真菌临床检验技术
【专家共识】临床微生物实验室真菌检测能力建设基本要求
临床微生物实验室真菌检测能力建设基本要求【专家共识】近年来侵袭性真菌感染呈持续增多趋势，准确、早期诊断是治疗疾病的关键。
然而，目前我国临床实验室真菌检测能力离临床诊治需求尚有较大差距，亟待改进。
国家卫生计生委办公厅于2016年底发布了《关于提高二级以上综合医院细菌真菌感染诊疗能力的通知》（国卫办医函[2016]1281号），要求在2020年以前加强临床细菌真菌感染诊疗体系的建设，促进抗菌药物的合理应用，维护人民群众健康。
本共识的制定旨在建立临床微生物实验室真菌检测能力基本要求，推动真菌检测技术的普及和人员能力的提升，从而提高综合医院真菌感染诊疗能力。
一、术语和定义（一）酵母菌单细胞真菌呈圆形或卵圆形，以出芽方式繁殖，称为酵母菌（yeast）。
临床致病的酵母菌主要包括念珠菌、隐球菌、毛孢子菌等。
（二）丝状真菌多细胞真菌有菌丝和孢子，菌丝延长分枝，交织成团，称为丝状真菌（filamentous fungi）。
又称霉菌（mold）。
临床重要的丝状真菌包括曲霉菌、毛霉菌、镰刀菌等。
（三）双相型真菌有些真菌可因环境条件（如营养、温度、氧气等）改变，由一种形态转变为另一种形态，称为双相型真菌（dimorphic fungi），如球孢子菌、组织胞浆菌、芽生菌、孢子丝菌、马尔尼菲篮状菌等。
这些真菌在体内或在含动物蛋白的培养基上，37 ℃培养时呈酵母相；而在普通培养基，25 ℃培养时呈霉菌相。
二、环境和设施要求真菌实验室环境和设施的设计应确保实验的质量和生物安全。
（一）环境要求真菌实验室应与细菌、病毒等实验室区分，以防发生交叉污染。
其面积以满足工作和安全要求为宜，合理布局。
在建设实验室或开展实验活动之前，应进行生物危害评估。
（二）基本设施设置防飞虫纱窗和门禁，有充足的照明、应急灯、通风、供水、供电、紧急疏散标识及信息系统，工作区设有洗手池、应急淋浴和洗眼装置；门外有生物安全级别标识[1]。
配置生物安全柜和不同温度培养箱（至少包括25~30 ℃以及35~37 ℃）。
检验科真菌检验流程PIM
深部感染分布于自然界，如土壤、腐败有机物、粮食和饲料等，有时也存在 于正常人体的皮肤和粘膜表面。
（一）分类和命名
其中大多数曲霉只发现了无性阶段，它们归属于半知菌亚门、丝孢菌纲、 丝孢菌目、丛梗孢科，少数种具有性阶段归入子囊菌亚门、不整子囊菌 纲、散囊菌目、散囊菌科。其中对人致病的曲霉主要有烟曲霉
全国临床检验操作规程
真菌病原学检验程序
临床标本
直接检查
分子生物学检测 直接镜检
经固定标本染色 墨汁法 法：亚甲蓝染色 染色法 法、革兰染色法、 P法A。S、荧光染色脑 痰 脓
脊 液汁 液
动
分离培养
物
实
沙氏培养基 验
KOH法
25°C 37°C
毛发 指甲 皮屑 脓汁 痰液
观察菌落 菌丝型 酵母型
镜 小生 检 培化
曲霉可侵犯机体许多部位，尤其是呼吸系统，引起肺曲霉病。曲霉可局限在肺内感 染也可播散到其他器官，甚至引起全身性感染。曲霉还可诱发超敏反应引起过敏性 支气管肺曲霉病。
有些曲霉可产生毒素引起食物中毒，有的毒素如黄曲霉毒素、杂色曲霉素有致癌作 用，特别是黄曲霉毒素与人类原发性肝癌的发生密切有关。
深部感染真菌检验
养反 应
病
检
检
理
测
测
组
抗
抗
织
原
体
标
本
葡聚糖
PAS
HE 甘露聚糖
全国临床检验操作规程（第四版） 783页图4-6-1
2015年3月第一版
真菌鉴定程序
标本的采集、运送和保存
真菌的鉴定范文
真菌是一种广泛存在于自然界中的生物，也是一类常见的病原体。
在研究真菌时，鉴定其特征和分类是非常重要的步骤。
对真菌的鉴定需要注意其不同的形态、生长环境和遗传特征等多方面的因素，因此准确地识别真菌是一个相对困难的任务。
本文将讨论目前常用的真菌鉴定方法，包括形态学鉴定、遗传学鉴定和分子生物学技术。
1.形态学鉴定在真菌初步分类时，形态学鉴定是基本的方法。
这一方法通常会涉及到真菌菌丝体和子实体的形态特征。
菌丝体通常呈细丝状或短棒状，并且有时会形成分支或团块。
对于子实体，其外观（包括色彩、形状、质地和大小）以及内部的菌柄、孢子和异型等部分的特征都是鉴定的关键要素。
除了以上主要的形态学鉴定方法之外，还可以通过对真菌产生的代谢产物进行鉴定。
有些真菌会产生一些特殊的化合物，如次生代谢物等，这些代谢产物对真菌鉴定也有一定的帮助。
例如，人们可以通过对真菌产生的次生代谢物进行分析来判断其属于哪一品种或属。
2.遗传学鉴定随着技术的进步，越来越多的人选择了通过遗传学鉴定真菌。
这一方法建立在基因序列比对的基础上，主要利用真菌DNA序列的不同构成来对其进行分类。
在这一技术中，人们可以对真菌线粒体DNA序列、大肠杆菌RNA多序列比较和嵌合子单链多态性等进行分析。
遗传鉴定提供了一种非常准确的真菌鉴定方法，由于其几乎可以排除因为环境影响而导致的误判。
3.分子生物学技术在分子生物学技术中，PCR（聚合酶链式反应）和DNA杂交技术是最广泛应用的技术之一。
通过PCR技术，可以从真菌样品中扩增出自RNA的DNA片段（例如其特征序列），以此来进行鉴定。
DNA杂交技术则是基于双链碱基对形成的互补性，将RNA或DNA探针与指定标记DNA 杂交，从而实现对真菌物种的准确识别。
这些技术未来将会得到更广泛的应用和发展。
真菌的鉴定是一个相对复杂的过程，需要经验丰富、技术优秀的人员协助完成，同时多种技术的结合也是一个比较可行的解决方案。
随着科学技术的进步，我们可以更加准确地对真菌进行鉴定，从而更好地了解和利用这些生物的各个方面。
真菌检验
蒸馏水100 ml配制：用蒸馏水将氯化钠溶解即可。 25、观察菌落形态时应注意什么？ 观察菌落形态时应注意：（1）菌落性质，是酵母菌还是霉菌；（2） 菌落大小，一般病原性真菌菌落小，而条件致病性真菌菌落大；（3） 菌落颜色，一般病原性真菌颜色淡，污染真菌颜色深。（4）致病性 真菌菌落下沉，污染性真菌菌落不下沉；致病性真菌有时使培养基 开列，但污染霉菌很少引起培养基开列。 26、分离皮肤真菌的皮肤真菌实验培养基是什么？ 培养基是：（DTM）含蛋白胨、葡萄糖、酚红、放线菌酮、庆大霉素、 四环素等成分。由于皮肤真菌的代谢产物呈碱性，以致其生长周围 的培养基呈红色。 27、分离新生隐球菌的选择培养基是什么？ 分离新生隐球菌的选择培养基是左旋多巴-枸橼酸铁和咖啡酸培养 基，因新生隐球菌有酚氧化霉（Plrno oxidase）活性，此霉与左旋 多巴和枸橼算铁反映时，能氧化O-联苯酚形成黑素而呈褐色至黑色， 或酚氧化霉和咖啡酸作用而显棕色菌落。 28、真菌培养的方法有几种？各自优缺点是什么？ 培养方法有平皿培养、大试管培养和玻片培养等。平皿培养的优点 是表面较大可使标本散布，便于观察菌落形态，但水分易蒸发，只 能培养生长繁殖较快的真菌，如假丝酵母菌、隐球菌。大试管培养 的优点是水分不易蒸发，主要用于皮肤癣菌的培养和真菌菌种的保 存。玻片培养（为量培养、小培养）是将培养皿的真菌培养切成一 个1cm*1cm的小方块在无菌载玻片中央，然后将真菌点种于小方块培 养基的一侧，再盖上无菌盖玻片后培养，培养后将其盖玻片放入另 一载玻片上于显微镜下观察菌丝和孢子，可用于真菌菌种的鉴定。 29、真菌的生化反映有哪些？ 检验真菌常用的生化反映有糖（酵）类发酵试验、同化碳源试验、 同化氮源试验或利用硝酸钾试验、牛乳分解试验、酚氧化酶试验、 明胶液化试验和脲酶试验等。主要用于检验深部感染的真菌。 30、配置培养基的一般步骤是什么？ （1）按要求称取脱水培养基，倒入所要求量的蒸馏水中，反复搅拌 使各成分混合成均匀混悬液。（2）各成分混合均匀后以文火缓慢加 热并不断搅拌，煮沸1 min，不能过热，以免破坏有效成分。（3） 分装试管应在高压灭菌前，而分装平皿应在高压灭菌后，均待培养 基冷却至45-50度时分装。（4）高压灭菌一般为118-121度，6.81kg
临床微生物检验技术学习指导
临床微生物检验技术学习指导
1.掌握临床微生物专业的基础理论，包括细菌、真菌、病毒等微生物的形态与结构、生理特性、遗传与变异、感染与免疫。
熟悉微生物感染的防治原则、分类与命名等基本理论。
2.掌握微生物专业相关的仪器分析、免疫学、质量管理、医学统计学等专业技术知识。
（二)相关专业知识
1.熟悉感染性疾病的相关临床知识。
2.熟悉临床药理学的相关知识。
3.了解与本专业密切相关的专业知识如细胞生物学。
二、学科新进展医学全在线搜集整,理
1.熟悉新发现微生物及其所致感染性疾病的主要特点，如严重急性呼吸综合征（SARS)相关冠状病毒、禽流感病毒和猪链球菌等。
2.了解临床微生物检验的新方法和新技术，如蛋白质或核酸的检测芯片等；及时掌握美国CLSI/NCCLS颁布的体外药物敏感试验指南。
3.熟悉新发现的细菌耐药机制及耐药菌检测方法的新进展。
4.了解微生物分类与命名的新进展。
临床微生物学检验
临床微生物学检验引言临床微生物学检验是一种通过检测和分析患者体内微生物的存在和活动水平来帮助诊断和治疗感染性疾病的方法。
微生物学检验可以确定感染的原因和类型，并确定适当的抗生素治疗方案。
本文将介绍临床微生物学检验的概念、常见的检验方法和其在临床实践中的应用。
临床微生物学检验的概念临床微生物学检验是通过收集患者样本（如血液、尿液、血液培养物等）并对其中的微生物进行培养、分离和鉴定来确定感染病原体的方法。
它涉及一系列实验室操作和技术，包括细菌培养、抗生素敏感性测试、鉴定和分子生物学方法等。
这些方法可以帮助确认感染病原体的存在、确定其感染类型（细菌、真菌、病毒等）以及选择适宜的治疗药物。
临床微生物学检验的常见方法细菌培养细菌培养是一种常见的微生物学检验方法，它涉及将患者样本置于培养基中以促进微生物的生长。
不同类型的培养基可以支持不同类型的微生物生长，如常见的血液琼脂培养基可用于细菌培养。
细菌培养的时间可以从几小时到几天不等，具体取决于患者样本中微生物的增殖速度和种类。
抗生素敏感性测试抗生素敏感性测试是一种用于确定感染病原体对不同抗生素的敏感性和抵抗性的方法。
常见的抗生素敏感性测试方法包括纸片扩散法和微量稀释法。
这些测试可以帮助医生选择最适合的抗生素治疗方案，以避免抗生素的滥用和抵抗性的产生。
分子生物学方法分子生物学方法在临床微生物学检验中也扮演着重要的角色。
这些方法可以通过检测微生物的核酸（如DNA或RNA）来快速鉴定微生物的存在和类型。
其中常用的方法包括PCR （聚合酶链反应）和实时荧光定量PCR。
分子生物学方法具有高度的特异性和敏感性，可以快速准确地检测微生物。
临床微生物学检验的应用临床微生物学检验在临床实践中具有广泛的应用。
它可以帮助确定感染的病原体，指导治疗方案的制定和调整，并监测治疗的疗效。
以下是临床微生物学检验在不同感染疾病中的应用示例：细菌感染在细菌感染的诊断和治疗中，临床微生物学检验可以帮助确定感染的菌种、菌株的数量和敏感性，从而选择适当的抗生素治疗方案。
临床医学检验知识速记--(真菌)微生物学
临床医学检验知识速记--（真菌）微生物学真菌(fungus)是一类具有典型细胞核，有核膜和核仁，胞浆内有完整的细胞器，无根、茎、叶，不含叶绿素，无光合色素，细胞壁含几丁质和纤维素的，单细胞或多细胞异养真核细胞型微生物。
细胞壁：不含肽聚糖，含几丁质及纤维素临床分类(按致病部位)：浅部真菌、深部真菌形态学分类：单细胞真菌、多细胞真菌真菌的形态与结构在鉴定上起重要作用（一）形态与结构1、单细胞真菌：圆形或卵圆形，包括酵母型和类酵母型真菌。
酵母型真菌以芽生方式繁殖，芽生孢子成熟后脱落成独立个体，不产生菌丝，其菌落与细菌菌落相似。
类酵母型真菌也以芽生方式繁殖，菌落与酵母型真菌相似，但它产生的芽体不从母细胞上脱落，而是延伸入培养基内形成假菌丝。
对人致病的主要有新生隐球菌和白假丝酵母菌。
2、多细胞真菌：由菌丝和孢子两种基本结构组成（1）菌丝：在环境适宜情况下由孢子萌发长出芽管，逐渐延长呈丝状，称菌丝。
按照功能分为：①营养菌丝：伸入培养基；②气生菌丝：露出培养基向空气中生长；③生殖菌丝按照结构分为：①有隔菌丝：多数致病性真菌；②无隔菌丝。
菌丝的形态大小不一(螺旋状/球拍状/鹿角状)、菌丝间有无分隔、形状特征(绒毛状/絮状/粉末状) → 鉴别真菌（2）孢子：由生殖菌丝产生的一种繁殖体，是真菌的繁殖结构。
有有性孢子和无性孢子两类①有性孢子：同一菌体或不同菌体上的2个细胞融合经减数分裂形成。
包括：卵孢子、接合孢子、子囊孢子、担子孢子，多为非致病性真菌所产生。
②无性孢子：菌丝上的细胞分化或出芽生成，不经两性细胞的配合。
病原性真菌大多形成无性孢子。
可分为三种a. 分生孢子：又可分为大分生孢子（其大小、细胞数和颜色是鉴定的重要依据）、小分生孢子（真菌都能产生，诊断意义不大）b. 孢子囊孢子c. 叶状孢子：又可分为芽生孢子（一般芽生孢子生长到一定大小仍不与母体脱离，则形成假菌丝）、厚膜孢子（是真菌的一种休眠形态）、关节孢子真菌种类不同，孢子形状大小也不同→ 鉴别真菌3、二相性真菌：少数真菌在营养、温度、理化因素等不同环境条件下，可发生单细胞与多细胞两种形态的可逆转化，称为双向性真菌。
真菌的鉴定及药敏试验分析
真菌的鉴定及药敏试验分析真菌对人类健康的危害包括由病原性真菌、条件致病真菌所致的深部真菌病和浅部真菌病；由气传真菌所致的变态反应真菌症即过敏；由污染真菌产毒所致的真菌中毒症。
随着医学的发展，特别是抗生素的广泛使用，大量治疗手段的开展，免疫障碍疾病的大量发生，使真菌感染的情况日益增加，医院感染中的真菌感染也不断增加，因而，掌握真菌检验的方法就成为检验工作中的一个重要组成部分。
1 材料与方法1.1 真菌来源收集临床送检标本所分离出的真菌120例，男性84例，女性36例，其中痰液96株，粪便11例，咽拭子12例、尿液5例、血液4例，分泌物3例。
1.2 采集及处理根据真菌侵犯组织和器官的不同而采集不同的标本，而采集最合适的标本是决定能否找到病原性真菌的关键，要尽量用消毒方法采集标本以免污染。
深部真菌病的标本如血液、脑脊液、脓液、尿、痰等应及时收集检查，一般不超过1～2h，以免变质污染，标本采取前，应忌用药。
为避免污染杂菌，在收集标本时，应严格无菌操作，必要时在培养基内加入抗生素类。
1.3 检验方法1.3.1 酵母样菌的检验直接涂片法各类标本，除脑脊液、尿、胸水、腹水等需离心沉淀后取沉淀物作涂片外，其他均可用生理盐水或10％～40％KOH作涂片后直接镜检或用革兰、墨汁、0.1％甲苯胺蓝染色后镜检。
分离酵母样菌所选用的培养基为沙保弱固体或液体培养基，在培养基中可加入各种抗生素抑制细菌的生长、有利于真菌生长含抑制剂的霉菌琼脂。
将备类标本直接接种上述培养基，除新型隐球菌需同时接种两支培养基；一支孵育于37℃，另一支孵育于22～28℃，其他酵母菌均孵育于22～28℃。
每日观察生长情况。
根据酵母菌在培养基上的菌落特征及在玉米粉吐温80培养基上生长物在显微镜下生长情况可作初步鉴定。
1.3.2 丝状真菌的检验某些丝状真菌如孢子丝菌或荚膜组织胞浆菌的直接涂片，必须染色后检查。
真菌的形态和结构通过染色更为清楚，不染色涂片不易保存，染色涂片可长期保存。
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真菌临床检验技术
真菌临床检验在诊断和治疗真菌疾病中扮演着至关重要的角色。
由于真菌感
染菌种构成的变化，新的条件致病真菌的出现，以及真菌感染率的提高，我们需
要更为精细和深入的检测工作，以便确定真菌种类和其对抗真菌药物的耐药性。
对真菌进行精确的识别和耐药性分析，可以为临床治疗提供重要依据，从而有助
于患者的快速恢复。
这里就带大家一起来了解常见的真菌临床检验技术。
1.标本采集
标本采集是检验的基础，需根据病人的具体情况和疾病种类，选择合适的采
集方法。
如果疑似浅表真菌感染，例如体癣，可刮取病变部位的边缘痂皮。
对于
疑似深部真菌感染，需要采集的标本包括脓液、痰液、脑脊液、血液等。
无论何
种情况，标本的采集都需要在尚未使用药物治疗前完成。
如果已经用药，需要停
药一周后才能再次采集标本。
另外，标本的采集必须足量，一般情况下，活体组
织需要两份（一份用于显微检查和培养，一份送给病理科进行检查），皮屑需要
两块，胸腔液为20毫升，脑脊液和血液为5毫升。
在操作过程中，需要保证无菌，避免二次感染。
采集完成后的标本要尽快送检，保存时间不超过两小时，特
别是对于深部真菌标本。
2.直接检查法
真菌直接检验主要在显微镜下进行。
首先，取一部分患者的标本，放置在玻
璃载片上，加入适量的载液。
在平均分布标本后，用另一块玻片覆盖。
待片刻，
利用火焰迅速烘烤载玻片，但不可持续加热以避免结晶。
随后，轻压盖玻片，除
去气泡的同时使标本尽可能压薄。
清理周围的溢液后，可以用显微镜观察。
初步
选择低倍镜，观察是否存在孢子或菌丝。
确定存在后，使用高倍镜进行细致观察，描绘出孢子和菌丝的排列、大小、位置、特征和形态等。
真菌直接检查是一种较为快速和直接的检测方法，其结果可以明确患者是否
被真菌感染。
如果结果为阳性，可以确诊患者的真菌感染；如果结果为阴性，仍
不能排除真菌感染的可能性。
通过显微镜，我们可以明确部分病原菌种，如花斑
癣菌、新型隐球菌等，也能够确定某些特定的菌属，如念珠菌属。
此外，我们还
可以观察到真菌的形态，了解其在组织中的存在状态。
这些信息都对诊断和治疗
有重要的指导意义。
3.真菌培养法
真菌培养是为了鉴定和分离感染的真菌种类。
首先，选取适当的脱水培养基，加入适量的蒸馏水，摇动制成混悬液。
之后，缓慢加热，煮沸一分钟，准备进行
高温灭菌。
在灭菌前后分别分装到试管和平皿中，待其降至45-50℃时，完成分装，并附上标签。
然后，将培养基放置于室温下24小时，后置于4℃的冰箱中保存。
接种标本后，可以通过显微镜或者涂片观察孢子和菌丝的生长状态。
真菌培养的主要目的是从采集的标本中分离出病原菌，以明确是否存在真菌
感染，并进一步确定感染的真菌种类。
这样的方法能够有效地弥补直接检查所存
在的不足，如检查范围受限、分辨率不高等。
通过真菌培养，我们可以从显微镜
下观察到真菌的形态、结构和特征等详细信息，进一步对真菌的生理和生物特性
有全面的了解，这些都将对临床治疗有重要的指导作用。
此外，成功培养出的菌
种还能够为其他研究提供材料，如对真菌的基因学、生理学研究等。
4.分子生物学检测
分子生物学检测是一种较新的检测技术，主要包括PCR（聚合酶链反应）、
实时定量PCR、序列分析、T2MR（T2磁共振）等。
其中，PCR和实时定量PCR是
最常用的两种方法，通过对特定的真菌DNA进行扩增和定量，可以高度敏感和特
异地检测和鉴定真菌。
此外，通过对扩增的DNA进行序列分析，可以确切地鉴定
真菌的种类，甚至是亚种。
这些方法的优点是敏感性和特异性高，而且结果快速（通常几小时内可以得到结果），因此在临床上有很大的应用价值。
然而，由于
这些方法需要专门的设备和技术，而且操作步骤比较复杂，因此在一些基层医院
和疾病预防控制中心的应用还比较有限。
5.其他
此外，还有一些其他的检测技术，如抗原和抗体检测、MALDI-TOF MS（基质辅助激光解析/电离飞行时间质谱）等，也在某些情况下被用来进行真菌的检测和鉴定。
抗原检测主要通过检测血液或者体液中的特定真菌抗原（如酵母菌的鞭毛蛋白或者曲霉的岩藻多糖等）来诊断真菌感染。
这种方法的优点是结果快速（通常几小时内可以得到结果），而且可以动态地监测疾病的进程。
然而，由于许多真菌抗原在体内的存在时间较短，而且可能受到交叉反应的影响，因此其敏感性和特异性并不理想。
抗体检测则是通过检测血液中的特定真菌抗体（如抗真菌IgG或者IgM抗体等）来诊断真菌感染。
这种方法的优点是可以检测到体内的早期感染和慢性感染，而且对于某些难以培养的真菌（如某些真菌性脑膜炎病原菌等），其检出率比培养和直接检查要高。
然而，抗体检测也存在一些问题，如抗体滴度的变化可能受到许多因素的影响，而且对于免疫抑制的患者，其检出率可能会降低。
真菌临床检验方法是真菌病诊断的重要手段，每一个步骤都需要精确操作，才能确保准确的检验结果，为患者的诊断和治疗提供有力依据。
然而，这些方法也有局限性，比如标本的采集和保存等都需要特别注意，以免影响到检测结果。
因此，真菌临床检验不仅需要技术精湛的实验人员，更需要对病原生物学有深入理解的临床医生，才能确保检验结果的准确性和应用性。