精子畸形试验
用小鼠精子畸形试验评价生物羊膜遗传毒性的研究
批号 ０００ ，规 格型 ４ ８１ 羊 膜 是人类 两 层胎膜 的 ｆ ， Ｉ常 羊膜薄 而透 明 ． 状 胬 内、角膜 溃疡穿 孔的修 复 （ 向层 Ｉ 无 【管 。 在光镜下可 分 为 ５晨 上 皮层、基底膜 、 密层 号 Ｚ ５× ） 血 致 Ｋ一 ５ 。 剂 ：０９ 氯化 钠注射 液 （Ｃ） ０ 甲醇 ，２ 伊 ２试 ． ％ Ｓ ，１％ ％ 纤维 母细 胞层和海绵 层 。羊膜主要 利用的 是基底膜 。基 １ 底幞是 无细 胞结构 的胶原组 织层 ．羊膜移 植是将羊 膜植 红染色液 ，环磷酰 胺 （ Ｐ 。 ｃ ） 片根 据创 面大 小的 要求 ，平 贴 于眼表 ，再 行缝合 ，受体 １ ． 器 ：Ｏｌｍｐ ｓ双 日屁微镜 （ｏ ｅ－１） ３仪 ｙ ｕ ｃ ｖｒ ８，手提 式压 ０ 周遍 的健 康结膜 组织 的新 生上皮 细胞 向羊膜移 行 ，两 ３ 力蒸汽 消毒 器，生 化培养箱 Ｌ 一５Ｂ，分析 天平 ，镊 ＲＨ １０ 周后 ，新生 上皮长 好 ，羊幞 自动 脱落。生 物羊膜 是取 用 子 剪 ７ 。 ］ 健 康剖富 产产女Ｉ 胎盘组 织 ，产 前 ｌ清 学检查按 照国家 Ｉ ＝ 的 ｆ Ⅱ ． ４动物 ：雄 性 昆 明种 小 鼠 （ － 吉，体 重 ２—５ ，山 ６８』】 ５３ｇ 相关标 准进行 ．排 除乙肝 、丙肝 、梅毒 及艾滋 痫 ，从 而 东 鲁抗医 药集团 有限公 司 ） 。 确 保原料 的腱康安 垒性 。生物 羊膜属植 入 ３ 医疗器械 １ 类 ． ５动物管理 ：动物 饲养 条件符 合 “ 实验 动物管 理条例 ” 应 从生物 、物理 ．化学等 方面 作必 要的质量控 ｛ ，以 保 要求 。 Ｉ ｊ ｌ Ｊ ｛产品 的安全性 因此 对羊膜 产品的 质量要 求是 ：无致 ｌ Ｅ 敏 、 刺激、无细 胞毒性 无遗传 毒性 ． 无 具合 适的 Ｐ 值 Ｈ 厚薄均 匀，具有 ・ 定的 韧性 。本研究就 是从 生物学 方面 评价 其是 舀Ｊ 遗传毒性 。具 体操 怍如下 ： 生
实验2-小鼠精子畸形试验-20121025
制
颈椎脱臼 处死小鼠 取双侧 附睾
片
3ml磷酸盐 剪碎附睾 缓冲液
擦镜纸 过滤
取悬液滴于 玻片上推片
甲醇固定5 分钟
伊红染色30分钟
（五）阅片
首先在低倍镜下选择背景清晰、精子分布 均匀、重叠较少的区域，然后在高倍镜下 观察结构完整的500个精子，计数其中畸 形的精子数。
五、结果分析与评价
精子畸形形态观察 无钩、香蕉形、无定形、双头、 胖头、 折尾、双尾 计算精子畸形的发生率（头部重叠或全部 重叠的精子、无尾精子不进行计数）。
注意鉴别制片过程中人为造成的精子损伤。
正常精子
胖头精子
双头精子
双尾精子
双尾精子
双尾精子
香蕉形精子
人类精子
Thanks!
四、操作步骤
（一）动物选择 （二）剂量与分组 （三）染毒与采样 （四）制片 （五）阅片
（四）制片
颈椎脱臼法处死小鼠，剪开腹腔，分离并摘取 双侧附睾，将附睾放入盛有约3ml磷酸盐缓冲液或 生理盐水的小平皿中，以眼科剪将附睾剪成小 块，用吸管将悬浮液轻轻吹打5～6次，静置3～ 5min，用四层擦镜纸滤除组织碎片，吸取此精子 悬液滴于清洁载玻片上，均匀推片，待玻片晾干 后用甲醇固定5min，干燥后（此时也可镜检观察 精子形态）再用1%的伊红醇溶液染色1～2h（或 30min），流水冲洗，晾干后镜检。
一、目的
精子畸形试验是检测受试化学毒物 能否破坏哺乳动物精子正常形态的 实验方法 通过该实验，学习和掌握小鼠精子 畸形试验的原理和步骤
二、原理
精子畸形是指精子的形状异常和异常精 子数量的增多; 生殖系统对化学毒物的作用十分敏感, 在其它系统还未出现毒性反应之前，生 殖系统可能已出现损害作用;
实验一 小鼠精子畸形试验
实验目的
通过该实验，学习和掌握小鼠精子畸形 实验的原理和步骤
实验原理
精子畸形是指精子形状改变和畸形精子
数量增多。
生殖系统对化学毒物的敏感性
用检测雄性动物接触化学毒物后精子畸
形率的高低，来反应该化学毒物的生殖 毒性和对生殖细胞潜在的致突变性。
实验动物和材料
精子形态
实验操作步骤
二、制片
实验操作步骤 三、阅片
低倍镜 找到背景清晰、精子重叠较少的
部位高倍镜 按顺序检查精子的形态。 每只动物检查完整的精子1000个。
实验结果分析与评价
精子畸形 主要表现在头部，畸形的类型
可分为无钩、香蕉形、无定形、胖头、 双头以及双尾等。 精子畸形百分率 分别记录各种类型畸形 的精子，进行精子畸形类型构成比分析， 并计算每组动物精子畸形百分率。
实验动物：雄性小鼠 （6-8周）24只 实验材料：
1.器材：眼科剪、眼科镊、玻璃平皿、显微镜、擦镜
纸、吸管
2.试剂：生理盐水、甲醇（分析纯）、 2%伊红水溶液
环磷酰胺（ 50mg/kg ）
实验操作步骤
一、动物分组及处理
动物选择 分组及处理：
阳性对照组：8只雄鼠，环磷酰胺腹腔注射三次 空白对照组：16只雄鼠，不做任何处理
小鼠精子畸形实验报告
一、实验目的本实验旨在探究不同因素对小鼠精子形态的影响，分析精子畸形率的变化，评估其对小鼠生殖健康的影响。
二、实验材料1. 实验动物：昆明种雄性小鼠，体重25~30g。
2. 实验药品：白头翁水提取物、硫酸镉、丝裂霉素C。
3. 实验器材：显微镜、染色液、培养皿、注射器、剪刀、眼科剪等。
三、实验方法1. 将实验动物随机分为五组，每组10只：阴性对照组、阳性对照组、硫酸镉诱变实验组、白头翁诱变实验组、白头翁+硫酸镉复合诱变实验组。
2. 阴性对照组：正常饲养，不予任何处理。
3. 阳性对照组：腹腔注射丝裂霉素C（1.0mg/kg）一次，模拟化学物质对精子的影响。
4. 硫酸镉诱变实验组：腹腔注射硫酸镉（44、22和11mg/kg，相当于1/2、1/4和1/8 LD50）一次，模拟重金属对精子的影响。
5. 白头翁诱变实验组：灌胃白头翁水提取物（1.0、2.0、4.0和8.0g/kg，相当于人5、10、20和40临床剂量）一次，模拟中药对精子的影响。
6. 白头翁+硫酸镉复合诱变实验组：同时给予硫酸镉和白头翁水提取物处理。
7. 实验后35天，处死动物，取出两侧副睾，放入盛有2mL生理盐水的平皿中。
8. 用眼科剪将副睾纵向剪1～2刀，静止3～5min，轻轻摇动。
9. 用四层擦镜纸过滤，吸滤液涂片。
10. 空气干燥后，用甲醇固定5min以上干燥。
11. 用1%～2%伊红染色1min，用水冲洗。
12. 镜检精子形态，记录精子畸形率。
四、实验结果1. 阴性对照组：精子畸形率为5%。
2. 阳性对照组：精子畸形率为30%。
3. 硫酸镉诱变实验组：精子畸形率为20%。
4. 白头翁诱变实验组：精子畸形率为10%。
5. 白头翁+硫酸镉复合诱变实验组：精子畸形率为35%。
五、讨论1. 实验结果表明，硫酸镉和丝裂霉素C对小鼠精子形态有显著的畸形作用，导致精子畸形率升高。
2. 白头翁水提取物对硫酸镉诱变有明显的抑制作用，降低精子畸形率。
WHO人类精液检查与处理实验手册
正 主段应是直的，均一的，比中段细，其 主段应是直的，均一的，比中段细，非
常 长约45um。
卷曲的，其长约为45um。
标 准
异 主段缺陷包括：短、多尾、发卡形、断 主段缺陷包括：短、多尾、发卡形、断
常裂
裂
标 主段急剧弯曲、主段宽度不规则、主段 主段弯曲（>90度）、主段宽度不规则、
准 卷曲以及上述缺陷的任何组合
生育力评估
评估男性生育三大要点：
女方妊娠 妊娠时相 精液参数
其他男性病诊断
精子的总数：睾丸生殖功能 输精管道的通畅程度
血精、脓精：附性腺疾病 精浆生化： 附性腺功能
治疗策略制定（常规治疗及辅助生殖）
少精子症的分类和ART治疗方案
精子浓度
治疗
轻度少精子症 ≧10，<20(15) ×106/ml
主段卷曲以及上述缺陷的任何组合
精子胞浆小滴判断标准
胞浆小滴体积大于精子头部的1/3
胞浆小滴体积大于精子头部的1/3
WHO第四版与第五版精子形态学评估标准比较研究
研究目的：比较WHO第四版与第五版精子形态学评估标准的变化。 研究对象： 1000个精子图片，一张精子形态质控版 研究方法： 1.用WHO第四版的评估标准，对上述精子进行评估 2.精子库9名工作人员学习第五版精子形态学评估标准及精子图谱，并进行室内质量控
因此，有必要建立或选用特殊实验对精子功 能进行测定。
精子存活率 精子形态分析 精子顶体完整性 精子与透明带结合试验 精子细胞核成熟度与DHA损伤检测 精子表面结合抗体检测 附睾功能检测
精子形态学评估标准
在评估精子正常形态时应采用严格标准 （Krugeret al.,1986;Menkveld et al.,1990;Coetzee al.,1998)
金诃牌雪益康胶囊急性毒性和遗传毒性试验研究
金诃牌雪益康胶囊急性毒性和遗传毒性试验研究作者：刘有菊马文俊袁发荣孙跃宁陈海莲来源：《食品界》2020年第07期摘要：目的：研究金诃牌雪益康胶囊的急性毒性和遗传毒性实验，评价其食用安全性。
方法：依据《食品安全性毒理学评价程序和方法》进行急性毒性试验、遗传毒性试验（Ames 试验、骨髓细胞微核试验和精子畸形试验）。
结果：小鼠急性毒性试验经口最大耐受剂量（MTD）>30 g/kg·bw，属无毒级。
Ames 实验、骨髓细胞微核试验和精子畸形试验结果均为阴性，表明受试物无致突变作用。
结论：金诃牌雪益康胶囊急性毒理分级属无毒级，无遗传毒性，在本试验剂量范围内，金诃牌雪益康胶囊属于安全性保健食品。
关键词：金诃牌雪益康胶囊；急性毒性；遗传毒性；金诃牌雪益康胶囊产品配方精选海拔3000米左右高原特色草本植物唐古特白刺果、柴达木枸杞果、沙棘果等为主要原料制成的保健食品。
优越的地理环境，日照时间长，太阳辐射强，昼夜温差大，培育出高活性的高原物质。
以传统医学与现代养生理论为指导原则，六种植物科学配伍、合理配比，采用传统炮制与现代工艺相结合的技术手段，精制而成的一款高端产品，其主要保健功能是调节血糖。
为评价产品的安全性，根据《保健食品检验与评价技术规范》的要求，现进行金诃牌雪益康胶囊的急性毒性及遗传毒性试验。
1. 材料与方法1.1 材料1.1.1 受试样品金诃牌雪益康胶囊由金诃藏药股份有限公司提供。
样品推荐量为每日3次，每次3-4粒，0.3g/粒，总量为3.6g，相当于成人推荐量0.06g/kg·bw（以60kg计）。
1.1.2 实验动物和饲养环境 KM种小鼠，清洁级，体重18-22g，动物合格证号：青医动字第001号，由青海省实验动物中心提供；实验动物购进后首先于恒温恒湿的动物房环境中适应3天，单笼饲养。
1.1.3 菌株鼠伤寒沙门氏菌TA97a、TA98、TA100 、TA102。
由上海市疾病预防控制中心提供。
精子形态评估报告单
精子形态评估报告单精子形态评估报告单是一种用于评估男性精子形态的常规检测方法。
通过对精子形态的评估，可以判断男性生殖系统是否存在异常，并进一步指导治疗方案的选择。
下面是针对精子形态评估报告单的详细解读：一、精子形态评估指标1. 精子头部形态：正常精子头部应呈椭圆形或倒卵形，头部大小和形状均匀一致。
2. 精子颈部形态：正常精子颈部应该呈细长的形状，与头部连接紧密，无异常变形。
3. 精子尾部形态：正常精子尾部应呈长而细的形状，具有较好的运动能力。
二、评价结果1. 正常精子：正常精子形态占总数的比例，一般应在15%以上。
2. 异常精子：头部变性、变形、颈部异常、尾部缺损等异常精子的数量。
一般来说，异常精子数量越少，说明精子形态越好。
三、临床意义通过精子形态评估报告单的分析，可以判断男性生殖系统是否存在异常，主要有以下几个方面的临床意义：1. 婚前检查：精子形态评估是婚前检查的一项重要内容，可以帮助双方了解是否存在生育障碍。
2. 不孕症筛查：精子形态评估可以作为不孕症筛查的指标之一，对不孕症的诊断和治疗提供重要依据。
3. 治疗指导：根据精子形态评估结果，可以指导选择适当的治疗方案，如助孕技术、生殖细胞治疗等。
四、改善措施对于精子形态评估不理想的男性，可以尝试以下改善措施：1. 保持良好的生活习惯：戒烟戒酒，保持正常的作息时间，避免长时间暴露在高温环境中。
2. 饮食调理：均衡饮食，补充富含维生素C、E等抗氧化物质的食物，如水果、蔬菜、坚果等。
3. 控制体重：过重或过轻都会对精子质量产生不利影响，保持适当的体重对精子形态有益。
4. 避免应激：长期的精神、情绪应激对精子质量会产生不良影响，保持良好的心态有利于精子形态的改善。
5. 避免接触有害物质：避免长时间接触有害物质，如重金属、辐射等，以免对精子产生不良影响。
总之，精子形态评估报告单是对男性生殖系统健康的一种重要评估手段。
理解评估结果，并采取相应的改善措施，可以提高男性生育能力，达到更好的生殖效果。
厦门大学-实验六.小鼠精子畸形试验(讲义)
轻冲洗，晾干。
标本制备
颈椎脱臼处死小鼠
取双侧附睾， 纵向剪开被膜
+ NS 1ml，静置5min 轻摇，剔除大的组织, 收集悬液于1.5ml EP 管，加300 µl NS清洗
1000 rpm离心5 min 弃上清, 余0.15 ml液体
将受试物各剂量组精子畸形发生率分别与阴性对照组进行 比较。 阳性的判断标准是畸形发生率至少为阴性对照组 的倍量或经统计学处理有显著性差异，并存在剂量-反应 关系者。
一般正常小鼠的精子畸形率为0.8%~3.4%
结果分析
分别计算各剂量组的精子畸形发生率。各剂量组的精子畸 形率与阴性对照组之间的差异分析采用秩和检验。
精子畸形发生率和畸形类型分析
试验报告
(1)受试物名称、理化性状、配制方法、所用溶剂； (2)动物种属和品系、体重、数量、来源（注明合格证号
和动物级别）； (3)实验动物饲养环境，包括饲料来源、室温、相对湿度
、实验动物室合格证号； (4)剂量分组，染毒途径和方式； (5)试验方法：简述操作步骤，所用统计学方法； (6)结果：以列表方式报告受试物对动物精子畸形发生率
有条件时，可于给受试物后第1、4和10周处死动物，检查 精子形态 (各种致突变物作用于精子的不同发育阶段，可在接触某种 致突变物后不同时间出现精子畸形)
动物染毒情况记录
操作步骤
标本制备
制片：用颈椎脱臼法处死小鼠，剖开腹腔，暴露睾丸，分 离两侧附睾，放入盛有1 mL 生理盐水(37℃预热)的平皿中 。用眼科剪剖开附睾组织，室温下静置5 min ，轻轻摇动 ，用镊子将大的组织块挑出；收集悬液于1.5 mL 离心管 中；另取300 µL生理盐水冲洗平皿，收集于同一离心管中 ；1000 rpm离心5 min；弃上清，余约0.15 mL液体，吹打 混匀，常规涂片；
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十三、精子畸形试验
Sperm Malformation Test
1 范围
本规范规定了动物精子畸形试验的基本原则、要求和方法。
本规范适用于化妆品原料的遗传毒性检测。
2 引用标准
GB 14924 试验动物与饲料标准
GB 15193·94 食品安全性毒理学评价程序
3 定义
精子畸形（sperm malformation）
指精子形态的异常改变。
4 原理
已知精子畸形是决定精子形成的基因发生突变的结果。
常染色体和Y-性连锁基因突变及某些染色体重排，如性-常染色体易位，也可使精子发生畸形。
小鼠精子畸形试验能评价受试物对精子生成、发育的影响，可检测受试物在体内对生殖细胞的遗传毒性作用。
5 试验的基本原则
通过适当的途径使动物接触受试物，经过一定时间后处死动物，取其附睾，制备涂片，经固定、染色，在显微镜下计数畸形精子。
6 仪器和器械
生物显微镜、解剖剪、镊子、表面皿、离心管、小漏斗、吸管、滴管、载玻片、擦镜纸等。
7试剂
7.1 1%伊红染色液
称取伊红1g溶于100mL蒸馏水中。
7.2 生理盐水、甲醇（A.R）
8 实验动物和饲养环境
常规使用动物是雄性小鼠。
6周~8周龄，体重为30g ~35g。
实验动物及实验动物房应符合国家相应规定。
9 剂量分组
受试物至少设三个剂量组。
分别取1/2、1/5、1/10或1/20LD50剂量。
当受试物的LD50大于5g/kg体重时，可取5g/kg体重为最高剂量。
另外设阴性（溶剂）对照组和阳性物对照组。
常用溶剂为水、生理盐水、植物油（玉米油、花生油）等。
阳性物对照组可采用环磷酰胺40mg/kg/
日。
每组至少有5只存活动物。
10 染毒途径和方式
染毒途径视实验目的而定。
常用途径为经口灌胃方式。
受试物各剂量组、阴性对照组和阳性物对照组的动物，均连续染毒5d，每日一次。
一般于首次染毒后的第35d处死动物。
11 试验方法
11.1 制片
用颈椎脱臼法处死小鼠，剖开腹腔，暴露睾丸，分离两侧附睾，用眼科剪剖开附睾组织，与适量生理盐水混匀，涂片。
11.2 固定
待涂片干燥后，放入甲醇（A.R）液中固定5min。
取出晾干。
11.3 染色
将涂片于1%伊红染液中染色1h，然后用蒸馏水轻轻冲洗，晾干。
11.4 观察与计数
首先，在低倍镜下选择背景清晰、精子分布均匀、重叠较少的区域，然后，在高倍镜下观察结构完整的1000个精子，计数其中畸形的精子。
精子畸形主要表现在头部。
按Wyrobeks 的分类标准，主要类型有：无钩、香蕉形、无定形、胖头、尾折叠、双头及双尾。
无尾精子、头部重叠的或整个与另一个重叠的精子均不计数。
判断双头、双尾精子时，要注意与两条精子的部分重叠相区别。
12 数据处理和结果判断
每只动物应按精子畸形类型分别记录，以便计算各实验组的精子畸形发生率和精子畸形类型的构成比。
利用Wilcoxon秩和检验法和其他适当的统计学方法。
将受试物各剂量组精子畸形发生率分别与阴性对照组进行比较。
精子畸形试验阳性的判断标准是畸形发生率至少为阴性对照组的倍量或经统计学处理有显著性差异，并存在剂量-反应关系者。
一般正常小鼠的精子畸形率为0.8%~3.4%，但每个实验室应有自己稳定的精子自发畸形率。
13 试验报告
试验报告应包括以下内容：
（1）受试物名称、理化性状、配制方法、所用溶剂；
（2）动物种属和品系、体重、数量、来源（注明合格证号和动物级别）；
（3）实验动物饲养环境，包括饲料来源、室温、相对湿度、实验动物室合格证号；
（4）剂量分组，染毒途径和方式；
（5）试验方法：简述操作步骤，所用统计学方法；
（6）结果：以列表方式报告受试物对动物精子畸形发生率和精子畸形类型分析的结果（表1和表2）；
（7）结论。
表1 ×××精子畸形发生率
组别剂量
(g/kg)
动物数
(只)
受检精子总数
(个)
畸变精子数
(个)
畸变率
（%）
P值
受试物
溶剂对照
阳性物对照(mg/kg)
注：畸变率以均数 标准差表示。
表2 ×××精子畸形类型分析
组别剂量
(g/kg)
动物数
(只)
受检精子
总数(个)
精子畸形分类及比例（%）
无钩香蕉形胖头无定型其他总计
受试物
溶剂对照
阳性物对照(mg/kg)。