DNA浓度和纯度的测定--分光光度法
紫外分光光度计检测核酸浓度和纯净度
紫外分光光度计检测核酸浓度和纯净度
A260是核酸最高吸收峰的吸收波长，最佳测量值范围是0.1到1.0，如果不在次范围建议稀释或浓缩样品；样品吸光度小于0.05,检查是否存在操作因素，正常情况下，DNA样品的吸光度一定大于0.1，样品中出现杂质或者不错纯净会使吸光度减小。
A280是蛋白和酚类最高吸收峰的吸收波长。
因此A260/A280的比值可以对核酸纯度进行评估，一般情况下，纯净的DNA的A260/A280比值为1.8,纯净的RNA为2.0. 如果比值较低，表明样品中存在蛋白或者酚类物质的污染，需要纯化样品，特别说明A260/A280=1.5时，相当于50%蛋白质/DNA溶液。
A230 是碳水化合物最高吸收峰的吸收波长，A260/A230比值可以对核酸样品纯度进行评估，纯净的DNA或者RNA的A260/A230比值为2.5。
如果比值小于2.0，说明样品存在碳水化合物、盐类、有机物的污染，需要纯化样品。
特别说明，A230产生负值主要是由于在很低的DNA浓度
A320/A340 检测吸光值用于检测样品溶液的浊度和其他干扰因子。
纯净的样品改值为0.00,如果不是，说明溶液中有悬浮物，需要纯化样品。
实验四DNA浓度测定与酶切
1、在使用分光光度计时，测得的OD值在0 .1-0.4这个区间内最可靠，最好不要超过1.0。 因此OD尽量控制在0.1-1之间，最多不要超过2.0。取值的时候要连续读数，重复3次的
数最好。
2、空白用不接种的培养基，但是不接种的培养基要和接种的同时培养，以求条件一致。
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（四） MP3质粒的大量酶切
100 l反应体系（1.5 ml离心管）：
MP3质粒DNA
2-4 g（试剂盒抽提）
酶切Buffer
10 l
Hind III酶
2-4 l
灭菌ddH2O
up to 100 l
加样顺序：水、buffer、DNA、酶
37℃恒温箱酶切过夜
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MP3和pSK（+）质粒DNA的Hind III酶切结果
3、OD与体积或者说稀释倍数不一定成正比，如果OD大于2.0，一般要稀释后再测，而不能根 据之前的检测结果稀释，因为OD太大了就会超过检测范围，灵敏度显著降低。
4、OD值是透光率，跟体积没关系，只跟菌浓度有关系，而且只有在一定的吸光值范围内成线 性关系，一般在0.1-1.0范围内。
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2、 NanoDrop分光光度检测仪：先加1 l 蒸馏水进行紫外光空白测 定，然后用滤纸吸掉蒸馏水，加入1 l Elute溶液，测定上述数值。 （制剂盒提取的质粒DNA）
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（二）琼脂糖凝胶电泳法检测DNA浓度（1 % agarose gel）
1、利用ddH2O将质粒DNA稀释到浓度为10-100 ng/ l之间，然后分别取稀释的DNA 样品和已知浓度的λDNA各1 l于点样板小孔中，再加入8 l TE和1 l的载样缓 冲液，混匀后，小心加入点样孔，蓝色样品混合物将沉入点样孔下部。同时 点5 l MarkerⅢ作为分子量标准。
实验十三动物组织核酸的分离鉴定和含量测定(精)
实验目的：
学习并掌握紫外分光光度法和定糖二苯胺显色法பைடு நூலகம்
测定DNA含量和纯度的基本原理
DNA测定的方法原理
紫外分光光度法（此法要求核酸纯度很高，1个Abs 相当于50ug/ml双螺旋DNA,除了定量测定以外还可 进行核酸纯度的检测，A260/A280比值，纯的DNA为 1.8，RNA为2.0，样品中含有蛋白质和苯酚时， A260/A280 比值降低。） 定糖法（DNA糖部分为脱氧核糖，RNA糖部分为核糖， 分别可以进行二苯胺显色法和地衣酚显色法） 定磷法（核酸的磷酸部分）
二苯胺显色法原理
DNA在酸性条件下加热，其嘌呤碱与脱氧核糖间的 糖苷键断裂，生成嘌呤碱、脱氧核糖和脱氧嘧啶核苷 酸，而2-脱氧核糖在酸性环境中加热脱水生成ω-羟基 -γ-酮基戊糖，与二苯胺试剂反应生成蓝色物质，在 595nm波长处有最大吸收。DNA在40~400μg范围内，光 吸收与DNA的浓度成正比。在反应液中加入少量乙醛， 可以提高反应灵敏度。
实验内容
DNA：1ml SC溶液溶解上次提取的DNA样品，然后转移到 50ml离心管中，用9ml0.01M NaOH溶液溶解。 A260测定:以H2O作为空白，取上清测A260值后确定稀释 倍数，使A260值在2.0左右（DNA此时的浓度约为 100ug/ml。（由于二苯胺法的测定范围是40400ug/mlDNA，所以DNA浓度如果太小会影响测定结果） 核酸含量（ug/ml）=样品A260X稀释倍数/0.02 (0.022) A280测定： A260/A280比值计算。纯的DNA为1.8，RNA为 2.0。如果样品中混有RNA，则比值大于1.8；如果样品中 混有蛋白质，则比值小于1.8。
dna的质量分析实验报告
dna的质量分析实验报告实验目的：通过DNA的质量分析，了解DNA样本的纯度和浓度，为后续的实验设计和操作提供参考。
实验原理：DNA的质量分析主要包括纯度分析和浓度分析两个方面。
1. 纯度分析：纯度是指DNA样本中所含的杂质和污染物的含量。
常用的纯度检测方法有比色法和光谱法。
比色法：通过检测DNA溶液的吸光度，判断其中蛋白质、RNA和其他杂质的含量。
DNA纯度范围一般在1.8-2.0之间。
2. 浓度分析：DNA的浓度是指单位体积内所含的DNA量。
常用的浓度检测方法有比色法和荧光法。
比色法：根据DNA与染料之间的比色反应，根据反应产物的吸光度来确定DNA浓度。
荧光法：在荧光素染料的作用下，测定DNA溶液中的荧光强度，从而确定DNA浓度。
实验步骤：1. 取DNA样本，使用比色法进行纯度分析。
根据比色反应的结果，判断DNA样本中是否存在杂质和污染物。
2. 使用比色法或荧光法进行DNA浓度分析。
根据比色或荧光反应产物的吸光度或荧光强度，计算出DNA的浓度。
实验结果及分析：1. 纯度分析：通过比色法检测，得到DNA溶液的吸光度为1.9，说明DNA样本中较少含有蛋白质、RNA和其他杂质，纯度较高。
2. 浓度分析：通过比色法或荧光法检测，得到DNA溶液的浓度为50 ng/μL，说明该DNA样本中单位体积内含有50 ng的DNA。
结论：通过DNA的质量分析，我们得知该DNA样本的纯度较高，且浓度为50 ng/μL。
这为后续的实验设计和操作提供了参考。
在实际操作中，我们应该注意保护DNA样本的纯度，避免杂质和污染物的污染。
同时，根据所需的实验要求，调整DNA的浓度，以保证实验的准确性和可重复性。
实验中可能存在的误差：1. 实验操作不规范或仪器故障导致的数据偏差。
2. DNA样本的提取和处理过程中可能存在污染，影响纯度和浓度的测定结果。
3. 不同测定方法的差异性，可能导致不同的浓度结果。
改进方案：1. 注意实验操作的规范性，尽量减少人为因素对实验结果的影响。
实验一、血液标本提取DNA(蛋白酶K-酚抽提法)
实验一、血液标本提取DNA（蛋白酶K-酚抽提法）一、实验原理离心分离到外周血的白细胞层；用细胞裂解液溶解细胞膜、核膜，使组蛋白与DNA分离，再用酚、三氯甲烷/异戊醇抽提去除蛋白质，最后经乙醇沉淀即可得到基因组DNA片段。
二、实验步骤：1、血液标本处理 1.0ml抗凝全血(ACD、EDTA抗凝均可)2000rpm离心10min（1.5mlEP管）。
轻轻去上清液（血浆），吸出淡黄色悬浮液（白细胞层）置于另一2.0mlEP管中。
（约50μl）2、细胞裂解加入10倍体积组织细胞裂解液，37℃1h，3、加入蛋白酶K消化加入蛋白酶K至终浓度100μg/ml（约4μl），充分混匀，37℃震荡12-24h或37℃1h后，56℃水浴3h。
保温过程中不时摇动，混匀反应液。
液体逐渐变粘稠，表明已有DNA释放出来，操作应轻柔。
4、酚抽提：将上述溶液冷却至室温，加等体积的Tris饱和酚（pH8.0）溶液，温和缓慢颠倒离心管10min，混匀两相成乳液。
12000rpm 5分钟，两相分层。
用宽口径移液管小心吸出上层粘稠的水相，移至一新的2.0mlEP管中。
（小心一点，不要吸入蛋白层。
如交界处有白色沉淀，需重新抽提有机相，用酚重新抽提两次，合并水相）5、三氯甲烷/异戊醇抽提上清液加等体积三氯甲烷：异戊醇（24：1），倒转混匀10分钟，12000rpm5分钟，取上层水相0.5ml入另一新的2.0mlEP管；6、DNA沉淀上清液中加0.2倍体积3.0mol/L 醋酸钠，再加2倍体积的4℃冰箱冷却后的无水乙醇，轻柔振摇，充分混匀；应可看到白色絮状物（DNA）。
12000rpm 5分钟，弃上清液；7、纯化：加1ml 70%乙醇洗涤，12000rpm 离心5分钟，去上清夜，重复1次；（此过程不得振荡摇动）8、溶解：弃上清液后，自然干燥（挥发痕量乙醇）后，用30μl pH8.0TE完全溶解，保存在-20℃备用。
三、注意事项1、加样准确，操作轻柔；微量加样器绝对不能超过最大量程；2、加酚试剂时，不要接触到皮肤上，有腐蚀性；如不小心弄到，立即用清水冲洗；3、取上清液时，不可吸到下层溶液；4、加TE液后轻摇10min溶解DNA或-4˚C保存待用。
第2章 DNA的纯化、浓度的测定及质量鉴定
第二章DNA的纯化、浓度的测定及质量鉴定实验一 DNA(或RNA)的核酸酶处理纯化一、原理和用途在基因工程中，DNA与RNA的提取与纯化是最基本的实验方法。
在DNA提取时，有时会有RNA的污染，在RNA提取时，有时会有DNA的污染，为了消除它们对后续实验的影响，通常我们要对所提取的DNA或RNA用相应的核酸酶进行纯化。
核糖核酸酶A（又叫RNA酶A，RNase A）来源于牛胰脏，是一种内切核糖核酸酶，可特异性攻击RNA上嘧啶残基的3′端，切割与相邻核苷酸形成的磷酸二酯键，从而除去RNA，其反应终产物为嘧啶3′磷酸及末端带嘧啶3′磷酸的寡核苷酸。
脱氧核糖核酸酶I（又叫DNA酶I，DNase I）来源于牛胰脏，是一种内切脱氧核糖核酸酶，它能水解双链或单链DNA，产生带5′端磷酸基团的单核苷酸及寡核苷酸的混合物。
当Mg2+存在时，DNA酶I可独立地作用于每条DNA链，且切割位点随机分布。
而当Mn2+存在时，DNA酶I可在两条链大致同一位置上切割DNA链，产生平齐末端或具有1～2个核苷酸突起的DNA片段。
二、实验材料粗提的DNA（或RNA）溶液。
三、溶液与缓冲液1．核糖核酸酶A2．10×RNase A悬浮液3．DNase I4．10×DNase I液（含MgCl2）或10×DNase I缓冲液（含MnCl2）5．灭菌纯水6．无水乙醇7．70％乙醇8．TE缓冲液四、仪器设备及耗材制冰机，冰箱，冷冻低温超速离心机，干燥培养恒温器，恒温水浴箱，旋涡振荡器，真空干燥器，离心管架，吸头盒, 2 μL、10 μL、100 μL、200 μL、1000 μL移液器，10 μL、200 μL、1000 μL吸头，1.5 mL离心管等。
五、实验方法1. 有些商业用固体RNase A干粉（或DNase I）可能含有微量的DNase（或RNase）活性，故在使用前应去除其活性，去除的方法可按照商家的使用说明书进行。
溴化乙锭法 微量dna的浓度和纯度测定 荧光光谱仪 实验步骤 -回复
溴化乙锭法微量dna的浓度和纯度测定荧光光谱仪实验步骤-回复题目：溴化乙锭法微量DNA的浓度和纯度测定实验步骤导语：DNA是生物体遗传信息的载体，因此准确测定DNA的浓度和纯度是许多生物学和生物化学实验的基础。
溴化乙锭法（EthBr法）是一种常用的DNA 浓度和纯度测定方法。
本文将详细介绍溴化乙锭法微量DNA的浓度和纯度测定实验步骤。
一、实验材料准备1. 高纯度双蒸馏水2. DNA样品3. 1% 溴化乙锭（溴化乙锭与溶剂DMSO的体积比例为1:1000）4. 紫外可见分光光度计5. 1 cm 宽的石英比色皿6. 10mm 宽的石英比色皿7. 石英盖片8. 显微镜二、实验步骤1. 准备工作a. 将双蒸馏水、DNA样品、1%溴化乙锭、石英比色皿、石英盖片等放入75%乙醇中进行消毒处理。
b. 打开紫外可见分光光度计，预热20-30分钟。
c. 样品处理台上摆放好所需的仪器和试剂，确保整个实验过程无菌。
2. 样品处理a. 取适量的DNA样品加入微量离心管中。
b. 加入等体积的1%溴化乙锭溶液，充分混匀。
注意：溴化乙锭具有一定的毒性，操作时需佩戴手套并在通风橱中操作。
c. 在石英比色皿的两侧各取一滴处理后的样品溶液。
d. 用石英盖片盖住比色皿。
3. 光谱测定a. 调整紫外可见分光光度计的检测波长为260 nm。
b. 放入纯净水的石英比色皿作为基线对照。
c. 使用石英比色皿装有样品溶液进行测量。
d. 记录吸光度数值。
4. DNA浓度计算a. 根据吸光度的数值，在一个线性范围内，将吸光度值与DNA浓度绘制标准曲线。
b. 以吸光度值作为y轴，以已知浓度的DNA溶液作为x轴，进行线性回归，得到拟合曲线的方程。
c. 将实际样品的吸光度值代入拟合曲线方程，计算其DNA浓度。
5. 纯度测定a. 在紫外可见分光光度计上调整检测波长为260 nm和280 nm。
b. 分别用两个石英比色皿测定纯净水和已知浓度的DNA标准曲线的吸光度比值（A260/A280)。
提取DNA纯度
试剂盒特点:◆经过特殊处理的纯化柱能有效的去除杂质和腐殖酸。
◆兼容性强，适用于各种不同的粪便。
◆不需要使用有毒的苯酚等试剂，也不需要乙醇沉淀等步骤。
◆快速，简捷，单个样品操作一般可在60分钟内完成。
◆ 高纯度，OD260/OD280典型的比值达1.7～1.9，长度可达50kb以上，可直接用于PCR，1.DNA 提取中会污染任何物质蛋白糖类RNA等。
其纯度一般用核算吸收OD260/OD280（蛋白质污染）分析判断，纯DNA比值为1.8。
此外用OD280/OD230估计盐离子是不是太高。
5.分光光度分析DNA的A280/A260小于1.8；不纯，含有蛋白质等杂质。
在这种情况下，应加入SDS至终浓度为0.5%，并重复步骤2～8。
你取出1微升或2微升，用EB稀释100倍或50倍到100微升，OD260/280的比值在1.8-2.0是比较理想的，代表你的DNA纯度很高。
波长260nm时，1OD 值相当于双链DNA浓度为50μg/ml，算一下，再乘以你的稀释倍数，就是浓度了紫外吸收检测DNA浓度与纯度2007年11月13日星期二11:40目的：了解紫外吸收检测DNA浓度与纯度的原理，掌握测定方法。
原理：核酸的最大吸收波长为260nm，蛋白质为280nm，在波长260nm时，1OD值相当于双链DNA 浓度为50μg/ml，单链寡核苷酸的含量为30μg/ml，可以据此来计算核酸样品的浓度,还可通过测定在260nm和280nm的OD值的比值（OD260/OD280），估计核酸的纯度。
纯净DNA的比值为1.8, RNA为2.0。
若比值高于1.8说明DNA 样品中的RNA尚未除尽，若样品中含有酚和蛋白质将导致比值降低。
270nm存在高吸收表明有酚的干扰。
紫外分光光度法只能用于测定浓度大于0.25μg/ml 的核酸溶液，对浓度更小的样品，可采用荧光分光光度法。
试剂与仪器：提取的质粒DNA，紫外分光光度仪。
操作步骤：1) 分光光度计先用水在260nm和280nm两个波长下校零。
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DNA浓度和纯度的测定--分光光度法
一、目的
熟练掌握分光光度法检测DNA纯度和浓度的方法。
二、原理
DNA或RNA链上碱基的苯环结构在紫光区具有较强吸收，其吸收峰在
260nm处。
波长为260nm时，DNA或RNA的光密度OD260不仅与总含量有关，也随构型而有差异。
对标准样品来说，浓度为1μg /ml时，DNA钠盐的OD260＝0.02当OD260＝1时，dsDNA浓度约为50μg / ml
ssDNA浓度约为37μg / ml
RNA浓度约为40μg / ml
寡核苷酸浓度约为30μg /ml（youyu底物例外有差异）
当DNA样品中含有蛋白质、酚或其他小分子污染物时，会影响DNA吸光度的确凿测定。
大凡情况下同时检测同一样品的O
D260、OD280和OD230，计算其比值来衡量样品的纯度。
经验值：
纯DNA：
OD260/OD280≈1.8(＞1.9,表明有RNA污染；＜1。
6，表明有蛋白质、酚等污染）
纯RNA：1.7＜OD260/OD280＜2.0（＜1.7时表明有蛋白质或酚污染；＞2.0时表明可能有异硫氰酸残存）
OD260/OD280的比值用于估计核酸的纯度,OD260/OD230估计去盐的程度。
对于RNA纯制品，其OD260/OD280≈2.0，OD260/OD230应大于2。
OD260/OD280<2.0可能是蛋白污染所致,可以增加酚抽提;OD260/OD230<2说明去盐不充分,可能是GIT污染所致,可以再次沉淀和70%乙醇洗涤。
三、材料、试剂及器具
1、材料
提取的PUC19样品、PUC19标准样品
2、试剂
灭菌重蒸水，TE缓冲液
3、器皿
xx比色皿；UV-240紫外分光光度计
四、操作步骤
1、UV-240紫外分光光度计开机预热10min.
2、用重蒸水洗涤比色皿，吸水纸吸干，加入TE缓冲液后，放入样品室的S 池架上，关上盖板。
3、设定狭缝后校零。
4、将标准样品和待测样品合适稀释（DNA5μl或RNA4μl用TE缓冲液稀释至1000μl）后，记录编号和稀释度。
5、把装有标准样品或待测样品的比色皿放进样品室的S架上，关闭盖板。
6、设定紫外光波长，分别测定230nm、260nm、280nm波长时的OD值。
7、计算待测样品的浓度与纯度。
DNA样品的浓度（μg / μl）:OD260×稀释倍数×
RNA样品的浓度（μg / μl）：
OD260×稀释倍数×。