点样工具：微量注射器、毛细滴管（Φ＝0.5 mm) ； c.点样方法：用点样工具吸取试液轻轻与“x”号
y
x
y
x
Rf的计算
Rf的大小取决于溶质在二相间的分配系数 及滤纸的性质. 不同的组分具有不同的分
配系数, 因而也就有不同的Rf. 这就是定
性的依据. 3. 影响Rf的因素 (1). 欲分离物的本性:物质在两相的分配系 数,决定了它的Rf大小;
(2). 层析溶剂:同一组分在不同溶剂中Rf不同。
通常应选这样的层析剂，使溶质的Rf在0.05 0.85之间,不同组分的Rf差值>0.05.
接触，使点样的斑点直径为0.2 ~ 0.5 cm, 每次点
样2 ~ 20 μl于滤纸上，以冷风吹干； d. 干后，将纸的两边用线缝好，以圆筒形式置于 层析缸中展开。
C. 展开
a. 展开剂
展开剂的选择：
欲分离物在两相中的溶解度；
展开剂的极性
展开剂与欲分离物间应无化学反应
欲分离物在展开剂中的分配系数最好不受温 度的影响 欲分离物在两相间的分配平衡瞬间达到
能不断地上升而挥发，
展层过程就自动连续
地进行；
c.
若溶剂沸点＞100oC，则可在纸条暴露部分 用红外灯烘烤，促使溶剂挥发；
d. 该法不能测量前沿，但可达分离的目的。
b.下行法
溶剂自纸的上端向下降（借助于重力的作用）， 具有分离速度快及连续挥发色谱的优点。
玻片 玻璃棒
原点
玻皿 剪成锯齿状，便于溶剂滴下
a. 上行法
将点有试样的滤纸条的 下端浸入溶剂（但不能浸没 点样处）上端固定在层析缸 的上部，保持垂直，将缸密 闭，使溶剂沿下端上升而展 层。待溶液上升到距离纸上
端3 ~ 4 cm 时，将滤纸取出，
用铅笔在溶剂前沿处画线作
记号（见右图）
对于 Rf 十分接近的物质可采取连续挥发的ห้องสมุดไป่ตู้谱法 a. 纸条的上端暴露在 层析缸外，以便令 上升的溶剂挥发； b. 只要保持纸条下端与 溶剂面接触，溶剂便
第四章 液相层析分离法
—层析法又称色层法
19世纪中叶已有人做过这 样或那样的色层分离实验,但系
统地研究和介绍色层分离法的,
一般公认最早的为波兰植物学 家M•茨维特。
按流动相分类
按原理分类
纸色层：滤纸吸附的水作固定相，有机溶剂作流 动相。
薄层色谱：把吸附剂粉末舖成薄层作为固定相。
本章仅讨论纸色层、薄层色谱法。
(3). pH:影响它们的存在状态
(4). 滤纸:质地均一、厚薄适当、具有一定机
械强度、不含杂质
(5). 温度:在层析缸中用红外灯照射。温度 会影响溶质的分配系数及流动相的扩散速度。 层析操作应在恒温下进行，温度不超过± 0.5oC (6). 展开方式:展开方式不同,Rf也不同。下 行法的Rf最大，上行法的Rf较小，环行法的 Rf 也不大。
第一节、纸色层
微量操作技术，简、分离效率高、但 分离速度慢 １、基本原理 纸色层－纸上萃取色谱，它和萃取一 样，它也是根据不同物质在两相间的分配 比不同而进行分离的（相当于逆流萃取）。
1 2 6
5
1.层析缸
2.滤纸
7 3 4 3
3.原点 4.展开剂 5.前沿 6.7.斑点
2. 比移值Rf 组份分离后,它们在滤纸上的 位置用比移值Rf表示. [定义]:
c.环行法
又叫径向色谱法。这是一种既快又方便的方法。取一张圆形 滤纸在直径的两边各画两根平行线，用剪刀沿这两根线剪至圆 心处，在纸的中央滴上试液，干后，将滤纸夹在两个大小相同 培养皿之间，使剪开的纸条的尾端浸入流动相。
d. 双向展开法
有时用一种溶剂不能将样品中组份分开时，可以试用双向展 开法。该法是用正方形或长方形滤纸，在纸的一角上点样，先用 一种展开剂朝一个方向展开，展开完毕，待溶剂挥发后，再用另 一种展开剂朝与原来垂直的方向进行第二次展层。
4. 操作技术 (1). 滤纸(担体) Ａ．滤纸的选择
a. 要求滤纸质地均匀、平整无折痕边缘整齐
b. 要求滤纸的纤维松紧适宜 c. 滤纸的杂质含量少
B. 层析滤纸的性能与规格
型 标重 厚度 吸水性( 30min 号 g /m2 (mm) 内水上升mm) 1 90 0.17 150 ~ 120 2 90 0.16 120 ~ 90 3 90 0.15 90 ~ 60 4 180 0,34 151 ~ 121 5 180 0.32 120 ~ 90 6 180 0.30 90 ~ 60 灰分 g /m2 0.08 0.08 0.08 0.08 0.08 0.08
展开剂
水饱和的正丁醇、正戊醇、酚、四氯化碳、 氯仿、苯、丁酮、丙酮、有机酸、有机碱，有时 也加入一定比例的无机酸、无机碱、甲醇、乙醇 等 b.展层方法：展层前，层析缸与已点样滤纸必须 予先经水蒸汽、溶剂蒸气饱和。方法：将溶剂和 水置于分液漏斗中充分振荡，分层后，将水层放 入小烧杯内，置于层析缸中平衡一段时间，使滤 纸吸饱蒸汽，然后移去小烧杯，将溶剂倒入溶剂 槽中，立即将点好样的滤纸的一端浸入溶剂槽内 展层。