基因工程在生物制药技术中的应用

基因工程在生物制药技术中的应用

摘要

本文简述了基因工程在生物制药技术中的应用进展，主要对包括基因工程制药的流程，基因工程制药的技术手段，基因工程在药物生产中的应用，以及基因工程在新药开发中的应用等进行了介绍，随着对基因工程研究的不断深入，基因工程将会更多的应用在制药领域当中，并发挥不可替代的作用。

Application of biopharmaceutical in genetic engineering techniques

This thesis describes the techniques progress of application about the genetic engineering in the biopharmaceutical, introducting what contain the processes of genetic engineering pharmaceutical , the technical means of genetic engineering pharmaceutical, and application of genetic engineering in new drug development and so on. With the research on genetic engineering increasing. Genetic engineering will be more applicated in the pharmaceutical sector and play an irreplaceable role.

1.基因工程制药

基因工程制药是指按照人们的意图, 将外源基因整合入宿主基因组中, 表达具有生物学活性的蛋白药物。基因工程技术的迅速发展不仅使医学基础学科发生了革命性的变化, 也为医药工业发展开辟了广阔的前景, 以DNA重组技术为基础的基因工程技术改造和替代传统医药工业技术已成为重要的发展方向【1】。

2.基因工程制药的流程

获得目的基因( DNA特定片段)→选择基因的合适运载体( 另一种DNA 分子) 组建重组质粒→( 将重组DNA 引入细菌或动植物细胞并使其增殖) 构建工程菌( 或细胞) →培养工程菌→( 蛋白质、多肽、酶、激素、疫苗、细胞生长因子及单克隆抗体等) 产物分离纯化、除菌过滤→半成品检定→成品检定→包装。

3.基因工程制药的技术手段

3.1 PCR技术

聚合酶链式反应【2】是一种在体外模拟天然DNA复制过程的核酸扩增技术。该法由Mullis等人于1985年发明, 并于1993年获得了诺贝尔化学奖。PCR 技术可分为定性PCR和定量PCR。定性PCR 技术包括: 反转录PCR (RT-PCR), 是从非常少量的mRNA样品构建大容量cDNA文库的方法,还发展出实RT2PCR用于定量实验【3】;多重PCR(multiplex PCR),是指在同一PCR 反应体系中加入多对不同的引物,以扩增同一模板的不同区域;反向PCR,该法可以对一个已知DNA片段两侧的未知序列进行扩增和研究;锚定PCR,现称为cDNA末端快速扩增技术【4】。定量PCR技术以实时PCR为代表, 其基本原理是在PCR反应体系中引入荧光标记分子,对每一反应时刻的荧光信号积累进行实时监测,计算出PCR产物量,或通过标准曲线法得出初始模板量。

3.2 基因芯片

基因芯片, 是生物芯片的一种, 其基本技术包括: 核酸方阵的构建、样品的制备、杂交和杂交图谱的检测及读出。根据用途不同可分为表达谱芯、测序芯片和诊断芯片。其中表达谱芯片的应用最为广泛, 可用于基因功能分析、疾病发生机制的探讨及药物研究和筛选【5】。( 1)确定药靶基因: 通过比较正常细胞与异常细胞表达谱之间的差异, 从而确定药靶基因。( 2) 监测药物治疗前后的基因表达变化:该监测可有3方面的作用。一是用于研究药物作用机制,

通过监测基因表达的变化, 可研究药物作用途径和对细胞信号转导的影响, 从而了解该药物的作用机制; 二是用于研究药物毒理, 从表达谱的改变和异常表达, 便可分析药物毒理; 三是用于药物筛选,利用用药前后表达谱的改变, 通过分析病理、生理、生化原理, 能高效地筛选出新的药物或先导化合物。

3.3 外源基因的表达

导入宿主细胞的外源基因, 通过基因表达得到相应的蛋白质产物。根据宿主细胞的不同可分为原核细胞表达系统和真核细胞表达系统。在外源基因表达时, 通常把一个报告蛋白的基因与一个目的蛋白的基因融合在一起, 形成融合蛋白, 用于目的蛋白的检测与纯化。常用的报告蛋白有B2半乳糖苷酶、谷胱甘肽S2转移酶、绿色荧光蛋白以及硫氧还蛋白等。其中值得一提的是GFP, 2008年8月有3位科学家因此获得诺贝尔化学奖: 日本科学家Osamu Shimomura、美国科学家Martin Chalfie、美籍华人科学家钱永健。除了直接标记目的蛋白用于检测与纯化外, 还可利用某些GFP具有荧光共振能量转移的现象, 用于蛋白质折叠【6】、蛋白质2蛋白质相互作用【7】、信号转导通路【8】等方面的研究。

3.4 基因工程分离大分子

基因大分子的分离主要指质粒和基因组DNA的分离。质粒分离的常用方法有碱变性抽提法、煮沸法、去污剂裂解法、质粒DNA释放法、酸酚法等。质粒在基因工程中最常用来做成各种克隆载体或表达载体。质粒载体还可用于RNA干扰的研究 (由于这一技术的研究和应用, 美国科学家Andrew Z. Fire博士和Craig C. Mello博士获得了2006年度的诺贝尔生理学或医学奖)。基因组DNA 的分离通常采用酚2氯仿法、基因文库、Southern杂交以及PCR扩增技术等。其中基因文库是指含有某种生物基因组不同基因片段的一群DNA 重组体克隆, 包括cDNA 文库和基因组DNA文库。最近又有研究者利用名为chum2RNA的小分子RNA 建立非PCR 扩增的单细胞cDNA文库【9】。

4 基因工程在药物生产中的应用

4.1 重组表达生理活性物质

激素是由内分泌腺和特异细胞产生的含量极低的一类生物分子, 作为一类化学信使或信号分子引发专一的生理效应。激素在体内含量极少, 来源困难, 且具有种间特异性, 因此利用基因工程生产重组激素成为一种既安全又经济的策略。另外,利用基因工程技术不仅可以得到天然的激素蛋白, 还可以通过定点突变的方法有目的地改造蛋白的结构,获得性能更为优越的或者是全新的激素药物【10】。

4.2 基因工程疫苗

基因工程疫苗是使用重组DNA技术克隆并表达保护性抗原基因, 利用表达的抗原产物活重组体本身制成的疫苗。主要包括【11】 (1)基因工程亚单位疫苗: 将基因工程表达的蛋白抗原纯化后制成的疫苗。 (2)基因工程载体疫苗: 利用微生物做载体, 将保护性抗原基因重组到微生物体中,使用能表达保护性抗原基因的重组微生物制成的疫苗。 (3)核酸疫苗: 使用能够表达抗原的基因本身制成的疫苗。 (4)基因缺失活疫苗: 通过分子生物学技术去除与毒力有关的基因获得的缺失突变毒株制成的疫苗。(5)蛋白质工程疫苗: 将抗原基因加以改造, 使之发生点突变、插入、缺失、构型改变, 甚至进行不同基因或部分结构域的人工组合, 以期达到增强其产物的免疫原性, 扩大反应谱, 去除有害作用或副反应的一类疫苗。

4.3 基因工程抗体

DNA重组技术与抗体基因结构功能的研究相结合,根据研究者的意图在基因水平对抗体分子进行分割、拼接或修饰, 甚至是人工全合成后导入受体细胞表达, 即产生新型基因工程抗体, 主要应用于诊断试剂和治疗性抗体【12】。

基因工程抗体的改造包括以下途径(1)鼠单克隆抗体的人源化:克服鼠源抗体的免疫原