HIV-1基因型耐药检测及质量保证
艾滋病病在感染者中的耐药性监测与管理
艾滋病病在感染者中的耐药性监测与管理艾滋病（Acquired Immunodeficiency Syndrome，AIDS）是由人类免疫缺陷病毒（Human Immunodeficiency Virus，HIV）引起的一种免疫系统疾病。
随着抗逆转录病毒治疗（Antiretroviral Therapy，ART）的广泛应用，耐药性问题引起了人们的关注。
针对艾滋病病毒耐药性的监测与管理，对保障患者的治疗效果、延长生命寿命至关重要。
一、耐药性监测的重要性艾滋病病毒的耐药性是指感染者在接受治疗的过程中，由于病毒突变或选择压力等因素导致对特定抗病毒药物失去敏感性的现象。
耐药性的产生严重威胁到患者的治疗效果，使原本应对艾滋病病毒的药物失去了作用，使病毒得以继续复制和繁殖，增加疾病进展的风险。
耐药性监测的目的在于及时发现和评估耐药性，以便为患者提供更有效的治疗方案。
监测可以通过基因测序等方法检测病毒的基因序列，并分析变异情况，判断药物耐药性。
通过监测，可以了解感染者对抗病毒药物的敏感性，为制定个性化治疗方案提供依据。
二、耐药性监测方法1. 基因测序方法：通过对艾滋病病毒基因进行测序，包括反转录酶、蛋白酶等基因，以检测病毒的变异情况及药物耐药突变。
这种方法准确度较高，但需要专业实验室支持和较高成本投入。
2. 基因芯片技术：利用基因芯片芯片上固定的不同的艾滋病病毒基因序列探针来检测感染者体内的病毒基因序列。
这种技术具有高通量、高灵敏度和高度自动化的特点，适用于大规模样本的处理。
3. 基于PCR的测序技术：通过聚合酶链式反应（PCR）扩增病毒基因片段，再进行测序和分析。
这种方法具有成本低、操作简便等优点，适用于资源匮乏地区。
三、耐药性管理策略1. 个体化治疗：耐药性监测结果可用于指导治疗的选择。
根据监测结果，调整治疗方案，选择对病毒仍然敏感的药物进行治疗。
2. 合理用药：艾滋病治疗中常采用多药联合治疗的策略，即联合使用不同类别的抗病毒药物。
全国艾滋病检测技术规范(2015年修订版)
本《规范》由中国疾病预防控制中心批准,下发至全国艾滋病检测实验室及有关单位。本《规范》将为国家、相关部委下发的艾滋病防治工作各项政策法规的有效实施提供强有力的技术支持，并具体指导艾滋病实验室技术人员开展日常工作。
本《规范》起草单位：中国疾病预防控制中心性病艾滋病预防控制中心。
4.2.1.8 样品采集后处理、保存、运输的时限和条件，因不同的检测项目而异，应参见不同检测项目要求。
4.2.1.9 采血完成后的穿刺针头必须丢弃于放置尖锐危险品容器内，妥善处理，防止发生职业暴露。
4.2.2滤纸干血斑
4.2.2.1 根据需要，可将采集的各种血液样品制备成滤纸干血斑，用于检测。最常用的是用抗凝全血、末梢全血和血浆制备滤纸干血斑。
4.2.1.6 PBMC：使用淋巴细胞分离液，进行密度梯度离心，吸出PBMC层，置于合适的容器中，备用。
4.2.1.7 抗凝剂的选择：根据检测要求选用适当的抗凝剂，如CD4+和CD8+T淋巴细胞测定可选用EDTA钠盐或钾盐、枸橼酸钠、肝素钠；HIV-1病毒分离、核酸定性/定量检测可选用EDTA钠盐或钾盐或枸橼酸钠。
4.4
4.4.1全血、血浆的运送应符合生物安全要求，参照《可感染人类的高致病性病原微生物菌（毒）种或样本运输管理规定》(卫生部第45号令,2006年2月1日执行)。
4.4.2 血液样品运送时应采用三层容器对样品进行包装，随样品应附有与样品唯一性编码相对应的送检单。送检单应标明受检者姓名、样品种类等信息，并应放置在第二层和第三层容器之间。
附件1
全国艾滋病检测技术规范
National Guideline for Detection of HIV/AIDS
（2015年修订版）
用两步MS-PCR结合ELISA检测HIV-1逆转录酶基因的耐药性突变
中国生物工程杂志ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００６，２６（８）：４２～４６用两步ＭＳ—ＰＣＲ结合ＥＬＩＳＡ检测ＨＩＶ一１逆转录酶基因的耐药性突变术何红秋程绍辉”刘斌陈慰祖王存新”（北京工业大学生命科学与生物工程学院北京１０００２２）摘要高效抗逆转录病毒治疗法（ＨＡＡＲＴ）的推广使用有效地抑制了ＨＩＶ．１病毒的传播和艾滋病（ＡＩＤＳ）的发病率、死亡率。
近年来，ＨＩＶ一１逆转录酶基因突变所导致的耐药性已成为ＨＡＡＲＴ治疗失败的主要原因，耐药性突变的检测对于指导病人用药以及新药开发具有重要意义。
发展了一种检测ＨＩＶ一１逆转录酶基因耐药性突变的新方法。
采用两步ＭＳ—ＰＣＲ方法检测ＨＩＶ一１Ｂ亚型野生型和耐药突变型逆转录酶基因突变，检测点包括Ｍ４１Ｌ、Ｋ７０Ｒ、Ｋ１０３Ｎ、Ｙ１８１Ｃ和ｒｒ２１５，并在两步Ｍｓ—ＰｃＲ基础上，设计比野生型引物长的突变型引物，结合微孔板杂交ＥｕｓＡ呈色技术检测各点突变。
结果显示，简化的两步Ｍｓ—ＰＣＲ能保持灵敏度和特异性高的优点，ＥｕＳＡ的阳性结果与阴性结果的比值（Ｐ／Ｎ）达到要求，两步Ｍｓ－ＰｃＲ结合ＥｕＳＡ方法灵敏度高，操作简单、结果直观、成本低、相对耗时短且能进行高通量检测，使其无论在ＨＩＶ一１耐药性突变及其它的点突变检测中都具有较好的临床应用前景。
关键词两步ＭＳ—ＰＣＲＥＵＳＡＨＩＶ．１逆转录酶基因耐药性中图分类号：Ｑ９３９．４人类免疫缺陷病毒１型（ｈｕｍａｎｉｍｍｕｎｏｄｅ６ｃｉｅｎｃｙｖｉｒｕｓｔｙｐｅ１，ＨＩＶ．１）的迅速传播引起的人类获得性免疫缺陷综合症（ａｃｑｕｉｒｅｄｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙｓｙｎｄｒｏｍｅ，ＡＩＤｓ）已经夺走了全球大约２０００万人的生命¨Ｊ。
高效抗逆转录病毒治疗法（ｈｉｇｈｌｙａｃｔｉｖｅａｎｔｉ．ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌｔｈｅｒａｐｙ，ＨＡＡＲＴ）被用作治疗ＨＩＶ一１感染病人的标准疗法口。
，该方法的推广使用，对于延长感染者寿命，提高其生存质量起到了巨大作用口１。
HIV-1耐药检测技术规范
HIV-1耐药检测技术规范HIV-1耐药检测技术规范1 范围本章规定了HIV-1耐药基因型检测的实验室条件、方法、结果判定及质量控制,适用于血浆、血清和滤纸干血斑样品的HIV-1耐药基因型测定。
2 规范性引用文件Antiretroviral drug resistance testing in adult HIV-1 infection: 2008 recommendations of an International AIDS Society-USA panel. Clin Infect Dis 47（2）: 266-85.Guidelines for the Use of Antiretroviral Agents in HIV-1-Infected Adults and Adolescents. DHHS 2008; Available at: /doc/c96382759.html,/guidelines.Update of the Drug Resistance Mutations in HIV-1: Spring 2008, Top HIV Med. 2008;16（1）: 62-68.3 HIV-1耐药检测的意义3.1 耐药监测用于HIV-1感染人群和抗病毒治疗人群的耐药性监测和检测。
用于新近感染人群的耐药性监测，了解耐药毒株流行的情况，并采取防控措施，用于治疗前人群的监测，指导制定一线抗病毒治疗方案；用于抗病毒治疗人群的耐药性监测，进行HIV-1耐药发生、发展趋势以及影响因素的分析，指导和完善大规模公共卫生模式抗病毒治疗的程序，以及制定二线治疗方案。
3.2 耐药检测用于个体患者的耐药检测。
在抗病毒治疗前进行耐药检测，可指导临床医生制定抗病毒治疗方案，保证抗病毒治疗的效果；在抗病毒治疗过程中进行耐药检测，可指导临床医生分析治疗失败的原因，并制定补救治疗方案。
4 HIV-1耐药检测实验室要求4.1 实验室功能分区实验室原则上应分为4个独立工作区：试剂准备区、样品处理区、扩增区、扩增产物分析区，并设在不同房间。
HIV-1病毒载量测定及质量保证指南
HIV-1 病毒载量测定及质量保证指南（2013 版）Guideline for HIV-1 Viral Load Testing and QualityAssurance中国疾病预防控制中心2013年1月前言随着HIV-1 病毒载量检测在艾滋病临床辅助诊断、抗病毒治疗监测及相关科研工作中的广泛应用，我国开展该项检测工作的实验室日益增多。
自1997 年艾滋病实验室首次引进HIV-1 病毒载量检测技术以来，截至2012 年底全国已经配备115 台HIV-1 病毒载量检测仪，覆盖疾控、医院、检疫、军队等系统，艾滋病流行重点地区及少数县级实验室均已配备HIV-1 病毒载量检测仪，每年检测量已达13 万人份以上。
由于HIV-1 病毒载量检测质量对艾滋病的早期诊断及治疗有重要影响，因此急需加强该领域的培训和质量控制，规范实验室操作，以保证检测结果的准确性和可靠性。
自2008 年开始实施《HIV-1 病毒载量测定及质量保证指南》（试行，以下简称《指南》）以来，参与HIV-1 病毒载量能力验证工作的实验室从2007 年的29家增加到2012年的107 家，占已开展工作实验室的百分之九十以上。
通过综合分析近几年能力验证发现的问题与检测技术发展的实际情况，考虑各种试剂的检测要求，结合专家意见和一线实验室工作人员的经验与需求，对本指南进行了适当修改、调整和补充，主要修改内容包括：（1）增加“人员要求”章节；（2）修改“常用HIV-1 病毒载量检测方法”；（3）修改“ HIV-1 病毒载量检测能力验证（PT）”；（4）补充常见问题分析和处理等内容。
修订后的《指南》共分八章，包括：总则，人员要求，实验室环境与设施，样品的采集、处理保存运输，常用检测方法简介，室内质量控制，实验室检测能力验证（PT），实验室生物安全，以及四个附表。
本指南在修改过程中，接纳了国内专家、同行的意见和建议，经过多次修改编写成《指南》（2013）版。
HIV1基因型耐药检测及质量保证
HIV-1基因型耐药检测及质量保证指南(2013年版)Guideline for HIV-1genotyping drug resistance testing and qualityassurance中国疾病预防控制中心2013年3月20日前言随着我国艾滋病抗病毒治疗工作的日益深化，HIV-1基因型耐药检测显示出越来越重要的作用，开展耐药检测的实验室也日益增多。
截至2012年底，共有30余家实验室从事HIV-1基因型耐药检测，未来还将有更多的实验室参与其中。
HIV-1基因型耐药检测是对操作人员、实验室环境和设备有很高要求的分子生物学技术，为了对开展该项检测工作的实验室进行系统的技术和质量控制指导，保证检测结果的准确性和可靠性，特制定《HIV-1基因型耐药检测及质量保证指南》（以下简称《指南》）。
本指南自2011年12月开始编写，参与编写的人员为我国实验室检测、抗病毒治疗领域的专家和有富有实践经验的检测人员，同时聘请WHO和美国疾病预防控制中心的专家作为技术顾问，并参考了大量国内外相关学术文献及技术指导手册。
经过编写组多次修订、补充和审定，于2013年3月完成《指南》终稿。
《指南》分为八章，包括：HIV-1基因型耐药检测的人员要求、实验室环境与设置、样品管理、检测技术、质量控制和生物安全。
本《指南》起草单位：中国疾病预防控制中心性病艾滋病预防控制中心。
本《指南》参加编写单位：中国医科大学，中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所，上海市疾病预防控制中心，复旦大学公共卫生中心，云南省疾病预防控制中心，云南省传染病医院艾滋病关爱中心，北京出入境检验检疫局。
本《指南》编写主持人：蒋岩本《指南》编写组人员：姚均、邢辉、尚红、李敬云、钟平、徐建青、马艳玲、杨绍敏、韩晓旭、张旻、潘品良、蒋岩、汪宁、康来仪、朱红、邢文革、肖瑶、邱茂锋、吴亚松。
本《指南》技术顾问：美国疾病预防控制中心杨春富、GAP北京办公室Chin-Yih Ou，齐明山。
艾滋病HIV-1耐药基因型检测报告
编号:
送检单位
送检日期
年月日
样本类型
人群
姓名
性别
年龄
职业
身份证
□□□□□□□Βιβλιοθήκη □□□□□□□□□□检测方法
耐药解释系统
检测日期
年月日
基因区
耐药相关基因突变
抗病毒药物
耐药程度
蛋白酶区（PR）
主要突变：
次要突变：
阿扎那韦（ATV）
地瑞那韦（DRV）
夫沙那韦（FPV）
茚地那韦（IDV）
依非韦仑（EFV）
Etravirine（ETR）
奈韦拉平（NVP）
Rilpivirine(RPV)
整合酶区（IN）
整合酶链转移抑制剂（INSTI）相关
Bictegravir(BIC)
多替拉韦(DTG)
艾维雷韦(EVG)
拉替拉韦(RAL)
其他
检测者
签发者
报告日期
年月日
检测单位（公章）
备注:本结果仅提供耐药性参考，病人对药物的耐受情况需接合临床情况具体分析。
克力芝（LPV/r）
奈非那韦（NFV）
沙奎那韦（SQV）
替拉那韦（TPV）
逆转录酶区
（RT）
核苷（酸）类逆转录酶抑制（NRTI）相关
拉米夫定（3TC）
阿巴卡韦（ABC）
齐多夫定（AZT）
司他夫定（d4T）
地丹诺辛（ddI）
恩曲他滨（FTC）
替诺福韦酯(TDF)
非核苷类逆转录酶抑制剂（NNRTI）相关
HIV-1基因型耐药检测及质量保证
HIV-1基因型耐药检测及质量保证指南(2013年版)Guideline for HIV-1genotyping drug resistance testing and qualityassurance中国疾病预防控制中心2013年3月20日前言随着我国艾滋病抗病毒治疗工作的日益深化，HIV-1基因型耐药检测显示出越来越重要的作用，开展耐药检测的实验室也日益增多。
截至2012年底，共有30余家实验室从事HIV-1基因型耐药检测，未来还将有更多的实验室参与其中。
HIV-1基因型耐药检测是对操作人员、实验室环境和设备有很高要求的分子生物学技术，为了对开展该项检测工作的实验室进行系统的技术和质量控制指导，保证检测结果的准确性和可靠性，特制定《HIV-1基因型耐药检测及质量保证指南》（以下简称《指南》）。
本指南自2011年12月开始编写，参与编写的人员为我国实验室检测、抗病毒治疗领域的专家和有富有实践经验的检测人员，同时聘请WHO和美国疾病预防控制中心的专家作为技术顾问，并参考了大量国内外相关学术文献及技术指导手册。
经过编写组多次修订、补充和审定，于2013年3月完成《指南》终稿。
《指南》分为八章，包括：HIV-1基因型耐药检测的人员要求、实验室环境与设置、样品管理、检测技术、质量控制和生物安全。
本《指南》起草单位：中国疾病预防控制中心性病艾滋病预防控制中心。
本《指南》参加编写单位：中国医科大学，中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所，上海市疾病预防控制中心，复旦大学公共卫生中心，云南省疾病预防控制中心，云南省传染病医院艾滋病关爱中心，北京出入境检验检疫局。
本《指南》编写主持人：蒋岩本《指南》编写组人员：姚均、邢辉、尚红、李敬云、钟平、徐建青、马艳玲、杨绍敏、韩晓旭、张旻、潘品良、蒋岩、汪宁、康来仪、朱红、邢文革、肖瑶、邱茂锋、吴亚松。
本《指南》技术顾问：美国疾病预防控制中心杨春富、GAP北京办公室Chin-Yih Ou，齐明山。
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HIV-1基因型耐药检测及质量保证指南(2013年版)Guideline for HIV-1genotyping drug resistance testing and qualityassurance中国疾病预防控制中心2013年3月20日前言随着我国艾滋病抗病毒治疗工作的日益深化，HIV-1基因型耐药检测显示出越来越重要的作用，开展耐药检测的实验室也日益增多。
截至2012年底，共有30余家实验室从事HIV-1基因型耐药检测，未来还将有更多的实验室参与其中。
HIV-1基因型耐药检测是对操作人员、实验室环境和设备有很高要求的分子生物学技术，为了对开展该项检测工作的实验室进行系统的技术和质量控制指导，保证检测结果的准确性和可靠性，特制定《HIV-1基因型耐药检测及质量保证指南》（以下简称《指南》）。
本指南自2011年12月开始编写，参与编写的人员为我国实验室检测、抗病毒治疗领域的专家和有富有实践经验的检测人员，同时聘请WHO和美国疾病预防控制中心的专家作为技术顾问，并参考了大量国内外相关学术文献及技术指导手册。
经过编写组多次修订、补充和审定，于2013年3月完成《指南》终稿。
《指南》分为八章，包括：HIV-1基因型耐药检测的人员要求、实验室环境与设置、样品管理、检测技术、质量控制和生物安全。
本《指南》起草单位：中国疾病预防控制中心性病艾滋病预防控制中心。
本《指南》参加编写单位：中国医科大学，中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所，上海市疾病预防控制中心，复旦大学公共卫生中心，云南省疾病预防控制中心，云南省传染病医院艾滋病关爱中心，北京出入境检验检疫局。
本《指南》编写主持人：蒋岩本《指南》编写组人员：姚均、邢辉、尚红、李敬云、钟平、徐建青、马艳玲、杨绍敏、韩晓旭、张旻、潘品良、蒋岩、汪宁、康来仪、朱红、邢文革、肖瑶、邱茂锋、吴亚松。
本《指南》技术顾问：美国疾病预防控制中心杨春富、GAP北京办公室Chin-Yih Ou，齐明山。
WHO北京办事处Nicole Seguy，张岚。
本《指南》编写工作联系人：姚均。
本《指南》自发布之日起实施，解释权归属中国疾病预防控制中心。
HIV-1基因型耐药检测及质量保证指南编写组2013年3月20日目录第一章总则第二章人员要求第三章实验室环境与实施第四章样品采集、处理、运输和保存第五章常用HIV-1基因型耐药检测方法第六章室内质量控制第七章 HIV-1基因型耐药检测能力验证（PT）第八章常见问题分析及解决方案第九章实验室生物安全附表1 HIV-1基因型耐药检测样品送检及接收单附表2 混合碱基转换码表附表3 HIV-1基因型耐药突变位点分析表附表4 HIV-1基因型耐药检测结果附表5 国内In-house方法常用扩增及测序引物（B和07BC亚型）附表6 美国CDC推荐引物附表7 HIV-1基因型耐药检测能力验证样品接收专用单附表8 HIV-1基因型耐药检测能力验证样品检测结果回报表附件1 ChromasPro,BioEdit,MEGA4 软件应用程序附件2 国际机构组织的HIV-1基因型检测能力验证（PT）介绍参考文献缩略语第一章总则1.1意义我国自2002年开展免费抗艾滋病病毒治疗以来，累计有十多万艾滋病病毒感染者和病人接受抗逆转录病毒治疗。
由于艾滋病病毒本身高速复制及复制过程中缺乏自我校对功能等原因，易发生基因突变产生耐药。
同时，在长期抗病毒治疗药物选择性压力作用下，艾滋病病毒耐药突变几率大大增加。
耐药突变的产生和发展会影响抗病毒治疗的疗效。
因此，及时进行耐药检测，在艾滋病预防与治疗中具有重要作用：首先，它广泛用于HIV-1感染人群的耐药监测，以了解HIV-1耐药毒株流行的状况、发展趋势以及影响因素，指导和完善大规模公共卫生模式抗病毒治疗的程序。
其次，对个体在抗病毒治疗前进行耐药检测，可指导临床医生制定抗病毒治疗方案，保证抗病毒治疗的效果；此外，还可对抗病毒治疗失败病人进行耐药检测，指导临床医生分析治疗失败原因，并制定补救治疗方案。
然而，与艾滋病实验室的常规血清学检测技术相比，耐药检测操作过程更为复杂，对人员、环境、设备有更高的要求，因此，制定《HIV-1基因型耐药检测及质量保证指南》，对指导艾滋病检测实验室更好地开展耐药检测具有重要意义。
1.2目的规范HIV-1基因型耐药检测的方法与程序，保证检测质量，提高检测结果的准确性。
1.3适用范围适用于在我国开展HIV-1基因型耐药检测的所有实验室。
第二章人员要求HIV-1基因型耐药检测人员分为检验人、复核人、签发人。
2.1检验人所有相关检验人员至少有一年以上的分子生物学实验工作经验，接受国家级以上耐药基因型技术培训4周以上，能独立熟练地操作，会使用相关序列分析软件并经理论和实践操作通过考核。
2.2复核人、签发人复核人应具备对检测过程进行分析、发现问题与解决问题的能力。
签发人为实验室负责人或认证认可体系文件中确定的人员。
第三章实验室环境与实施依据《医疗机构临床基因扩增检验实验室管理办法（卫医发【2010】194号）》、《临床基因扩增检验实验室工作规范（卫医发【2003】8号）》和《全国艾滋病检测技术规范（2009年版）》的相关要求设置实验室。
HIV-1基因型耐药检测应在标准化的基因扩增实验室中进行，实验室应设置核酸扩增前区和核酸扩增后区两个独立的工作区域。
核酸扩增前区包括设在不同房间或区域的试剂准备区和样品制备区；核酸扩增后区包括设在不同的房间或区域的扩增区和扩增产物分析区（图1）。
各工作区必须有明确的标记，应采取单向工作流向，即试剂准备区→样品处理区→扩增区→产物分析区，不得逆向流动。
不同工作区域内的设备、物品不得混用。
不同工作区域使用不同的工作服（例如不同颜色），工作人员离开各工作区域时，不得将工作服带出。
图1 HIV-1基因型耐药检测实验室具体分区与流程示例图（来自WHO ） 实验室1 （试剂准备区）试剂储存 主反应混合液制备 实验室3 （扩增区）第一轮PCR 扩增和第二轮PCR 反应模板添加实验室2（样品处理区） 样品接受、储存、RNA 提取和第一轮PCR 反应液配制实验室4 （产物分析区） 第二轮PCR 扩增、电泳分析和测序反应样品 血浆、全血、滤纸片干血斑各区的功能及所需的基本仪器及材料如下：3.1试剂准备区：用于扩增试剂的储备、配制和分装。
3.1.1 2～8℃和-20℃冰箱。
3.1.2 混匀器。
3.1.3 加样器1套（20μL 、200μL、1000μL）。
3.1.4 微量离心机。
3.1.5 1.5mL离心管（无DNA和RNA酶）和1.5mL 试管架。
3.1.6 75%乙醇和移动紫外消毒灯。
3.1.6 专用工作服。
3.1.7 消耗品:有滤芯的一次性吸头（无DNA、RNA酶）、无粉手套、一次性吸水纸。
3.1.8 专用办公用品：记录纸及记号笔等。
3.3样品制备区：用于核酸提取和第一轮PCR反应液配制3.3.1 二级生物安全柜。
3.3.2 2～8℃、-20℃或-80℃冰箱。
3.3.3台式高速冷冻离心机及微量离心机。
3.3.4 水浴箱或加热模块。
3.3.5 混匀器。
3.3.6 计时器。
加样器1套（20μL 、200μL、1000μL）。
3.3.7 75%乙醇和移动紫外消毒灯。
3.3.8专用工作服。
3.3.9 消耗品:有滤芯的一次性吸头（无DNA、RNA酶）、无粉手套、鞋套、一次性吸水纸。
3.3.10 专用办公用品：记录纸及记号笔等。
3.3.11 如有条件可配置全自动核酸提取仪和制冰机。
3.3扩增区：第一轮PCR扩增和第二轮PCR反应模板添加。
3.3.1 二级生物安全柜。
3.3.2 -20℃冰箱。
3.3.3 核酸扩增仪。
3.3.4 微量离心机。
3.3.5加样器1套（20μL 、200μL、1000μL）。
3.3.6 75%乙醇和移动紫外消毒灯。
3.3.7 专用工作服。
3.3.8 消耗品:带滤芯的一次性吸头（无DNA、RNA酶）、无粉手套、一次性吸水纸。
3.3.9 专用办公用品：记录纸及记号笔等。
3.4 扩增产物分析区：对扩增产物鉴定和进行数据分析3.4.1 2～8℃和-20℃冰箱。
3.4.2加样器1套（20μL 、200μL、1000μL）。
3.4.3 电泳槽、电泳仪。
3.4.4 天平。
3.4.5 凝胶成像仪。
3.4.6 75%乙醇和移动紫外消毒灯。
3.4.7 专用工作服。
3.4.8 消耗品:带滤芯无DNA、RNA酶的一次性吸头、无粉手套、鞋套、一次性吸水纸。
3.4.9 专用办公用品：记录纸及记号笔等。
3.4.10 使用商品化试剂盒和序列测定的仪器放置于该区域。
3.4.11 建议在该区所得到的实验结果数据和照片通过网络传输至办公区。
第四章样品采集、处理、运输和保存用于HIV-1基因型耐药检测的样品类型可为血浆和滤纸片干血斑。
在缺乏上述两种样品类型时，在保证血清样品质量的条件下，也可用于耐药性检测，其检测结果作为参考。
4.1 血浆样品4.1.1 血浆样品的采集和处理4.1.1.1采样器材：一次性抗凝真空采血管、持针器、蝶形针等。
4.1.1.2 抗凝剂：采用EDTA（乙二胺四乙酸）或ACD（枸橼酸钠），不要使用肝素，肝素是Taq酶的强抑制剂，且在核酸提取过程中很难除去。
4.1.1.3 样品标识：在采血管上标明唯一的样品编号。
4.1.1.4 样品采集量：通常考虑该样品进行多项检测（如CD4细胞与病毒载量）所需的样品总量，一般应采集全血8～10ml，采集的样品量应尽可能与定量采血管的刻度一致，采集量过多或不足，会造成血液凝固或被稀释。
4.1.1.5 样品的混匀：采集血液后，立即轻轻上下颠倒抗凝管（约10次），使血液与抗凝剂充分混匀。
4.1.1.6 要求在6小时内将采集的抗凝全血1500-3000r/min离心15分钟，上层即为血浆，吸出并分装到无菌、聚丙烯螺口、已贴上样品编号的冻存管中（无RNA酶），注明分装时间。
4.1.1.7 血浆样品不能灭活。
4.1.1.8 获取信息：按要求填写HIV-1基因型耐药检测样品送检及接收单，包括采集对象的基本信息和流行病学资料，抗病毒药物使用情况，病毒载量检测结果（附表1）。
4.1.2 血浆样品的转运及接收4.1.2.1 根据《可感染人类的高致病性病原微生物菌（毒）种或样品运输管理规定》的要求运输，并严格控制运输的冷冻状态，防止样品融化。
4.1.2.2 发送样品时附带HIV-1基因型耐药检测样品送检及接收单（附表1）。
4.1.2.3 血浆运输时间在24小时内，应加入冰袋。
如运输时间超过24小时，应使用干冰以保持血浆处于冷冻状态。
4.1.2.4 接收样品时，按HIV-1基因型耐药检测样品送检及接收单内容（附表1）核对样品数量，检查样品状况。