基因克隆步骤完整版
克隆基因的方法
克隆基因的方法随着生物技术的不断发展，克隆基因的方法已经成为分子生物学和基因工程领域中不可或缺的工具。
克隆基因的方法可以用来研究基因的结构、功能和调控机制，也可以用来制备重组蛋白、疫苗和基因治疗药物等。
本文将介绍克隆基因的方法，并探讨其在生物学和医学领域中的应用。
一、克隆基因的方法克隆基因的方法包括以下步骤：1. DNA提取：从目标生物体中提取DNA，可以使用化学方法或商业化的DNA提取试剂盒。
2. PCR扩增：使用聚合酶链式反应（PCR）扩增目标基因序列。
PCR是一种体外DNA合成技术，可以在短时间内扩增目标序列，具有高灵敏度和高特异性。
3. 限制性内切酶切割：使用限制性内切酶切割PCR产物，得到两端具有粘性末端的DNA片段。
限制性内切酶是一种特异性的DNA酶，可以切割DNA的特定序列，从而产生具有特定末端的DNA片段。
4. 连接：将两端具有粘性末端的DNA片段连接起来，形成重组DNA分子。
连接可以使用DNA连接酶或T4DNA连接酶等酶催化的反应。
5. 转化：将重组DNA分子导入到宿主细胞中，使其在宿主细胞中复制和表达。
转化可以使用化学方法或电穿孔法等。
6. 筛选：筛选带有目标基因的克隆。
筛选可以使用选择性培养基、荧光标记、PCR等方法。
二、克隆基因的应用1. 基因研究克隆基因的方法可以用来研究基因的结构、功能和调控机制。
例如，可以克隆和表达目标基因蛋白，研究其生物学功能和相互作用关系。
还可以使用基因敲除和转基因技术，研究基因在生物体发育、代谢和疾病等方面的作用。
2. 蛋白制备克隆基因的方法可以用来制备重组蛋白。
例如，可以克隆并表达具有生物活性的蛋白，如生长因子、激素、抗体等。
重组蛋白可以用于药物研发、生物制剂生产和科学研究等方面。
3. 疫苗研究克隆基因的方法可以用来研制和生产疫苗。
例如，可以克隆和表达病原体的抗原蛋白，制备亚单位疫苗或基因工程疫苗。
基因工程疫苗具有高效、安全、经济等优点，已经成为疫苗研究和生产的重要手段。
同源序列法克隆目的基因
同源序列法克隆目的基因同源序列法克隆是一种常用的基因克隆方法，用于获取目的基因的DNA序列。
同源序列法克隆的主要步骤如下：1. 设计引物：根据已知目的基因的序列，设计一对引物（即寡核苷酸片段），其中一个引物具有与目的基因的5'端相互匹配，另一个引物具有与目的基因的3'端相互匹配。
2. 提取模板DNA：从包含目的基因的源生物体中提取总DNA 或特定组织/细胞中的DNA作为模板。
3. 聚合酶链反应（PCR）扩增：在PCR反应中使用设计的引物和模板DNA来扩增目的基因的DNA序列。
PCR反应通过多次循环加热和冷却来产生大量DNA复制品。
4. 凝胶电泳分析：将PCR扩增产物与分子量标记物一起加载在琼脂糖凝胶上进行电泳分离。
通过比较扩增产物与标记物在凝胶上的迁移距离，可以确定是否成功扩增了目的基因。
5. 纯化目的基因：从PCR反应中纯化目的基因的扩增产物，一般使用凝胶切片、DNA纯化试剂盒等方法。
6. 连接到载体：将纯化的目的基因DNA与适当的载体（如质粒）进行连接。
这通常涉及酶切目的基因和载体的DNA，然后使用连接酶将它们连接在一起。
7. 转化宿主细胞：将连接的DNA导入宿主细胞中，使其自行复制和表达。
这可以通过转染、电穿孔或热激冲等方法实现。
8. 筛选与鉴定：通过对转化后的细胞进行选择性培养或检测，筛选出带有目的基因的克隆。
常用的筛选方法包括抗生素筛选、荧光筛选等。
9. 验证目的基因：最终需要验证克隆中是否成功插入了目的基因。
这可以通过DNA测序、限制性酶切、PCR等方法来进行。
同源序列法克隆是一种有效的基因克隆技术，可用于获得感兴趣的基因序列并进一步研究其功能、表达和调控机制等。
8-3-基因克隆的基本过程
1. 制备目的基因和相）PCR扩增特定基因 （四）人工合成
5
1. 制备目的基因和相）PCR扩增特定基因 （四）人工合成
6
1. 制备目的基因和相b + + -
8
2.DNA分子的体外连接
黏性末端 人工接头（linker）的使用 加入同聚物（homopolymer）尾 平端连接
9
2.DNA分子的体外连接
黏性末端 人工接头（linker）的使用 加入同聚物（homopolymer）尾 平端连接
10
2.DNA分子的体外连接
常用方法： 遗传学方法 免疫学方法 核酸杂交法 PCR技术 酶切鉴定
20
4.DNA重组体的筛选和鉴定
常用方法： 遗传学方法 免疫学方法 核酸杂交法 PCR技术 酶切鉴定
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思考题：
如 何 克 隆 p53 基 因 的 部 分 序 列 （GenBank登录号:AF136270.1）？
基因克隆的基本过程
1
基因克隆主要步骤： 制备目的基因和相关载体； 将目的基因和有关载体进行连接； 将重组的DNA导入受体细胞； DNA重组体的筛选和鉴定； DNA重组体的扩增、表达和其他研究。
3
1. 制备目的基因和相）PCR扩增特定基因 （四）人工合成
黏性末端 人工接头（linker）的使用 加入同聚物（homopolymer）尾 平端连接
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2.DNA分子的体外连接
黏性末端 人工接头（linker）的使用 加入同聚物（homopolymer）尾 平端连接
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2.DNA分子的体外连接
黏性末端 人工接头（linker）的使用 加入同聚物（homopolyme人工合成
DNA合成过程示意图
基因克隆技术的基本步骤
基因克隆技术的基本步骤随着科技的不断发展，基因克隆技术越来越成为生命科学研究的重要手段。
在生命科学、医学等领域，基因克隆技术的应用十分广泛。
本文将介绍基因克隆技术的基本步骤。
一、选择载体DNA在基因克隆中，载体DNA是将外源DNA（待克隆DNA）转化进细胞的基础。
目前主要的载体DNA是质粒，其一般大小在1至20 kb之间。
质粒的选择应遵循以下几个原则：1. 合适的选体标识。
大多数载体都有一些明显的特征，例如特定的抗生素抗性或颜色，因此选择能够用于筛选的选体标识是基本原则之一。
2. 合适的克隆位点。
载体DNA上应具有克隆位点，以便将待克隆DNA插入到其中。
3. 可重复复制。
质粒必须带有在细胞内自我复制所必需的序列。
二、切割DNA通过限制性内切酶切割将待克隆DNA和载体DNA裂解成短的DNA片段。
这些片段在电泳时可以按照大小区分开，以便以后的克隆工作。
三、将外源DNA插入载体DNA外源DNA和载体DNA的连接需要使用DNA连接酶，如DNA ligase。
方法是将两个DNA片段的末端和连接起来形成一个完整的DNA分子。
连接成功后，形成了一个混合DNA。
由于载体的复制和传递，待克隆DNA也可以被大量复制。
四、将混合DNA转化进宿主细胞将混合DNA转化进宿主细胞是整个克隆过程中至关重要的一步，因为宿主细胞受到质粒的干扰，催化质粒遗传信息的传递与表达。
大多数质粒都需要在易感受性细胞中才能存在并复制。
宿主细胞的选择是非常重要的，有些宿主细胞对外源DNA的吸收和扩增效率非常高，充分利用每一个获得的外源DNA分子。
五、筛选克隆基因最后一步是克隆基因的筛选，筛选克隆基因需要具有合适的筛选方法。
常用的筛选方法是使用抗生素抗性，因为载体上通常带有抗生素基因，能够筛选那些携带载体克隆块的细胞。
克隆基因的筛选方法不止于抗生素抗性，还可以根据不同的克隆目标进行选择。
例如，当克隆目标是蛋白质时，可以使用融合蛋白法克隆兴趣的编码DNA，并利用其蛋白质结构的特点分离出融合蛋白。
基因克隆的顺序
基因克隆的顺序
基因克隆的顺序通常包括以下步骤：
1. 选择目标基因：确定需要克隆的基因，可以是某个特定的基因，也可以是一段DNA序列。
2. 提取DNA：从源生物体中提取目标基因的DNA，通常使用DNA提取试剂盒来提取。
3. 制备质粒：选择一个适当的质粒，将其准备好作为目标基因的载体。
质粒通常是一段环状的DNA分子，可以自复制并在细胞中稳定存在。
4. 执行DNA切割：使用限制性内切酶将目标基因和质粒切割成相应的DNA片段。
内切酶是能够识别特定DNA序列并在其特定的位置进行切割的酶。
5. 连接DNA片段：将目标基因的DNA片段与质粒的DNA片段连接起来。
这可以通过DNA连接酶来实现，DNA连接酶能够催化两个DNA片段的连接。
6. 转化宿主细胞：将连接好的质粒转化到宿主细胞中，通常使用细菌作为宿主细胞。
转化可以通过电穿孔、化学方法或热激转化等方式进行。
7. 筛选重组细胞：利用筛选性培养基或标记基因等方法筛选出含有重组质粒的
细胞。
8. 纯化重组质粒：从筛选出的重组细胞中提取重组质粒。
9. 分析重组质粒：对提取出的重组质粒进行测序、限制性酶切等分析，确认克隆基因的准确性。
10. 表达目标基因：如果希望表达克隆的基因，可以将重组质粒转化到表达宿主细胞中，例如真核细胞或类似细胞。
需要注意的是，基因克隆的具体步骤可能会因实验目的、实验方法和克隆体的复杂性而有所不同。
利用同源序列法克隆基因的基本步骤
利用同源序列法克隆基因的基本步骤一、概述基因克隆是现代生物学研究中的重要技术手段之一，其主要目的是在体外构建包含目标基因的DNA分子。
同源序列法是一种常用的基因克隆方法，通过在一个已知基因的上下游区域找到相同的DNA序列，然后利用PCR或限制酶技术将目标基因从细胞中扩增、截取并插入到适当的质粒载体中。
本文将介绍利用同源序列法克隆基因的基本步骤。
二、材料与设备准备1. 目标基因的DNA序列- 确定目标基因的DNA序列，并设计引物2. PCR试剂盒3. DNA酶- 包括限制酶和连接酶4. DNA纯化试剂盒5. DNA电泳仪器6. 质粒载体及相关试剂7. 载体宿主细胞三、PCR扩增目标基因1. 初始步骤- 设计适当的引物，确保引物的序列与目标基因的同源序列相匹配 - 准备PCR试剂盒和PCR仪器2. PCR扩增- 按照试剂盒说明书的操作步骤，进行PCR扩增反应- 调节PCR反应条件，使扩增得到高特异性和高产量的目标DNA片段四、DNA片段纯化1. 提取PCR产物- 使用DNA纯化试剂盒，将PCR产物从反应混合物中纯化出来2. 纯化后的DNA片段检测- 使用DNA电泳仪器，检测纯化后的DNA片段是否符合预期大小五、限制酶切与质粒载体处理1. 限制酶切- 根据预先设计好的限制酶切位点，对目标基因DNA片段和质粒载体进行限制酶切2. 质粒载体处理- 在限制酶切反应后，使用连接酶将目标基因DNA片段连接到质粒载体上六、DNA片段转化与宿主细胞处理1. DNA片段转化- 将连接好的质粒载体转化到适当的宿主细胞中2. 宿主细胞处理- 处理转化后的宿主细胞，筛选带有目标基因的正反应克隆子七、目标基因测序确认1. 选取克隆子- 从宿主细胞中分离带有目标基因的正反应克隆子2. 目标基因测序- 对克隆子进行测序确认，确保目标基因的序列正确无误八、结语利用同源序列法克隆基因是一项关键而复杂的实验技术，需要准备充分的材料与设备，严格按照步骤进行操作。
整个基因克隆实验规程完整
整个基因克隆实验规程完整Document serial number【KK89K-LLS98YT-SS8CB-SSUT-SST108】一、组织总RNA的提取相关试剂：T rizol；氯仿；苯酚；异丙醇；75%乙醇；RNase-free水相关仪器：制冰机；液氮&研钵/生物样品研磨仪；高速离心机；移液器（1ml、200μl、100μl/50μl）；涡旋振荡仪；恒温金属浴。
相关耗材：解剖工具，冰盒，离心管，离心管架，吸头（1ml，200μl/300μl），一次性手套，实验手套。
实验步骤1.取暂养草鱼，冰上放置一段时间，然后解剖，剪取肠道50~100mg，放入研钵中，加入液氮迅速研磨，然后加入1ml 预冷TRIzol试剂，充分研磨至无颗粒物存在。
2.转移到离心管中，室温放置5min，使细胞充分裂解；3.按1ml Trizol加入200μl氯仿，盖上盖子，迅速充分摇匀15s，然后室温放置3min；4.4℃，,12000g 离心15min；此时混合物分为三层，下层红色的苯酚氯仿层，中间层和上层无色水相；RNA存在于无色水相中；5.小心吸取上清液，千万不要吸取中间界面，否则有DNA污染；转移至一个新的离心管，加入等体积的异丙醇，轻轻混匀；6.室温放置10min；4℃，,12000g 离心10min；7.弃上清，加入1ml 75%乙醇洗涤；涡旋，悬浮沉淀；4℃，,12000g 离心5min；8.弃上清；可以再次用75%乙醇洗涤沉淀；9.弃上清；用移液器轻轻吸取管壁或管底的残余乙醇，注意不要吸取沉淀；室温放置5min晾干沉淀；（RNA样品不要过于干燥，否则极难溶解）10.沉淀中加入30μl RNase-free水，轻弹管壁，使RNA溶解。
RNA质量检测相关试剂：溴酚蓝， TEB/TAE电泳缓冲液，溴乙锭（EB）相关仪器：（超微量分光光度计，移液器（2.5μl 或2μl 规格，10μl规格），电子天平，电泳仪，电泳槽，凝胶成像仪，微波炉，制冰机）相关耗材：（无菌无绒纸，吸头，离心管架，PCR管，PCR管架，锥形瓶，烧杯，一次性手套，实验手套，冰盒）（1）RNA纯度的检测：测定其OD260和OD280的值，根据其OD260/ OD280的比值，当其比值在1.9~2.1之间，说明提取的总RNA纯度比较高，没有蛋白质和基因组的污染。
cdna基因克隆的基本原理和流程
一、CDNA基因克隆的基本原理CDNAplementary DNA）是DNA的互补序列，通过反转录酶将mRNA作为模板合成的一种DNA。
CDNA基因克隆是利用逆转录酶将mRNA逆转录合成cDNA，并通过PCR或其他方法将cDNA插入到质粒载体中，实现对目标基因的克隆。
二、CDNA基因克隆的流程1. RNA提取：首先需要从细胞中提取出总RNA，可以使用TRIzol等试剂进行RNA的提取纯化工作。
2. 反转录合成cDNA：将提取得到的RNA作为模版，利用逆转录酶进行cDNA的合成。
反转录反应通常包括RNA模版、随机引物、dNTPs、逆转录酶和缓冲液，并经过一系列温度循环反应，将mRNA 逆转录成cDNA。
3. cDNA纯化：为了避免反转录反应中产生的非特异性产物和杂质，需要对反转录反应产物进行纯化。
4. cDNA扩增：对cDNA进行PCR扩增，以获得目标基因的cDNA 片段。
PCR反应体系包括cDNA模板、引物、dNTPs、Taq聚合酶和缓冲液，通过一系列温度循环反应，扩增目标基因cDNA片段。
5. 酶切与连接：将PCR扩增得到的cDNA片段与质粒载体进行酶切，并在两者的黏端上连接。
6. 转化：将连接得到的质粒转化入大肠杆菌等细菌中，使其进行复制。
7. 筛选与鉴定：通过筛选和鉴定，选出携带目标基因cDNA片段的质粒，进行测序和分析，最终确定目标基因序列。
三、CDNA基因克隆的应用CDNA基因克隆技术已广泛应用于基因克隆、基因表达等多个领域。
在科研领域中，通过CDNA基因克隆技术可以方便快捷地获得目标基因的cDNA，实现对目标基因的研究和功能分析；在医药领域，CDNA基因克隆技术也被应用于基因治疗、蛋白表达等方面。
总结：CDNA基因克隆是一种重要的基因工程技术，通过反转录酶合成cDNA并将其插入到质粒中，可以方便地获取目标基因序列，具有广泛的应用前景。
掌握CDNA基因克隆的基本原理和流程对于开展相关实验研究具有重要意义。
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1总RNA提取
令狐采学
(1) 液氮研磨或冰上匀浆实验资料；先将1mlTrizol加到离心管中待用
(2) 将研磨好的样品加到离心管中混匀，室温放置5 min；掀开离心机预冷
(3) 加200 µL氯仿，振荡15 sec，室温放置3 min，分层；
(4) 4oC，12,000g，离心15 min；
(5) 取上清，加500 μL异丙醇，混匀，室温放置10 min；
(6) 4oC，12,000g，离心10 min；
(7) 弃上清，加1 mL75%乙醇，漂浮洗涤沉淀，振荡充分；再用100%乙醇清洗
(8) 4oC，7,500g，离心5 min；
(9) 弃上清，离心，用枪吸取过剩液体，放在超净台里干燥后，加50 μL DEPC水，－80oC保管。
此操纵中所用到的器皿均需经过DEPC灭活RNA酶处理。
提取的总RNA需经RNA电泳检测质量，并用紫外分光光度计测定浓度。
OD260值为核酸的吸收值，OD280值为卵白的吸收值，OD260/280值在1.82.0间一般说明该核酸卵白含量在允许的规模内，可正常使用；另外还有OD230值为多糖和酚类的吸收值，比较干净的核酸OD260/230值能达到2.2左右。
RNA浓度计算公式：总RNA 浓度
（µg/mL）=A260×稀释倍数×40。
2反转录/cDNA第一链的合成
纯化RNA以去除基因组DNA，操纵按TaKaRa公司的PrimeScript RT reagent with gDNA Eraser(Perfect Real Time)说明书进行。
其体系为：
Total RNA 1μg
5× gDNA Eraser Buffer 2μL
gDNA Eraser 1μL
RNase Free dH2O 补齐至10μL 条件为：42oC，2min；
RNA纯化后，即可进行反转录。
其体系为：
5×PrimeScript Buffer 2（for Real Time）4μL PrimeScript RT enzyme mix Ⅰ1μL
RT Primer Mix 1μL
上一步的反响液10μL
RNase Free dH2O 补齐至20μL 操纵条件为：
(1) 37oC放置15 min； (2) 85oC，5 sec； (3) 4oC保管。
3 PCR
按TaKaRa公司的Premix Taq Version 2.0操纵，，PCR反响体系如下：
Premix Taq 25μL
模板5μL
引物1 (10 μM)1μL
引物2 (10 μM)1μL
ddH2O 18μL PCR反响条件为：94°C预变性5min；94°C变性30s，53°C 退火30s，72°C延伸30s，循环36次；72°C延伸10min。
PCR反响完毕，取5μL反响产品进行1%琼脂糖凝胶电泳（若割胶回收则用10μL反响产品）。
4 基因克隆及测序
4.1 PCR产品切胶回收
将PCR产品用1%琼脂糖凝胶进行电泳，在紫外灯下观察并切下预期年夜小的DNA片段。
使用TIANGEN公司的Universal DNA Purification Kit割胶回收试剂盒进行纯化，步调如下：
(1)平衡吸附柱：向吸附柱CB2中（吸附柱放入收集管中）加入500μL平衡液BL，13,400×g离心1 min，倒失落收集管中的废液，吸附柱CB2重新套回收集管中；
(2) 按100 mg agarose胶加入100μL溶液PC，置于50oC中10 min左右，中途混匀几次，至胶完全融化；
(3) 将样品倒入一个吸附柱CB2中（吸附柱放入收集管中），室温下13,400×g离心1 min，倒失落收集管中的废液，吸附柱CB2重新套回收集管中；
(4)向吸附柱CB2中加入600μL漂洗液PW（加乙醇），室温下13,400×g离心1 min，倒失落收集管中的废液，吸附柱CB2重新
套回收集管中；
(5) 重复上一步调；
(6) 将吸附柱CB2放入收集管中，室温下13,400×g离心2 min，尽量除去漂洗液，将吸附柱置于室温放置数分钟，完全晾干；
(7) 将柱子套入一新的灭菌1.5 mL离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加50µL洗脱缓冲液，室温放置2分钟，13,400×g室温离心2 min，收集到的洗脱液即为回收的DNA纯化液；
(8) 取5µL的纯化液体进行1%琼脂糖凝胶电泳，以检查纯度，并丈量溶液中DNA含量。
4.2目的片段与载体连接
(1) 胶回收产品与T载体连接体系，参考Takara公司pMD18T 载体的试剂盒说明书。
在灭菌的0.5 mL 离心管中配制如下溶液（10 μL）：
回收DNA 4μL
Ligation Solution 5μL
pMD18T Vector 1μL
(2) 16oC反响30分钟，所得产品保管于－4oC冰箱备用。
4.3连接产品转化E.coli DH5α
(1) 将5 µL连接产品加入到100µLE.coli DH5α感受态细胞中，轻轻旋转离心管混匀内容物，冰上静置30 min；
(2) 42oC水浴热激转化90 sec，立即放回冰上，放置3 min；
(3) 每管加入500µL LB培养基（室温放置），37oC 160180 rpm 振荡培养4560 min，使菌体苏醒并表达抗性基因；
(4) 在含有Amp（100 µg/mL）的选择性平板上加入60100µL 菌液，用无菌涂布棒轻轻涂布均匀后，用Parafilm膜封好；
(5) 将培养皿正放，37oC约50 min，待液体全部吸收后，倒置平板继续培养1016 h。
4.4转化子的筛选及鉴定
(1) 用无菌枪头挑取LB平板上35个单菌落，辨别接种到3.5 mL LB液体培养基中（含100 µg/mL Amp），37oC，165rpm振荡培养1012 h；
(2) 用5µL菌液做模板，进行PCR鉴定（50 µL 体系），操纵步调同3。
阳性菌液由Invitrogen生物公司测序鉴定，余下的菌液4oC保管备用；
(3) 测序结果在Genbank数据库中进行比对阐发。