甲胎蛋白基因的检测
肿瘤标志物甲胎蛋白(AFP)的检测及临床意义
肿瘤标志物甲胎蛋白（AFP）的检测及临床意义一、概述1、甲胎蛋白（α-fetoprotein；AFP）胎儿发育早期由肝脏和卵黄囊合成的一种由591个氨基酸组成的糖蛋白，电泳时位于白蛋白和α1球蛋白之间。
2、新生儿时期AFP很高，到1岁时降至10µg/L～20µg/L，在成人血清中AFP的含量很低。
当肝细胞发生恶性变时，AFP含量明显升高，是临床上辅助诊断原发性肝癌的重要指标。
二、参考区间血清AFP检测的参考区间可因方法、仪器、试剂不同而有不同。
三、筛查血清 AFP 联合肝脏超声检查可作为原发性肝癌高危人群的筛查。
高危人群以乙型肝炎病毒（HBV）和（或）丙型肝炎病毒（HCV）感染者、长期酗酒者以及有原发性肝癌家族史者为主，筛查年龄男性≥ 40 岁，女性≥50 岁开始，宜每隔 6个月检查一次。
四、临床意义1、血清AFP是临床上辅助诊断原发性肝癌（简称肝癌）最常用的肿瘤标志物。
对于血清AFP≥400μg/L超过1个月，或≥200μg/L持续2个月，在排除妊娠、活动性肝病和生殖系胚胎源性肿瘤后，应高度怀疑肝癌，需做B 超检查，必要时做CT/MRI和活组织检查等以明确诊断。
血清AFP对肝癌诊断的阳性率一般为70%左右，尚有约30%的肝癌患者AFP检测阴性，因此，不能仅靠AFP来诊断肝癌。
2、血清AFP升高也可见于生殖系胚胎源性肿瘤，如睾丸非精原细胞瘤、卵黄囊瘤、恶性畸胎瘤等。
还可见于其他恶性肿瘤，如胃癌，结直肠癌等。
3、急、慢性肝炎、肝硬化患者血清中 AFP 可出现不同程度的升高，多在20～200µg/L之间，一般在2个月内随病情的好转而逐渐下降。
4、妇女妊娠3个月后血清AFP可见升高，主要来源于胎儿。
孕妇血清中AFP异常升高，可见于胎儿神经管缺损、脊柱裂、无脑儿等。
AFP可由开放的神经管进入羊水而导致其在羊水中含量异常升高。
孕妇血清中AFP异常降低，提示胎儿有Down's 综合征的风险。
甲胎蛋白(AFP)测定(化学发光法)
4 操作步骤
1 开机前检查
a 察看电源是否正常安全通电
b 推主机下部的前门，打开后检查洗净水与分注液的用量是否满足当日
用量废试样杯与废吸嘴是否丢弃
2 开机
a更换75%酒精，放置基质液
b 打开电脑主机及AIA-1800电源, 点击主业面进入root
c 试样吸嘴的设置及酶标识试剂，检体稀释液的设置，按主机操作版面
Reagent/Tip键，LED指示灯变为绿色，打开试剂吸嘴护罩，将酶
标识试剂，检体稀释液设置在试剂托架上，将条形码
标识面朝前
d 试剂杯的设置，按主机操作版面的Cup Sorter键，LED指示灯
变为绿色，拉开分类器抽屉将试剂托盘设置在分类器托盘上，将分类器
抽屉推到底
3 开机日检
4 日检通过后，进行标本检测，在树形菜单上进入界面设置标
本检测项目，Assay键点击开始测定
5 测定完毕后，按主机操作版面的Cup Sorter及Reagent/Tip键，LED指
示灯变为绿色，打开试剂吸嘴护罩及分类器抽屉，收集试剂放入冰箱，
更换基质液，放置75%酒精
6 点击关机，待窗口消失，关闭AIA-1800电源，在关闭电脑及主电
源
5 质量控制：
每批试剂都要使用东曹公司标准品作质量控制，请参见AIA-1800仪器操作手册。
甲胎蛋白
甲胎蛋白(AFP)病人会长期出现AFP达到上千，但多年都没有肝癌的迹象；同时发现约20%的晚期肝癌病人，直至病故前，AFP仍不超过10。
阳性原因甲胎蛋白是肝癌的特异性标志，但血清甲胎蛋白阳性未必都是肝甲胎蛋白癌。
什么情况甲胎蛋白会出现阳性呢？甲胎蛋白由新生的幼稚肝细胞分泌，胎儿的肝细胞没有发育（分化）完全，分泌的甲胎蛋白量很大，所以孕妇的甲胎蛋白会阳性。
肝癌是尚未分化的肝细胞，当然能大量分泌甲胎蛋白。
孕妇在分娩1年后体内的甲胎蛋白就会恢复正常，正常值为每升血内甲胎蛋白含量不超过20微克，如果甲胎蛋白升高到每升血400微克以上，那么患肝癌的机率就很大了，这时还要进行超声波检查，因为有30%~40%肝癌患者的甲胎蛋白不会升高，所以需要进行综合检查。
双胎孕期甲胎蛋白值比单胎高一些，所测350ng/ml在正常范围，高于正常值三倍以上才有临床意义。
单胎妊娠有参考值：孕21周均值82.3，3 倍值246.9，双胎应大于493以上才有意义。
用测甲胎蛋白值来筛查神经管畸形，孕21周以后一般不做这项检查。
可用B 超监测神经管畸形的。
建议检测甲胎蛋白检测甲胎蛋白的方法有好几种，放射免疫法测得的甲胎蛋白大于甲胎蛋白500微克/升、且持续4周者，或甲胎蛋白在200～500微克/升、持续8周者，在排除其它引起甲胎蛋白增高的因素如急、慢性肝炎、肝炎后肝硬化、胚胎瘤、消化道癌症后，需再结合定位检查，如B 超、CT、磁共振（MRI）和肝血管造影等即可作出诊断。
不过，正常怀孕的妇女、少数肝炎和肝硬化、生殖腺恶性肿瘤等情况下甲胎蛋白也会升高，但升高的幅度不如肝癌那样高。
肝硬化病人血清甲胎蛋白浓度多在25～200微克/升之间，一般在2 个月内随病情的好转而下降，多数不会超过2个月；同时伴有转氨酶升高，当转氨酶下降后甲胎蛋白也随之下降，血清甲胎蛋白浓度常与转氨酶呈平行关系。
如果甲胎蛋白浓度在500 微克/升以上，虽有转氨酶升高，但肝癌的可能性大，转氨酶下降或稳定，而甲胎蛋白上升，也应高度怀疑肝癌。
甲胎蛋白测定方法
甲胎蛋白测定方法
甲胎蛋白是宫内妊娠期间表现为显著升高的一种细胞囊性蛋白，它可以在血液和尿液中检测出，由于其在精确诊断妊娠的期间可以起到非常重要的作用，因此检测甲胎蛋白的方法一直以来都是非常普遍的。
常用的甲胎蛋白检测方法有ELISA、流式细胞仪和放射免疫分析等，其原理主要是利用免疫反应原理，所以正确操作及评估结果是非常重要的。
(1) ELISA：ELISA即酶联免疫吸附分析，是一种检测甲胎蛋白浓度的定量检测方法。
ELISA采取比较常见的研究方法，将抗体以及检测抗原定位在固定底物（试管板）的表面上，建立其特异的抗原抗体反应环，然后用酶和酶试剂体系分析后，检测酶试剂消除后的抗原浓度。
(2) 流式细胞仪：流式细胞仪是一种能够检测微量吞噬性细胞因子，如甲胎蛋白在血液核心内的浓度的检测方法。
该检测原理基于混合抗体反应，混合到样本中的标记同抗体与细胞内抗原结合，可以显示出被检测物质在核心内的浓度。
(3) 放射免疫分析：放射免疫分析是一种采用放射性标记的抗体，检测甲胎蛋白在体内的浓度的检测方法。
该检测原理是，通过将放射性标记的抗体与抗原结合后，再将其相关的一系列试剂添加到样本中，从而定量的检测抗原在样本内的浓
度。
转录水平检测甲胎蛋白
甲胎蛋白（alpha-fetoprotein,AFP）
甲胎蛋白是人胚胎期血清中的主要蛋白成分。甲胎蛋白是一种糖蛋白，正常情况下，这种蛋白主要来自胚胎的肝细胞，在胎儿13周AFP含量占血浆蛋白总量的1/3，胎儿出生后约两周甲胎蛋白从血液中消失。在妊娠30周达最高峰，以后逐渐下降，出生时血浆中浓度为高峰期的1%左右，约40mg/L，在周岁时接近成人水平。正常人血清中甲胎蛋白的含量尚不到20微克/升，如在成人血清中含量过高，则提示有肝癌的可能。
分子生物学第四次讨论
单击添加副标题
单击此处添加文本具体内容，简明扼要地阐述你的观点
讨论题目
甲胎蛋白基因(alpha-fetoprotein，AFP) (GenBank 登录号: NM_001134.1)的异常表达与肝癌、前列腺癌等恶性肿瘤有关，请根据基因表达的检测方法，设计实验方案从转录水平检测AFP的表达情况。实验方案包括：实验目的、实验方法及原理、技术路线、可能的结果分析及应用等。
实验方法及原理
01
提取mRNA 2、反转录ｃDNA链
PCR扩增 4、凝胶电泳
结果显示
02
03
实验技术路线
若有AFP基因表达，则在与其反转录cDNA链分子量平行处应有检测信号。
01
若AFP基因未表达，则在与其反转录cDNA链分子量平行处没有检测信号。
03
判断基因在转录水平的表达情况
02
了解实验的操作方法和步骤
01
掌握RT－P
实验目的
使用细胞RNA提取技术，然后通过逆转录合成cDNA，PCR扩增，利用琼脂糖凝胶电泳技术，测定AFPmRNA的表达。
逆转录PCR，是将RNA的反转录（RT）和cDNA的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术。首先提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板经反转录酶或随机引物的作用从RNA合成 cDNA，再以cDNA为模板，扩增合成目的片段检测基因表达。
甲胎蛋白基因
甲胎蛋白基因(alpha-fetoprotein，AFP)的异常表达与肝癌、前列腺癌等恶性肿瘤有关，请根据基因表达的检测方法，设计实验方案从翻译水平检测AFP的表达情况。
实验方案包括：实验目的、实验方法及原理、技术路线、可能的结果分析及应用等。
实验目的•1、复习基因表达检测的几种方法•2、探究AFP的异常表达与恶性肿瘤的关系基因表达检测方法•1、转录水平：RT-PCR，real-time PCR，northern blot •2、翻译水平：western blot•3、直接检测：报告基因、融合荧光蛋白等•PS：RT-PCR是反转录PCR，是半定量方式。
real-time PCR可以精确定量。
二者不同。
后者为了区别于RT-PCR，一般不缩写。
Western Blot•生物中含有一定量的目的蛋白。
先从生物细胞中提取总蛋白或目的蛋白，将蛋白质样品溶解于含有去污剂和还原剂的溶液中，经SDS-PAGE电泳将蛋白质按分子量大小分离，再把分离的各蛋白质条带原位转移到固相膜（硝酸纤维素膜或尼龙膜）上，接着将膜浸泡在高浓度的蛋白质溶液中温育，以封闭其非特异性位点。
然后加入特异抗性体（一抗），膜上的目的蛋白（抗原）与一抗结合后，再加入能与一抗专一性结合的带标记的二抗（通常一抗用兔来源的抗体时，二抗常用羊抗兔免疫球蛋白抗体），最后通过二抗上带标记化合物（一般为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶）的特异性反应进行检测。
根据检测结果，从而可得知被检生物（植物）细胞内目的蛋白的表达与否、表达量及分子量等情况。
•检测甲胎蛋白的方法有好几种，放射免疫法测得的甲胎蛋白大于•500微克/升、且持续4周者，或甲胎蛋白在200～500微克/升、持续8周者，在排除其它引起甲胎蛋白增高的因素如急、慢性肝炎、肝炎后肝硬化、胚胎瘤、消化道癌症后，需再结合定位检查，如B超、CT、磁共振（MRI）和肝血管造影等即可作出诊断。
不过，正常怀孕的妇女、少数肝炎和肝硬化、生殖腺恶性肿瘤等情况下甲胎蛋白也会升高，但升高的幅度不如肝癌那样高。
210991495_妊娠期甲胎蛋白检测应用研究进展
sheds
t
ud
i
e
shavec
on
f
i
rmedt
ha
tAFPt
e
s
t
i
ngdu
r
i
ngp
r
egnancyc
ana
l
s
op
l
ayr
o
l
e
si
nt
hemon
i
t
o
Ｇ
ypub
r
i
ngt
hep
l
a
c
en
t
a
lf
unc
t
i
on,p
r
egnancyc
omp
l
i
c
a
t
i
ons,p
r
e
t
e
rmde
l
i
ve
r
t
i
造血细胞的重要结 构 蛋 白,可 能 参 与 有 核 红 细 胞 和
骨髓造血细胞的建立.
２ 妊娠期临床应用
２．
１２１
三体综合征筛查
临床上 AFP 是产前２１
三体综合征筛查的重要
宫动脉,适应 胎 儿 胎 盘 的 功 能,AFP 在 此 过 程 中 发
项目.通过检测母 体 血 清 标 志 物 结 合 孕 妇 年 龄、体
主要包括凋亡调节、细 胞 质 标 志 物 的 调 节 和 受 体 下
管缺陷(
ONTD)包括开放性脊柱裂(
OSB)和无脑畸
.目前研究 表 明,
AFP 生 长 调 节 机 制
重、孕周等方面来判断胎儿患先天愚型、开放性神经
甲胎蛋白 化学发光法 参考值-概述说明以及解释
甲胎蛋白化学发光法参考值-概述说明以及解释1.引言1.1 概述甲胎蛋白（alpha-fetoprotein，AFP）是一种胚胎期间合成并在胎儿血液和胎盘中存在的蛋白质。
它起源于胎儿的肝脏和胚胎瘤细胞，并在出生后逐渐减少。
甲胎蛋白的检测在临床医学中被广泛应用，特别是用于诊断和监测某些类型的癌症，如肝癌和睾丸癌。
化学发光法是一种高度敏感的检测方法，能够测定样品中微量的甲胎蛋白。
它基于一种特殊的生化反应，即通过某些荧光标记的试剂与甲胎蛋白结合后产生可见光。
通过测量产生的光信号强度，可以确定样品中甲胎蛋白的浓度。
研究甲胎蛋白化学发光法的参考值是为了建立一个可靠的参考范围，使得医生能够准确判断患者的甲胎蛋白水平是否超过正常范围。
这些参考值通常是根据大量健康人群的数据统计得到的，而这些人群没有癌症或其他严重疾病的影响。
参考值的研究对于正确评估甲胎蛋白的检测结果至关重要，可以提高癌症早期诊断的准确性和敏感性。
总之，本文旨在介绍甲胎蛋白的化学发光法，并研究其参考值。
我们将首先介绍甲胎蛋白的概述，包括其起源和临床应用。
然后，我们将详细解释化学发光法的原理及其在甲胎蛋白检测中的应用。
最后，我们将探讨对甲胎蛋白化学发光法参考值的研究，并给出结论和总结。
通过本文的阐述，读者将深入了解甲胎蛋白化学发光法及其参考值的重要性和应用前景。
1.2 文章结构文章结构部分应包括以下内容：本文主要包括引言、正文和结论三个部分。
引言部分分为概述、文章结构和目的三个小节。
在概述中，介绍甲胎蛋白及其在医学领域中的重要性。
在文章结构中，说明本文的整体架构和组织方式。
在目的部分，明确本文的研究目标和意义。
正文部分主要分为甲胎蛋白的介绍和化学发光法的原理两个小节。
在甲胎蛋白的介绍中，详细介绍甲胎蛋白的定义、结构和功能，以及其在人体健康和疾病中的作用。
在化学发光法的原理中，解释了化学发光法是一种检测甲胎蛋白的常用方法，包括原理、步骤和相关的仪器设备。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
1.细胞或组织加 Trizol后，室温放置5min， 使其充分裂解。注：此时可放入-70℃长期保 持。 2.12,000rpm离心5min，弃沉淀。 3.按200ul氯仿/ml Trizol加入氯仿，振荡混 匀后室温放置15min。注：禁用漩涡振荡器， 以免基因组DNA断裂。
4.4℃12,000rpm离心15min。 5.吸取上层水相，至另一离心管中。注：千万 不要吸取中间界面；若同时提取DNA和蛋白质， 则保留下层酚相存于4℃冰箱,若只提RNA，则 弃下层酚相。
实时荧光定量PCR（QuantitativeReal-timePCR） 是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合 酶链式反应（PCR）循环后产物总量的方法。 Real-timePCR是在PCR扩增过程中，通过荧光信号， 对PCR进程进行实时检测。由于在PCR扩增的指数时期， 模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，通过内 参或者外参法可对待测样品中的特定DNA序列进行定量 分析。
RNA提取
12.将提取的RNA于紫外分光光度计上定量测OD
值定量RNA浓度 注：此方法提取RNA A260/A280值在1.6-1.8之 间（组织或细胞量过少，可酌情减少Trizol用量； 组织或细胞用量过多，会引起DNA对RNA的污染）
13.于0.8%琼脂糖凝胶电泳以明确RNA未降解。
技术路线
琼脂糖凝胶
电泳
提取RNA
cDNA合成
统计学处理
qPCR检测
RNA提取
用TRIzol试剂盒提取RNA
TRIzol是一种新型总RNA抽提试 剂，可以直接从细胞或组织中提 取总RNA。其含有苯酚、异硫氰 酸胍等物质，能迅速破碎细胞并
抑制细胞释放出的核酸酶。
RNA提取
带手套是必须的， 手是RNase的主要 来源！
检测肝癌细胞的扩散水平，辅助影像学和病理学检
查。
参考文献
[1]NIEChang-fu,WANGJian-Guo,YANGRui-min.The Detection of AFP mRNA expression in PeriPheral Blood of Patients with Hepotocellular Careinomal Using Real Time RT-PCR Method. Chinese Journal of Misdiagnosties, November2013,Vol.3 No.11
甲胎蛋白基因的检测
outline
实验
目的
方法
可能 设计
路线 的结
与原
理
果分
析
应用
实验目的
目的：通过提取肝癌病人的外周血，根据
mRNA丰度的测定方法，从转录水平对AFP （甲胎蛋白）基因的表达进行检测。
取材：肝癌患者外周血，用健康志愿者与非癌
性肝病患者作为对照组。
实验方法及原理
通过细胞RNA提取技术，然后通过逆转录合成 cDNA，利用qPCR技术，测定AFPmRNA的丰 度。
cDNA合成
cDNA合成使用Promega逆转录试剂盒 反应管中加入1ug总RNA和0.5ug oligodT,70℃预变性5min, 迅速置冰上冷却
加入5×RTbuffer[250mM Tris-HCL(PH8.3),375mM
KCl,15mM MgCl2,50mM DTT]4ul,10mM dNT1ul,RNA酶 抑制剂25U,M-MLV逆转录酶200U,加0.1%DEPC水至总体积 2ml异丙醇/ml Trizol加入异丙醇混匀， 室温放置5-10min。 7.4℃12,000rpm离心10min，弃上清，RNA 沉于管底。 8.按1ml75%乙醇/ml Trizol加入75%乙醇，温 和振荡离心管，悬浮沉淀。 9.4℃ 8,000rpm离心5min，尽量弃上清。 10.室温晾干或真空干燥5-10min。RNA样品不 要过于干燥，否则很难溶解。 11.可用50ul H2O，TE buffer或0.5%SDS溶 解RNA样品，55-60℃,5-10min。
95℃3min灭活逆转录酶,-20℃冻存备用。
RT-PCR
上游引物序列:
5’--TGGGACCCGAACTTTCCAAG--3’
下游引物序列:
5‘--CCTGCAGACAATCCAGCACAT--3’
探针序列：
5’--TGTCCCTCTTCAGCAAAGCAGACT--3’
RT-PCR
统计学处理
统计学处理进行t检验,以p<0.05为显著统计学 差异。
可能的结果分析
肝癌患者与对照组的外周血中AFPmRNA的表
达水平有显著差异。
应用
AFPmRNA由有活性的肝癌细胞表达,坏死后脱落
入血的肝癌细胞不可能有mRNA的表达,即使肝脏 癌组织直接释放少量裸露的AFPmRNA,也会被血 液中丰富的RNA酶所迅速降解,外周血中检出 AFPmRNA即提示血循环中存在活动的肝癌细胞。
50ul PCR反应体系中,包括5×PCR buffer 10ul,AFP 上下游引物各16pmol,荧光探针10pmol,Tag酶 3U,10mM dNTP1ul,cDNA 5ul
在ABIPRISM7700型PCR仪(美国PE公司)进行扩增。 反应条件:93℃预变性2min,93℃45s,55℃120s,共 40个循环。反应结束后由计算机自动得出每ug总RNA 中AFP mRNA的拷贝数。