1 分子克隆
分子克隆名词解释
分子克隆名词解释分子克隆是指利用重组DNA技术，将一个生物体的遗传物质（DNA）复制并传递给另一个生物体的过程。
在分子克隆中，一个主要的步骤是将要克隆的DNA片段插入到载体DNA上，形成重组DNA，然后将其传递给宿主细胞进行复制和表达。
分子克隆有许多不同的应用领域，其中最著名的是基因工程和医学研究。
在基因工程中，分子克隆可以用于生产重组蛋白、生产转基因生物和制造药物。
在医学研究中，分子克隆可以用于研究疾病的发病机制、开发新型疗法和筛选药物靶点。
在分子克隆的过程中，有几个重要的术语需要理解。
首先是重组DNA。
重组DNA是将要克隆的DNA片段与载体DNA连接而形成的复合物。
载体DNA通常是质粒，可以在宿主细胞中自主复制和表达。
其次是限制性内切酶。
限制性内切酶是一类酶，可以识别DNA的特定序列，并在该序列上切割DNA。
这些酶在分子克隆中起到“剪刀”的作用，将DNA切割成特定的片段，用于进行重组。
另外一个重要概念是DNA合成。
DNA合成是通过化学合成方法制备DNA片段的过程。
这些合成的DNA片段可以与其他DNA片段连接，形成重组DNA。
在分子克隆的过程中，有几个关键的步骤。
首先是选择合适的限制性内切酶。
限制性内切酶的选择根据克隆的目的和需要选择不同的酶切位点。
然后是DNA切割和连接。
通过酶切和连接反应，将要克隆的DNA片段与载体DNA连接，并形成重组DNA。
接下来是转化过程。
将重组DNA导入宿主细胞，并使其进行自主复制和表达。
最后是筛选或鉴定过程。
通过筛选或鉴定宿主细胞中的重组DNA，筛选出目标克隆。
总之，分子克隆是一种利用重组DNA技术，将一个生物体的遗传物质复制并传递给另一个生物体的过程。
通过克隆可以研究基因功能、生产重组蛋白和制造药物。
分子克隆的关键步骤包括选择限制性内切酶、DNA切割和连接、转化和筛选或鉴定。
分子克隆在生物科学和医学研究中具有广泛的应用前景。
分子克隆
3.与反转录相关的PCR扩增
RT-PCR（reverse transcriptase-PCR,RT-PCR): 又称反转录PCR, 是以反转录的cDNA作模板所进行的PCR，
可对基因的表达和序列多态性分析。
ＲＴ－ＰＣＲ
反转录
逆转录酶
AAAnA mRNA
AAAnA
T T TnT
cDNA第一链
ＤＮＡ聚合酶 cDNA
目的基因的获取-----PCR技术:
定义： PCR技术又称聚合酶链式反应（polymerase chain reaction)，是通过模拟体内 DNA 复制的 方式，在体外选择性地将 DNA 某个特殊区域扩 增出来的技术。
Taq DNA多聚酶的发现
Heat-stable polymerase is vital to the ease of the process…
4.PCR反应程序
⑴94~96℃ ⑵94℃ ⑸ 25- ⑶50-60℃ 35个循 ⑷72℃ 环 ⑹72℃ ⑺4-10℃ 30’’-3’ 预变性（使模板DNA充分变性） 30’’ 变性 30’’-1’ 复性（使引物与模板充分退火） n’(按1’扩增1kb计算）延伸 3-7’ 总的延伸（使产物延伸完整） 保存
质粒自身含有复制起始点，与相应的顺式调控元件组成一个复制子(replicon)， 能利用细菌的酶系统进行独立的复制及转录。质粒具有多种遗传选择标记， 包括各种抗药基因或营养代谢基因等。
氨苄青霉素抗性(ampicillin resistance，ampr)基因：
此基因编码ß 内酰胺酶，该酶能 水解氨苄青霉素ß —内酰胺环，使之 失效而使细菌产生耐药。
1988年Saiki 等从温泉 （ Hot spring）中分离 的一株水生嗜热杆菌 (thermus aquaticus) 中提取到一种耐热DNA 聚合酶。
分子克隆的步骤及原理
分子克隆的步骤及原理分子克隆是利用重组DNA技术复制特定的DNA片段并将其插入到另一个DNA分子中的过程。
它是许多生物学和医学研究中常用的技术，例如用于研究基因结构和功能、制备重组蛋白以及研发基因治疗等。
第一步是选择并提取目标DNA片段。
一般情况下，需要从生物体中提取DNA，例如通过PCR扩增或酶切来获取所需片段。
PCR是一种酶链反应技术，通过引物引导DNA的聚合酶在一系列温度循环中合成DNA。
酶切是利用限制性内切酶切割特定的DNA序列来获得目标DNA片段。
第二步是将目标DNA片段插入载体DNA中。
载体DNA是一段能够自主在细胞中复制的DNA分子。
常用的载体包括质粒和噬菌体。
目标DNA片段需要与载体DNA进行连接，形成重组DNA。
连接主要通过DNA连接酶的作用，与连接酶反应的连接体包括连接酶本身、大肠杆菌DNA连接酶I（T4 DNA连接酶由细菌染色体T4噬菌体中提取的）、T4 ligation buffer （限制性内切酶的缓冲液通用成分+乙醇和内切酶）。
连接后的重组DNA 可以通过转化作用导入到宿主细胞中。
第三步是将重组DNA导入宿主细胞。
转化是将外源的DNA片段导入到细胞中的过程。
常用的转化方法包括化学转化和电转化。
化学转化是通过改变细胞的物理状态和细菌细胞表面的荷电状态，使其能够非特异性地吸附DNA质粒。
电转化则是通过电场作用使DNA穿透细胞膜，进入细胞。
最后一步是筛选和分离重组的细胞。
由于重组细胞中带有插入的目标DNA片段，因此可以通过筛选技术来判断哪些细胞中含有目标DNA。
常用的筛选方法包括抗生素耐药筛选和荧光蛋白筛选。
在抗生素耐药筛选中，重组细胞会在含有特定抗生素的培养基中生长，而未转化的细胞则会被抑制。
在荧光蛋白筛选中，以荧光蛋白为报告基因，使转化的细胞能够呈现出荧光信号。
分子克隆的原理主要依赖于DNA的重组和复制。
DNA连接酶通过其黏末端连接酶活性，可以将目标DNA片段连接到载体DNA中形成重组DNA。
分子克隆基本流程及技术原理
分子克隆基本流程及技术原理分子克隆是一种重要的实验技术，可用于制备大量的DNA和蛋白质，探索基因功能，研究生物学过程等。
其基本流程包括DNA片段选择、PCR 扩增、限制性内切酶切割、连接、转化和筛选等步骤。
以下将详细介绍分子克隆的基本流程及技术原理。
PCR扩增：接下来，使用聚合酶链反应（PCR）技术扩增DNA片段。
PCR是一种有效的DNA扩增方法，它通过反复复制DNA模板，生成大量的DNA片段。
PCR反应基本包括三个步骤：变性、引物结合和扩增。
-变性：将DNA模板加热至95°C，使其两个链分离，得到单链DNA。
-引物结合：将反应体系温度下调到适宜的引物结合温度，引物与DNA模板的互补序列结合，形成DNA-DNA复合物。
-扩增：在一定的温度下，聚合酶通过DNA-DNA复合物进行扩增。
扩增过程包括DNA链合成、DNA链延长、DNA链分离和DNA链结合。
多次循环后，可以得到大量的目标DNA片段。
限制性内切酶切割：在PCR扩增后，可选用特定的限制性内切酶切割目标DNA片段。
内切酶是一种具有特异性的酶，它能够在特定的DNA序列上切割产生特定的片段。
通过切割，可以克隆所需的片段，并在连接过程中提供黏性末端。
连接：将目标DNA片段与载体DNA（如质粒）连接起来。
连接可采用多种方法，如T4DNA连接酶方法、PCR重叠延伸法等。
连接时，需要确保目标DNA片段与载体DNA能够互补配对，并生成稳定的连接。
转化：将连接后的混合物转化到宿主细胞中。
转化可通过化学方法（如钙离子转化法）或生物方法（如细菌电穿孔法）实现。
转化后，将细胞培养在含有适当选择压力（如抗生素）的培养基中，这样只有转化成功的细胞才能存活。
筛选：根据实验目的选择合适的筛选方法。
通常，使用抗生素抗性标记和荧光蛋白等进行筛选，以识别并纯化所需克隆产物。
技术原理：-PCR技术：PCR技术是通过DNA聚合酶的模板依赖性合成，将DNA片段按特定序列进行扩增。
分子克隆技术操作手册
分子克隆技术操作手册【最新版】目录1.分子克隆技术的概念2.分子克隆技术的操作步骤3.分子克隆技术的应用4.分子克隆技术的优缺点正文一、分子克隆技术的概念分子克隆技术是一种生物技术方法，用于在体外将各种来源的 DNA 片段进行拼接组合，形成新的 DNA 分子。
这种技术可以在短时间内大量复制特定 DNA 序列，为基因工程、生物制药等领域提供重要的研究手段。
二、分子克隆技术的操作步骤分子克隆技术主要包括以下几个操作步骤：1.提取 DNA：从实验材料中提取 DNA，并通过特定方法进行纯化。
2.切割 DNA：使用限制性内切酶将 DNA 切割成特定大小的片段。
3.链接 DNA：将切割好的 DNA 片段通过 DNA 连接酶进行拼接组合。
4.转化细胞：将拼接好的 DNA 分子转化到受体细胞中，让细胞表达新的 DNA 序列。
5.筛选克隆：通过特定筛选方法，选出含有目标 DNA 序列的克隆细胞。
三、分子克隆技术的应用分子克隆技术在生物领域有广泛的应用，主要包括：1.基因工程：通过分子克隆技术，可以对特定基因进行拼接组合，研究基因的功能和调控关系。
2.生物制药：利用分子克隆技术，可以大量生产具有特定功能的蛋白质，用于药物研发和生产。
3.基因诊断：通过分子克隆技术，可以制备特定基因片段作为诊断试剂，用于疾病的早期诊断。
4.基因治疗：将正常或功能性基因通过分子克隆技术导入患者细胞，以治疗遗传性疾病。
四、分子克隆技术的优缺点分子克隆技术的优点包括：操作简便、效率高、可大量制备特定 DNA 序列。
但其缺点是：可能产生非特异性拼接、克隆产物可能不稳定、需要使用有毒的化学试剂等。
总之，分子克隆技术是一种重要的生物技术手段，广泛应用于基因工程、生物制药等领域。
分子克隆技术操作手册
分子克隆技术操作手册摘要：一、分子克隆技术的概念与原理二、分子克隆技术的操作步骤1.提取目的基因2.构建基因表达载体3.将目的基因导入受体细胞4.目的基因的检测与表达三、分子克隆技术在科研和生产中的应用四、分子克隆技术的发展趋势正文：一、分子克隆技术的概念与原理分子克隆技术是指在体外将各种来源的遗传物质——DNA 片段，与适当的载体DNA 相结合，然后导入受体细胞，使这些DNA 片段在受体细胞内复制、表达的操作技术。
分子克隆技术的原理主要基于重组DNA 技术，通过切割、连接、导入等步骤，实现外源基因与载体DNA 的重组，从而形成一个新的基因表达载体，最终达到在受体细胞中表达目的基因的目的。
二、分子克隆技术的操作步骤1.提取目的基因提取目的基因是分子克隆技术的第一步，通常采用PCR 扩增或化学合成的方法获取目的基因。
PCR 扩增是一种常见的方法，通过设计特定的引物，从基因组DNA 中扩增出目的基因。
化学合成则是根据目的基因的序列，通过化学合成方法直接合成目的基因。
2.构建基因表达载体构建基因表达载体是分子克隆技术的核心步骤，主要包括以下几个方面：（1）选择合适的载体：常用的载体有大肠杆菌的质粒等，根据实验目的和受体细胞的类型选择合适的载体。
（2）切割载体：使用限制性内切酶切割载体，暴露出载体的粘性末端，便于与目的基因连接。
（3）连接目的基因：将提取到的目的基因与切割后的载体DNA 片段通过DNA 连接酶连接，形成重组载体。
（4）转化受体细胞：将重组载体导入受体细胞，使目的基因在受体细胞内表达。
3.将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞是分子克隆技术的关键步骤，根据受体细胞的类型选择不同的导入方法。
常用的方法有转化、转染、显微注射等。
4.目的基因的检测与表达在将目的基因导入受体细胞后，需要对目的基因进行检测和表达。
检测方法包括PCR、Western blot、南方杂交等，表达方法包括实时荧光定量PCR、Western blot、酶联免疫吸附试验等。
分子克隆原理
分子克隆原理分子克隆是生物学中一种重要的技术手段，它是指利用分子生物学技术对DNA进行复制和重组，从而得到与原始DNA相同或相似的分子。
分子克隆技术的应用范围非常广泛，涉及基因工程、药物研发、农业生产等多个领域。
本文将介绍分子克隆的原理及其在生物学研究和应用中的重要性。
首先，分子克隆的原理是基于DNA的复制和重组。
DNA复制是生物体细胞分裂时进行的一种重要过程，它使得细胞在分裂时能够传递遗传信息。
而分子克隆则是通过模拟DNA复制的过程，将目标DNA片段复制出来，并将其插入到载体DNA中，从而得到包含目标DNA片段的重组DNA分子。
这样一来，就可以在细胞内大量复制目标DNA片段，为后续的研究和应用提供充足的材料。
其次，分子克隆的关键步骤包括DNA片段的获取、载体DNA的选择、连接和转化。
首先，需要从生物体中提取目标DNA片段，这可以通过PCR技术或限制性内切酶切割等方法来实现。
然后，需要选择一个合适的载体DNA，一般来说，质粒是最常用的载体，因为它具有独立的复制和表达机制。
接下来，将目标DNA片段和载体DNA进行连接，一般采用DNA连接酶来实现。
最后，将重组的DNA分子导入到宿主细胞中，通过细胞内的复制和表达机制，使得目标DNA片段得以大量复制和表达。
分子克隆技术在生物学研究和应用中具有重要的意义。
首先，它为基因工程和生物技术的发展提供了重要的技术手段。
通过分子克隆，可以对目标基因进行定点突变、基因组编辑等操作，从而揭示基因的功能和调控机制。
其次，分子克隆也为药物研发和生物医学研究提供了重要的工具。
许多重要的药物和治疗方法都是基于分子克隆技术的发展而来。
此外，分子克隆还在农业生产中发挥着重要作用，例如转基因作物的育种和疾病抗性的培育等。
总之，分子克隆技术是一种重要的生物学技术手段，它基于DNA的复制和重组原理，通过一系列的操作步骤，可以实现对目标DNA片段的复制和重组。
分子克隆技术在生物学研究和应用中具有重要的意义，为基因工程、药物研发、农业生产等领域提供了重要的技术支持。
分子克隆法
分子克隆法
分子克隆法是一种分子生物学技术，用于在体外制备和复制DNA 分子，包括基因、DNA片段和整个染色体。
这种技术允许科学家复制和操纵DNA，以进行各种研究和应用，包括基因工程、药物开发和基因治疗。
下面是分子克隆法的主要步骤：
1.DNA提取：首先，需要从源材料（通常是细胞或组织样本）中
提取DNA。
这可以通过细胞裂解和蛋白质分离等方法来完成。
2.DNA切割：提取的DNA通常是大片段，需要将其切割成较小
的片段，以便后续克隆。
这一步通常使用限制性内切酶来实现，
这些酶可以在特定DNA序列上切割。
3.DNA连接：切割后的DNA片段可以通过DNA连接酶与载体
DNA（如质粒或病毒DNA）连接在一起，形成重组DNA分子。
这个过程称为DNA重组。
4.DNA转化：重组DNA可以被引入宿主细胞中，这个过程称为
DNA转化。
这可以通过热激冷却法、电穿孔法、化学法等方法
来实现。
5.宿主细胞培养：转化后的细胞被培养，以允许它们繁殖并扩增
重组DNA。
6.筛选与识别：在宿主细胞中，可以筛选出携带重组DNA的细
胞，通常使用抗生素抗性标记或荧光标记等方法来进行筛选。
7.DNA提取与纯化：从筛选出的细胞中提取和纯化重组DNA，
以便进一步的研究或应用。
8.分析与验证：最后，分析和验证克隆的DNA，确保它是所需的
目标DNA，并不包含错误或突变。
分子克隆法有许多应用，包括基因表达、基因编辑、蛋白质生产、疾病研究等。
它在生物学研究和生物工程领域发挥着关键作用，允许科学家操纵和研究DNA，以深入了解生命的分子机制。
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将外源（某载体上的水稻）DNA
片段亚克隆到另一载体上。
pU1301
CaMV 35S promoter
Hin dIII (13575)
Terminator
Bam HI Sma I Kpn I (13246)
TEV Leader
Eco RI (13066) Eco RI (12426) Nco I (12076) Nco I (1)
制蛋白质的合成（使用浓度：50µ g/ml)
RNaseA: C 或 U 的 3’ － P 与相邻的 5’ － OH 处切开 RNA 。
配制：一般以10mg/ml溶于TE中，然后在沸水中煮 15分钟，分装成小份储存于－20℃。
质粒DNA质量检测
1. DNA 纯度：吸光值检测：检测 260nm 、 280nm 吸光值，紫外分光光度计 A260/A280=1.8 － 1.9 ；
pU1301+1.5KB外源
• 双酶切： BamHI+KpnI
ALPHA
pUC19
Eco RI (397 )
P(BLA)
Acc 65 I (409) Ava I (41 3) Xma I (41 3) Kpn I (41 3) Sma I (41 5 )
AP r
pUC19
2686 bp
Bam HI (41 8) Pst I (440) Hin dIII (448)
实验材料
携带pUC19质粒载体的大肠杆菌菌液； 携带含有水稻 DNA 片段的 pU1301 载体的大肠杆菌 菌液。
操作步骤
1. 取含有相应载体的大肠杆菌菌液于含有相应
抗生素的 LA 培养基上涂布或划线分离单菌落，
37℃过夜培养）；
2. 用无菌牙签挑取单菌落，接种于含有相应抗
生素的LB培养基中，37℃摇床~250 r/min过夜
混合后依次加入点样孔中；
5. 将制胶板放入电泳槽中，加入电泳液，打开 电泳仪，使核酸样品向正极泳动（注意点样孔
在电泳槽的负极一端）；
6. 电泳完成后切断电源，取出凝胶，放入0.5 µ g/ml的溴化乙锭（EB）中浸泡10－15 min， 在紫外透射仪上观察电泳结果并照相记录。
质粒电泳检测
一般有一至三条带（质粒DNA的三种构型）
试剂的作用（二）
Solution III 中和后，宿主 DNA 由于很大，碱基 还未来得及配对就在冰冷的条件下与 SDS、蛋白 质、高分子量的 RNA 等缠绕在一起沉淀下来， 而质粒 DNA 由于很小且双链未分开，能够迅速 配对重新形成超螺旋，处于溶解状态。
试剂的作用（三）
1. 苯酚/氯仿： 纯化质粒，去除质粒溶液中残留的 蛋白质等杂质； 2. 无水乙醇或95%乙醇或异丙醇：沉淀质粒DNA 3. TE 或H2O：溶解质粒DNA
典型的限制性内切酶作用的缓冲体系成分包括：
氯化镁、氯化钠/钾、Tris盐酸盐、 β－巯基乙醇或二硫苏糖醇（DTT）、
牛血清白蛋白（BSA）
注意
1. 注意阅读商家提供的产品说明书，了解所使用工具酶 的浓度和最适作用条件，不要用错了Buffer和作用的
温度等；
2. 涉及到酶的操作时,一律在冰上操作；
1.8最佳，低于1.8说明有蛋白质，大于1.8说明有
RNA。 2. 质 量 检 测 ： 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 ： 一 般 有 三 条 带 （超螺旋、开环、线型三种构型），点样孔附 近无DNA带（无染色体DNA污染）。
3. DNA的定量
（1）荧光检测仪 Hoechst33258: 可 与 纳 克 级 的 DNA 结 合 ， 而 几 乎 没 有
Gus first exon Catalase intron Gus second exon Histidine tag
Bst EII
Mazie Ubiquitin promotor
Kpn I (11754) Sal I Hin dIII (11015) Bst XI
Nos poly-A
CaMV35S promoter
Xho I (9995)
PU1301
T-Border (right)
14336 bp
pVS1 sta
hygromycin (R)
Xho I (8901)
CaMV35S polyA T-Border (left)
Sac II
pVS1 rep
kanamycin (R)
pBR322 bom pBR322 ori
碱裂解法用到的试剂
Solution I: Tris.HCl （pH 7.5） 50 mM EDTA 10 mM RNase A 100 µ g/ml Solution II: NaOH 0.2 M SDS 1% Solution III: Final concentration KAC 1.32 M Using HAC to adjust pH to 4.8
TE (pH 8.0)： Tris.HCl （pH 8.0） EDTA （pH 8.0） 苯酚/氯仿 无水乙醇或异丙醇 10 mM 1 mM
试剂的作用（一）
Solution I: 重悬细菌; Solution II: 其中的SDS破坏细胞壁、膜，使细胞 内容物释放出来，NaOH 使DNA变性、碱基对打 开，使宿主染色体DNA双链分开，而闭合环状的 质粒DNA处于拓扑缠绕状态，两个环并不分开;
3. 使用移液器吸取酶时，tip头只能刚刚插入液面吸取；
4. 如果有多个反应，酶、buffer、水等应配制成mixture
再分装；
5. 各种成分加完后应混匀，然后在离心机上短暂离心。
BamH I：
G▼GATT C C CTAA▲G
Kpn I:
G GTAC▼C C▲CATG G
含外源DNA片段的载体(M812) 的限制性内切酶消化 目的载体（pUC19)
P(LAC) ORI
分子克隆的主要步骤
1. 两种载体的抽提
2. 琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量
3. 两种载体的限制性内切酶消化
4. 目的片段的回收及亚克隆载体的去磷酸化
5. 载体与外源DNA的连接 6. 感受态细胞的制备 7. 连接子转化感受态细胞 8. 重组子筛选及鉴定
质粒载体的提取
载体必备条件
质粒的提取
碱裂解法，主要包括4个步骤： 1. 细菌的培养：从平板上挑取单菌落接种于含相应抗生素的 培养基中，培养至对数生长后期；
2. 菌体的收集和裂解：通过离心收集菌体，NaOH/SDS处理
裂解细胞； 3. 染色体DNA 、RNA 及其它杂质的去除：碱处理后用冰冷的 KAC 缓冲液处理后离心； 4. 质粒的纯化及沉淀：苯酚氯仿抽提，乙醇或异丙醇沉淀。
开环
线型 超螺旋
不同末端克隆的要求及特点
外源DNA 克隆的要求
线状质粒DNA常 需用磷酸酶 （CIP）处理
特点
一般酶切位点常可保留 外源DNA会以两个方向插入 重组质粒可带有外源DNA的串联拷贝 一般酶切位点可保留, 非重组克隆背景低 不需CIP处理 外源DNA只以一个方向插入重组质粒中 不同酶切的平头可连接 非重组克隆的背景高 质粒及外源DNA连接处的酶切位点消失 （不同平端酶） 重组质粒可能带有外源DNA的串联拷贝
培养；
3. 吸取1.5 ml菌液，12000 g离心1分钟，收集菌体， 倒掉菌液；吸取1.5 ml菌液，再次收集菌体，尽 量将菌液倒干净； 4. 加入300l Solution I振荡打匀，重新悬浮细胞， 震荡混匀（注意：应彻底打匀沉淀或碎块）； 5. 加入300l Solution II，轻柔颠倒混匀，放置至 清亮，一般不超过5分钟（最好不超过2分钟）； 6. 加入300l Solution III颠倒混匀，放置于冰上10 分钟，使杂质充分沉淀；
（50 l反应体系，用1.5 ml tube，冰上操作） 质粒 DNA 30 l
BamH I (10u/µ l)
Kpn I (10u/µ l) 10×buffer ddH2O Total
1 l
x 9 = 9ul
1 l x 9 = 9ul
5 l 13 l 50 l x 9 = 45ul x 9 = 117ul
分别取5 l 酶切产物用0.8％－1.2%凝胶检测酶切效果
电泳检测
点样顺序： 1. Marker 2. pUC19质粒对照 3. pUC19质粒酶切产物
4. M812 质粒对照
5. M812 质粒酶切产物
2011本科生酶切图片
• • • • • lane1-4, pUC19酶切产物 Lane5 , pUC19质粒 Lane6， M812质粒 Lane7-10, M812 酶切产物 Lane11, DL-2000 marker,
RNA or SS－DNA
琼脂糖凝胶电泳检测
1. 将洗净、干燥的制胶板放入制胶槽中，水平放
置在工作台上；
2. 称取0.24 g琼脂糖于30 ml 0.5×TBE中，在微
波炉中使琼脂糖颗粒完全溶解，冷却至温热时
倒胶；
3. 凝胶凝固后，小心拔去梳子；
4. 将5µ l DNA样品与1µ l上样缓冲液和4µl H2O
7.
12000 g离心10分钟；
8.
吸取800l 上清液（注意：不要吸取到飘浮的杂 质）至另一个 1.5ml 离心管中，加入 2/3 体积的 异丙醇，室温下放置5分钟；
12000 g 常温离心15分钟；
9.
10. 倒尽上清，加500 l 75％乙醇浸洗除盐，（放 置片刻后离心5分钟，弃上清） 11. 彻底干燥后加40l 灭菌超纯水溶解； 12. 质粒的质量检测，-20℃保存。
试验中用到的抗生素和酶
氨苄青霉素（ Ampicillin ）： 其主要是通过抑制细胞
壁的合成杀死正在生长的大肠杆菌。