PCR分析仪器关键技术及其相关标准制定初探
实时荧光定量PCR仪器相关要求
附件1实时荧光定量PCR1. 工作条件：温度：10～35°C；相对湿度：20～80%。
2. 总则：通过对核酸定量检测研究基因表达、SNP分型、甲基化等多种功能。
3. 主要技术要求3.1 内置96孔半导体控温PCR模块。
3.2 五通道检测，每反应孔可进行5重定量。
*3.3 采用检测光滤光片，可检测450～750nm连续波长，提供新染料添加方法，用户自主添加新荧光染料，无需额外购买新的滤光块。
*3.4 CCD摄像机96孔同步成像。
*3.5 温控精度：≤±0.25°C。
3.6 温控范围：4～99.9°C。
*3.7 动力学线性范围：检测10个起始拷贝，101~109九个数量级，致信度99.7%。
以99.7%置信度在20ul反应体系中通过单一报告基团检测1个拷贝的模板。
区分度要有装机试剂盒验证：能分辨1250、2500、5000、10000、20000拷贝数的初始模板标准品各4个重复验证线性准确度，36个重复的5000拷贝和36个重复的10000拷贝能以99.7%的置信度加以区分。
*3.8 有防系统误差方法可供用户选择：内参比荧光Rox，校正加样误差和管间差异。
自主选择是否使用。
3.9 可分辨单位细胞起始拷贝数1~5拷贝之间的样本。
3.10 可分辨起始拷贝数200与300的样本（0.5倍差异）；50ul反应体系检测单拷贝达99.7%置信度。
3.11 卤钨灯激发，96孔样本同步激发，暖光源激发能量强，使用时间可监测。
3.12 支持40分钟以内完成40循环的荧光定量PCR实验，此系统可检测低至1个拷贝的灵敏度和5ul反应体系。
3.13 软件组成*3.13.1 配备完备的定量PCR软件，等位基因分析软件。
原厂的探针及引物设计软件，可用于PCR引物，巢式PCR，多重PCR引物，RT-PCR引物和Taqman探针的设计和自动测试3.13.2 可配备相对定量基因表达软件，可同时对无限个数据进行自动的分析、比对、作出柱状图，用于基因表达，药物疗效考核等相对定量分析。
实时荧光定量PCR国际化标准(二)2024
实时荧光定量PCR国际化标准（二）引言概述实时荧光定量PCR（Polymerase Chain Reaction）是一种高灵敏、高特异性的核酸检测技术，广泛应用于疾病诊断、基因表达分析和药物研究等领域。
为了实现方法和数据的国际标准化，国际上制定了实时荧光定量PCR的国际化标准。
本文旨在介绍实时荧光定量PCR国际化标准的主要内容。
正文内容一、技术要求1.1 具备规范的实验室条件，包括洁净、无尘、无RNA酶污染的实验环境。
1.2 使用具有良好稳定性、一致性和可追溯性的荧光探针和引物。
1.3 验证实验室使用的仪器设备，确保其精确、重复性和灵敏度符合国际标准。
二、质量控制2.1 建立质量控制体系，包括核酸提取、反转录、荧光探针标记等各个环节的质量控制。
2.2 使用合适的内部参照基因或内质控，用于验证试剂盒、仪器设备和实验操作的稳定性和可靠性。
2.3 建立监控样本和质控品的库存管理系统，确保其有效性和可追溯性。
三、方法标准化3.1 设计标准化的实验操作流程，包括样品制备、反转录、PCR 扩增和数据分析等。
3.2 使用适当的PCR引物和荧光探针，根据模板序列设计合理的引物和探针。
验证其特异性和灵敏度。
3.3 建立标准曲线和基准值体系，用于测定目标基因的定量结果，并进行结果的准确性评估。
四、数据分析和结果解释4.1 使用统一的数据分析软件，对实时荧光定量PCR的原始数据进行操作和分析。
4.2 建立标准化的数据处理流程，包括定量结果的计算、统计学分析和差异性评估。
4.3 结果的解释应基于严谨的科学依据和合理的统计学方法，避免主观性和片面性的评价。
五、结果报告和数据共享5.1 根据实验结果的重要性和可信度，及时撰写实验报告，并以适当的形式进行存档和备份。
5.2 结果报告应明确标注实验过程、方法参数、核心数据和评估结果，以便他人能够验证和复现实验结果。
5.3 鼓励将实验结果和数据共享，提供底层数据和分析工具的访问权限，促进实时荧光定量PCR的进一步发展和应用。
PCR技术的简介及检验
肺炎支原体DNA测定
医嘱名称： 病原体DNA测定（肺炎支原体） 英文缩写：MP-DNA 检测方法：荧光定量PCR 标本类型：痰液、咽拭子 结果报告：阴性/阳性（ 5.0×102拷贝/ml ）
结核杆菌DNA测定
医嘱名称： 病原体DNA测定（结核杆菌） 英文缩写：TB-DNA 检测方法：荧光定量PCR 标本类型：痰、血液、脑脊液、宫颈拭子、 尿液、胸腹水 结果报告：阴性/阳性（ 5.0×102拷贝/ml ）
污染处理 PCR的临床应用
乙肝DNA测定
医嘱名称： 乙型肝炎DNA测定 英文缩写：HBV-DNA 检测方法：荧光定量PCR 标本类型：血清、血浆、乳汁 检测下限：1×102 IU/ml
丙肝RNA测定
注
标本送检：必须在抽血后 2h 内送检，否则 核糖核酸易降解，造成假阴性结果 医嘱名称： 丙型肝炎RNA测定 英文缩写：HCV-RNA 检测方法：荧光定量PCR 标本类型：血清 检测下限：5.0×102 IU/ml
人巨细胞病毒DNA测定
医嘱名称： 病原体DNA测定（人巨细胞病 毒测定） 英文缩写：HCMV-DNA 检测方法：荧光定量PCR 标本类型：血浆、乳汁、尿液 检测下限：5.0×102拷贝/ml
解脲脲原体DNA测定
医嘱名称： 病原体DNA测定（解脲脲原体 测定） 英文缩写：UU-DNA 检测方法：荧光定量PCR 标本类型：泌尿生殖道分泌物棉拭子、生 殖道刮片、组织活检标本 结果报告：阴性/阳性（5.0×102拷贝/ml ）
DNA双螺旋
1
2
3
时间（min）
4
5
PCR的基本原理
1 2 模板DNA 3
• PCR反应条件 95℃ • PCR过程 • PCR的特点
pcr技术所需要的基本条件
pcr技术所需要的基本条件PCR（polymerase chain reaction）是一种基因分析技术，可以在体外快速复制特定DNA片段，并扩增其数量。
它在分子生物学研究、基因检测和临床诊断等领域起着重要作用。
然而，要成功进行PCR实验，需要具备一些基本条件。
首先，有一个完善的实验室是进行PCR实验的基本前提。
实验室必须具备基本的安全设施和设备，如消毒柜、生物安全柜和实验室抽风系统等，以确保实验中无害物质的安全处理，同样也要避免对实验物质的污染。
此外，实验室需要有稳定的电力和冷却设备，以保持PCR 反应的温度恒定。
其次，实验室应具备PCR实验所需的基本仪器和试剂。
这包括PCR 仪、电泳装置、恒温水浴等，这些设备对PCR实验来说至关重要。
此外，还需要一系列试剂，如DNA模板、引物和聚合酶等。
这些试剂必须具备一定的纯度和质量，以确保实验的准确性和可重复性。
实验室还应有存储和处理PCR产物的设备和试剂，如电泳背景物和凝胶染色剂等。
同时，对实施PCR实验的操作者来说，需要具备一定的技能和知识。
操作者应熟悉PCR实验的原理、步骤和常见的问题及解决方法。
他们还应具备良好的实验操作技巧和实验纪律，以确保实验的准确性和可靠性。
操作者还要了解PCR实验的优化条件，比如温度梯度、引物设计和反应体系的调整等。
最后，为了保证PCR实验结果的可靠性和可重复性，一些质量控制和标准化的措施是不可或缺的。
这包括定期校验和维护实验室设备，使用合适的阳性和阴性对照进行验证实验，以及记录实验细节和结果等。
总结起来，要成功进行PCR实验，需要具备一个完善的实验室、基本仪器和试剂、熟练的操作者以及质量控制和标准化的措施。
只有在这些基本条件的支持下，PCR技术才能充分发挥作用，并在科研和临床应用中发挥重要作用。
因此，对于从事PCR研究的科学家和临床医生来说，建立和维护这些基本条件非常重要。
同时，也需要不断进行技术更新和学习，以提高PCR实验的可靠性和准确性。
pcr技术
pcr技术PCR技术简述PCR（聚合酶链式反应）是一种在分子生物学领域中广泛应用的技术，它通过扩增DNA序列，使得微量的DNA可被放大到足够进行分析和检测。
PCR技术的发明者是美国生物化学家凯瑟琳·穆利斯和基瑞克·穆利斯，他们在1983年首次描述了PCR技术的原理和应用。
PCR技术的原理基于DNA的双链结构以及DNA聚合酶的酶活性。
首先，需要将DNA样本经过解链处理，使得DNA的两条链分离。
然后，通过引物（primers）的引导，DNA聚合酶在适当的温度下，将碱基按序合成新的DNA链。
在这个过程中，由于DNA聚合酶的高保真性，其错误复制的错误率非常低。
PCR技术的应用非常广泛。
一方面，PCR技术可以用于DNA的克隆，即通过扩增特定目标序列，大量复制所需的DNA片段。
这项技术在基因工程、遗传学、疾病诊断以及法医学中有着重要的应用。
另一方面，PCR技术还可用于DNA的测序，即通过大量扩增DNA片段的方法，快速获取准确的DNA序列信息。
这项技术在基因组学、进化生物学等领域具有重要意义。
PCR技术具有许多优点。
首先，PCR技术具有高效快速的特点。
在PCR反应中，只需几个小时就能从微量的DNA样本扩增出大量的DNA。
其次，PCR技术的扩增过程是在体外进行的，不依赖于生物体，也不受DNA序列的限制。
第三，PCR技术对DNA样本的要求较低，只需微量的DNA就可以进行扩增。
最后，PCR技术的扩增结果可以被检测和分析，从而实现对特定DNA序列的定量和定性研究。
然而，PCR技术也存在一些限制。
首先，由于PCR技术的扩增过程是指数型增长，因此存在扩增产物的竞争问题，这可能导致非特异性扩增。
其次，PCR技术对引物的设计和选择要求较高，如果引物选择不当，可能会导致扩增失败或非特异性扩增。
此外，PCR技术还存在杂交、污染和抑制等问题，这可能对结果的准确性产生影响。
为了解决PCR技术的一些限制，研究人员对PCR技术进行了改进和创新。
实时荧光定量PCR仪技术参数与要求
实时荧光定量PCR仪技术参数与要求
一、技术参数
1、样品容量：96孔,双反应模块或以上，可同时运行两个不同的反应程序.
2、激发光源：LED
3、检测器：高灵敏度光电传感
4、检测通道：4通道或以上
5、适用耗材：0.2ML PCR管、8联管、48孔板
6、反应体积：15~100ul
7、激发、检测光的传输模式:每一反应孔独立的光纤传输
8、可检测的荧光素及染料：FAM,SYBR，VIC, HEX, Joe, TET，TMRA，CY3，ROX, Texas Red, CY5
9、软件应用模式：定量/定性、熔解曲线、多管多项目分析、相对定量、等位基因、HRM、SAT实时荧光等温扩增
10、控温模式：半导体热电模块
11、模块温度范围：4-99℃
12、检测动力学范围：10-1010
13、检测灵敏度：可检测单拷贝基因
14、最大升降温速率：≥3℃／Ｓ, 孔间温度均匀性：±0.2℃, 温度准确性：±0.2℃
15、热盖：电子自动锁控热盖
16、注册认证：SFDA，操作软件：全中文，有断电保护
二、配件要求描述：
1、电脑：品牌电脑一台(最低配置CPUi3,内存4GＢ,硬盘500Ｇ)
2、装机试剂：一盒。
三、其它要求
1、免费现场安装培训，主机免费保修三年，终身维护。
2、投标人或生产厂商湖南省总代理在本省有具有专职的售后服务人员，能够2小时内响应，48小时内现场支援。
3、市场占有率高：省内三级医院不少于10家并提供联系方式以供备查。
QPCR技术细节解析
原因：① 试剂配制时反应液没完全溶化，导致探针量在一管中增多； ② 试剂配制时没有充分混匀致各管中各成分的量不同； ③ 也可能是PCR仪热槽被荧光物质污染，这时就要清除热槽中的污染；
误差分析及操作规范
3.样品浓度跨度过大
样品浓度过高，至阳性样品扩增曲线在后面循环中呈一向
下游反应数确定反转录体积 选择应用引物
试剂选择
模板准备 上机 数据分析
AMV M-MLV Quant Super
高效、全长的cDNA
GC％：50－60％ Tm：55－60℃
单个碱基重复＜4个
引物设计
无二级结构 引物位置
扩增长度：50－150bp
65oC
误差分析及操作规范
同一cDNA样品的三个重复
误差分析及操作规范
1. 模板浓度越低，染料法的误差越大
如图一系列梯度稀释的模板，理论上它们在扩增曲线上的CT值之差，应该相等，但 是后边几个浓度低的样品CT值明显提前了，由熔解曲线可知对于浓度低的样品，引 物二聚体引起的误差非常严重。
误差分析及操作规范
误差分析及操作规范
4. 部分样本扩增效率过低
原因：① 提取液残留，一定程度抑制了PCR反应；② 反应液未严格取量混匀或分装不 均匀；③试剂失效；
误差分析及操作规范
5. 阴性对照或空白对照翘尾
原因：①模板提取环境有污染；②模板提取操作有污染；③试剂配制过程存在污染；
误差分析及操作规范
6. 直线型扩增曲线
内容概要
荧光定量PCR的原理
荧光定量PCR的标记方法
实验流程及注意事项 荧光定量PCR解析方法
常用荧光标记方法
PCR技术详解
PCR技术详解
2. 引物 引物是PCR特异性反应的关键, PCR产物的特异性 取决于引物与模板DNA互补的程度；引物浓度一般 为0.1-0.5 mol/L，浓度过低影响产量，偏高引 起错配和非特异性产物增加，且可增加引物二聚 体的产生几率
引物设计原则：
①引物长度： 15-30bp，常用为20bp左右； ②引物扩增跨度： 以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长
至10kb； ③引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不
佳，G+C过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避 免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列；
PCR技术详解
• 1988 年 ， Saiki 等 人 从 嗜 热 杆 菌 (thermus aquaticus) 中 提 出 TaqDNA 聚 合 酶 ， 使 得 PCR技术得以广泛应用
• 1993年，Mullis等因此项技术获诺贝尔化 学奖
PCR技术详解
二、定义
PCR(聚合酶链式反应）是利用DNA在体外高 温（95℃左右）时变性成单链，低温退火（经常是 60℃左右）时引物与单链按碱基互补配对原则结合， 再调温度至DNA聚合酶最适反应温度（72℃左右）， DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5’~3’)的方向延 伸合成互补链
PCR技术详解
八、常见问题分析
1. 不出现扩增条带 分析原因：模板、酶失活或污染、引物对的质量和浓度、PCR产
物电泳检测时间一般为48h内 2. 假阳性 分析原因：模板或扩增产物的交叉污染 3. 非特异性扩增带 分析原因：引物与靶序列未完全互补或引物聚合形成二聚体、镁
离子浓度过高、退火温度过低、酶不合格或酶量过多 4. 出现片状拖尾或涂抹带 分析原因：模板降解、酶不合格或酶量过多、镁离子浓度过高、
评价荧光定量PCR仪，用这些指标
评价荧光定量PCR仪，用这些指标荧光定量PCR的检测是一系列从采样、保存运输、样品处理、核酸提取、扩增等一系列流程的组合，任何一个环节出现问题都会导致最终结果的错误。
虽然在前面一系列的文章中讲述了提取试剂、扩增试剂的评价但是这些仍远远不够，因此我在后续的文章中会尽可能覆盖到所有的检测环节。
荧光定量PCR的检测离不开荧光定量PCR试剂和荧光定量PCR 仪器。
试剂的评价可以参考（诊断试剂评价系列2-核酸检测方法（更正））。
但是每次提到荧光定量PCR仪的评价，大家总是望而却步。
一方面原因是荧光定量PCR仪涉及很多温度、光电信号需要专业的设备来评估，另一方面也确实不知道从哪里入手。
今天我们梳理下在核酸检测实验室中如何通过试验来评价荧光定量PCR仪。
荧光定量PCR仪的物理性能试验相关指标通过物理方法测定PCR性能的试验。
主要包括测定温度和荧光来进行评价，由于需要专业的设备，建议联系计量部门或仪器厂家进行相关指标的测定。
1.最大升温速率：50℃-90℃应不小于2.5℃/秒。
2.3.平均升温速率：50℃-90℃应不小于1.5℃/秒。
4.最大降温速率：90℃-50℃应不小于2.0℃/秒。
5.平均降温速率：90℃-50℃应不小于1.5℃/秒。
6.模块控温精度：应不大于0.5℃。
7.温度准确度：测定值与设定值应不超过±0.5℃。
8.模块温度均匀性：温度差值在±1℃范围内。
9.温度持续时间准确度：温度持续时间与设定温度时间偏差在±5%以内。
10.热盖温度偏差：温度差值在±3℃范围内。
11.荧光强度检测重复性：高中低浓度校准染料重复测定的变异系数不大于3%。
12.荧光强度检测精密度随机选取10个及以上个检测孔，用高中低浓度校准染料进行检测，变异系数不大于5%。
13.不同通道荧光干扰其他通道荧光检测强度不高于目标通道荧光阈值。
14.荧光定量PCR仪的生物化学试验相关指标对温度敏感的PCR反应对PCR仪进行生化性能试验。
PCR仪确认方案
PCR仪确认方案PCR仪是一种用于扩增DNA片段的仪器，是分子生物学实验室中常用的设备之一、为了确保PCR仪的准确性和可靠性，需要进行PCR仪的确认方案。
下面是一个详细的PCR仪确认方案，包括仪器准备、性能测试和验证步骤。
一、仪器准备1.确定确认PCR仪的固定条件，例如温度范围、时间设置等。
2.准备PCR仪所需的耗材，包括PCR试管、PCR反应物、引物等。
3.清洁PCR仪的工作台面和内部，确保无灰尘和杂质。
二、性能测试1.温度精确度测试a.使用温度计分别测量PCR仪的加热块和冷却块的温度，记录温度值。
b.以设置的温度为目标值，在PCR反应槽中设置温度计，进行温度稳定性测试。
c.比较目标温度和实际温度之间的差异，计算温度偏差。
2.温度一致性测试a.在PCR反应槽中放置数个PCR试管，每个试管中加入相同的反应物。
b.设置PCR仪的温度循环程序，进行温度一致性测试。
c.检查各个PCR试管中的反应物扩增结果，评估PCR仪温度循环的一致性。
3.温度均匀性测试a.在PCR反应槽中设置多个温度计，测量不同位置的温度。
b.运行PCR仪的温度循环程序，观察和记录各个位置的温度。
c.比较各个位置的温度差异，计算温度均匀性。
4.反应时间测试a.在PCR反应槽中放置PCR试管，设置不同的扩增时间。
b.完成PCR反应后，分析PCR试管中的扩增结果，评估PCR仪的反应时间准确性。
三、验证1.重复性验证a.准备相同的PCR反应物和程序，分别在不同的PCR仪上进行PCR扩增。
b.比较各个PCR仪之间的扩增结果，评估其重复性。
2.敏感性验证a.准备不同浓度的DNA样品，分别加入PCR反应槽进行PCR扩增。
b.比较不同浓度DNA样品的扩增结果，评估PCR仪的敏感性和线性范围。
3.特异性验证a.准备包含目标基因和非目标基因的PCR反应槽，进行PCR扩增。
b.检查PCR试管中的扩增产物，确认PCR仪的特异性。
四、记录和分析结果1.记录每个测试项目的结果，包括温度精确度、温度一致性、温度均匀性、反应时间等。
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作者单位【中国计量科学研究院】固
ＰＣＲ分析仪器关键技术 及其相关标准制定初探
口莫晓山陈宪
目前．以实时荧光定量ＰＣＲ分析仪为代表的ＰＣＲ仪器 已经实现了从ＰｃＲ扩增到ＰＣＲ分析过程的高度自动化及 智能化。ＰＣＲ分析仪器主要包括温度控制系统、光电检测 系统和计算机控制及处理系统，集成了计算机、机械、电 子和传感器等领域的最新技术成果。ＰＣＲ分析仪器及技 术在生物学及医学等诸多研究应用领域发挥着越来越重 要的作用．但是目前国内尚没有制定针对ＰＣＲ分析仪器 的行业标准及国家标准。也没有相应的检定规程／校准规 范．不能满足相关仪器生产厂家及应用单位的需求。为
常见 参数 范围
４一ｌｏｏ
表１
ＰＣＲ分析仪器主要性能参数
温度参数 荧光检测系统参数 温控 准确度 （℃） 温度 均匀性 （℃） 激发 光类型 分辨率 （ｂｉｔ） 检测 灵敏度 （拷贝数） 线性 范围
参数 类型
温控 范围 （℃）
升降温 速度 （。Ｃ／ｓ） 国内≥４．０； 国外可达到 升温速度＞ １５；降温速 度＞２０
技术篇ｌ化学计量与分析技术戳瀚麟辫瓣壤灞隧瀚戳黼溺嬲黼黧瓣戮徽鬃溉豳澄氍黧
２．ＮＡＡ的应用
元素的检出限为５０斗ｇ／ｇ，重元素为５¨ｇ／ｇ；荧光ｘ射线谱线
简单．相互干扰少，制样简单，样品不必分离。分析方法比 较简便；样品不被破坏，固体、粉末、液体均可分析；速度 快．在短时间内可同时完成多种元素的分析：可对多层镀 膜的各层镀膜分别进行成分和膜厚的分析。但方法的灵 敏度偏低。一般只能分析含量大于０．Ｏｌ％的元素：基体效 应比较大。常需用基体相近的标准物质进行校准。
２．ＸＲＦ的应用
特别适合考古学中的元素分析．主要用于测量陶瓷、 玻璃、银币、铜镜、燧石、骨头化石等样品中的微量和痕量 元素；在环境、生物、地学、材料、法学等微量元素分析工作 中得到广泛应用：在标准物质研制中的应用，常用于均匀 性检验．如奶粉中钠、钾、钙、锌。土壤中无机成分均匀性检 验等：用于脱脂奶粉中钠、钾、钙、锌、氯、锰、硒、铁、溴和铷 等成分的定值。聚丙烯中镉、铬、汞等成分的国际比对等。 九、Ｘ射线荧光光谱法（Ｘ
检定规程，校准规范的制定提供有益的参考。 一、ＰＣＲ技术概述 ＰＣＲ技术是一项在短时间内体外大量扩增特定的 ＤＮＡ片段的分子生物学技术。ＰＣＲ技术问世２０多年来．经 历了不断发展、完善的历程，最重要的一项技术飞跃是 １９９６年由美国Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ公司推出的实时荧光定 量ＰＣＲ（ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ
±０．１～ ±０．４
４－０．０１～ ４－０．５
ＬＥＤ或 氩离子 激光器
１２
９一１２
单个
数量级
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万方数据
技术篇Ｉ化学计量与分析技术
法的国家标准或行业标准．ＩｌｌＧＢ［Ｆ１９４３８．１—２００４（＜８５亚型 禽流感病毒荧光ＲＴ—ＰＣＲ检测方法》等。但是，专门针对 ＰＣＲ分析仪器的标准及检定规程还是空白。 ＰＣＲ分析仪器是精密光机技术、微电子技术、计算机 技术和测量控制技术有机结合的产物．核心功能是保证 生化反应的顺利有效完成以及结果的准确检测．其关键 技术指标如本文之前所述．包括温度控制指标和荧光检 测系统指标两大类。所以．ＰＣＲ分析仪器的标准及检定 规程首先要包含温度控制的准确度、均匀性、升降温速 度以及光电系统检测分辨率和灵敏度等指标。而对于这 些指标测定的方法细节需进行认真的考量．如测温探头 放置的位置、测温元件及读数仪器的选择、温控指标测 定的温度变化范围及循环的设计等．除了关键部分的技 术指标，对于荧光定量ＰＣＲ分析仪．最重要的总体性的 指标就是定量结果的准确性和重复性等。而与其他领域 的一些仪器有所区别的是．ＰＣＲ分析仪器由于涉及生化 反应．试验时选用的生化试剂的质量很大程度上影响检 测的结果。ＰＣＲ反应时的模板ＤＮＡ、引物、ＤＮＡ聚合酶、 缓冲溶液浓度以及为了荧光检测而加入的荧光染料或 探针．都直接影响反应的特异性和扩增效率。进而影响 检测结果的准确性和重复性。所以，选取并确定一套稳 定可靠的生化标准物试剂盒．也成为制定ＰＣＲ分析仪器 标准的一个关键。国内科研单位在针对特定的目标ＤＮＡ 的ＰＣＲ标准物质研究方面．已经取得了一些成果．如 ＨＩＶ－１ＲＮＡ、丙型肝炎病毒核酸等标准物质的研制等。 ＰＣＲ分析仪器标准及检定规程制定时．可考虑利用这些 成果选择或研制稳定可靠的标准物质。另外．ＰＣＲ分析 仪器相关标准的制定也要考虑仪器其他一些功能的完 善程度，如一次测试样品数量（通量）、仪器自检、通道选 择、循环参数设定方式等。最后．制定较为客观的ＰＣＲ分 析仪器标准离不开对各厂家的ＰＣＲ分析仪器进行摸底 调研，对其性能进行对比分析。这方面。一些ＰＣＲ分析仪 器的使用单位以及科研人员已经做了一些工作．提供了 有益的参考。 总之．ＰＣＲ分析仪器相关标准及检定规程，校准规范的 制定是一项十分有意义的工作．将为规范ＰＣＲ分析仪器的生 产与使用，推动ＰＣＲ技术的发展与应用起到积极的作用。
ＸＲＦｌ Ｒａｙ
Ｆｌｏｕｒｅｓｅｅｎｅｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ，
广泛应用于冶金、地质、化工、机械、石油、建材、考古 等工业部门。还用于测定涂层和金属薄膜厚度、组成以及 动态分析等。在标准物质研制中．因制样简单．常用于均匀 性检验，如脱脂奶粉中氯、钾、钙。烟草中氯、钾、锰，聚乙烯 中钠、硅、磷、硫、钙、钛、铬、锌。以及土壤中无机成分均匀性 检验等；在定值中，由于缺乏相应的参考标准，应用较少。 美国国家标准与技术研究院（ＮＩＳＴ）的专家．多年来研究 ＸＲＦ在定值中的应用技术．具体应用也比较多．如聚乙烯中 钠、硅、磷、硫、钙、钛、铬、锌的定值，并参加聚丙烯中的铬、 镉、汞和铅的比对。 总之。基体标准物质因其复杂性，选用定值技术时。 需要考虑的因素较多，希望通过本文的介绍．提供一些基 本的参考信息。
作者单位【湖南省计量检测研究院】岛
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Ｏｔ＝ｏ，ｅｔ，，＇Ｄ
四、有待进一步开展的试验研究 尽管我公司近十几年来对弯管流量计作了大量的试 验研究．取得了一系列重要成果．对弯管流量计的发展和 应用作出了积极贡献。但是一个公司试验研究的力量毕
式中可达２０聊ｓ。荧光检测系统指标包括激发光波
长、分辨率和检测灵敏度。激发光波长一般在蓝光到紫外 光范围内，常用为４５０ｎｍ、４７０ｎｍ、４８８ｎｍ，分辨率为（１２。 １６）ｂｉｔ。检测灵敏度一般在１００个拷贝以内。表１列出了 ＰＣＲ分析仪器的关键技术参数及常见的参数值范围。 三、关于制定ＰＣＲ分析仪器相关标准的探讨 ＰＣＲ分析仪器性能的好坏将直接影响ＰＣＲ的效果以 及检测结果的准确性和可靠性。而随着基因科学以及分 子生物学等领域对分析水平要求的不断提高．人们也希 望相关厂家能提供功能更完善、分析快速、检测准确性和 灵敏度高、性能更优越的ＰＣＲ分析仪器。 在此背景下．相关的使用以及生产单位都迫切希望 能尽快建立一套比较客观地评价及检定ＰＣＲ分析仪的技 术性能指标的标准及方法体系。目前．国内已经建立了一 些农业、食品及医学检测领域的特定基因的ＰＣＲ检测方
ｆｌｕｏｒｏ—ｇｅｎｅｔｉｃ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ
ＰＣＲ，ＦＱ—
ＰＣＲ）。该技术不仅解决了传统ＰｃＲ不能准确定量以及容
易交叉污染、产生假阳性的问题，而且与常规ＰＣＲ相比。
它具有特异性更强、自动化程度更高的优点。所谓实时 荧光定量ＰＣＲ技术．是指在ＰＣＲ反应体系中加入荧光染
此．本文从介绍ＰＣＲ技术原理出发，对ＰＣＲ分析仪器关键
原子核的内层电子吸收Ｘ射线辐射能量后发生跃迁． 在内层电子轨道上留下一个空穴．处于高能态的外层电 子跳回低能态的空穴．发生跃迁．以Ｘ射线的形式放出能 量．产生元素特征的Ｘ射线荧光谱线。通过测定特征Ｘ射 线的能量确定元素的存在．特征Ｘ射线的强度确定元素 的含量。仪器有波长色散ｘ射线荧光光谱仪、能量色散Ｘ 射线荧光光谱仪、全反射Ｘ射线荧光光谱仪。 １．ＸＲＦ的特点 分析元素范围广，除了氢、氦、锂、铍外，可对周期表 中从原子序数５Ｂ到９２Ｕ的所有元素进行定性和定量分 析，常规分析一般用于Ｚ≥９（氟）的元素：定量分析线性范 围宽，从常量到微量均可分析．对于固体和粉末样品。轻
欢大力宣传的指标——升降温的速度。更快的升降温速
度．可以缩短反应进行的时间。而且减小了产生非特异性 结合的可能性。能提高ＰｃＲ反应的特异性。 主流实时定量ＰＣＲ分析仪的温度控制系统主要有 两种．一种是以ＡＢＩ为代表的采用Ｐｅｌｔｉｅｒ半导体作为温 控模块的．其优点是易自动化、速度快、直接进行加热 降温。Ｐｅｌｔｉｅｒ半导体主要的缺点是温度均一性不佳。不 过ＡＢＩ系列的定量ＰＣＲ分析仪通过在检测试剂中加入内 参ＲＯＸ来校正孔间差异．很好地解决了温度均一性的问 题。另一种温控系统是以Ｒｏｃｈｅ公司生产的ｂｇｈｔｃｙｃｌｅｒ为 代表的空气加热。ＰＣＲ扩增样品槽被设 计为离心转子的模样．借助空气加热和 转子在腔内旋转．转子上每个孔都是“等 位”的．几乎无差别。很好地保证了每个 样品孔之间温度的均一性。此外。空气加 热设计带来的最直观、最突出的优点是， 由于离心式的空气加热大大加快了升降 温速度．使运行一次ＰＣＲ所需的时间大大 缩短。不过。空气加热式ＰＣＲ分析仪也存
技术及指标进行分析。从而为ＰｃＲ分析仪器相关标准及
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万方数据
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料或荧光标记的探针．利用荧光信号积累实时监测整个 ＰＣＲ过程．最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析 的方法。 二、ＰＣＲ分析仪器关键技术及指标 目前．ＰＣＲ分析仪器的生产和应用以荧光实时定量 ＰＣＲ分析仪为主。荧光定量ＰＣＲ分析仪的核心部分主要包 括温度控制系统和荧光检测系统。 ＰＣＲ分析仪器在变性、退火及延伸３个阶段控温的准 确性和稳定性直接影响基因片段的扩增质量。ＰＣＲ分析 仪器的温控系统指标主要包括温控准确性、均匀性和升 降温速度。温度的准确性是指样品孔温度与设定温度的 一致性．它直接关系到实验的成败。如果排除样品加入过 程中的问题．对于ＰＣＲ反应而言，最重要的莫过于温度控 制的准确性。由于ＰＣＲ是一个几何级数扩增的过程．扩增 过程中退火温度的细微变化会被放大而直接影响结果。 不论是变性、退火还是延伸都需要准确控制温度，对退火 温度而言．温控显得尤为重要．有时ｌ℃甚至０．５０Ｃ的差异 也将决定实验的成功与失败。因而对ＰＣＲ扩增仪而言。温 度控制就意味着质量。温度的均匀性是指样品孔间的温度 差异．它关系到在不同样品孔进行反应结果的一致性。ＰＣＲ 分析仪器的温度均匀性不好．即“位置的边缘效应”会影响 结果的可重复性。正是这种位置效应对定量ＰＣＲ的结果的 影响更为明显．所以后来才有Ｒｏｃｈｅ和Ｃｏｂｂｅｔｔ的离心式定 量ＰＣＲ的重大创新。温度控制除了准确度，还有一个厂家喜 在对样品量有限制等缺陷。 至于荧光检测系统。多色多通道检测是当今的主流。 荧光检测系统主要包括激发光源和检测器。激发光源有 卤钨灯光源、氩离子激光器、发光二极管（ＬＥＤ）光源，前 者可配多色滤光镜实现不同激发波长．但是寿命短．更换 费用高：而单色发光二极管（ＬＥＤ）价格低、能耗少、寿命 长．但由于是单色，需要不同的ＬＥＤ才能更好地实现不同 激发波长。监测系统有超低温光电耦合（ＣＣＤ）成像系统、光 电二极管（ＰＤＴ）和光电倍增管（ＰＭＴ），三者灵敏度依次递 增．但ＣＣＤ可以一次对多点成像．而ＰＤＴ和ＰＭＴ一次只能扫 描一个样品．需要通过逐个扫描实现多样品检测，对于大 量样品来说需要较长的时间。 ＰＣＲ分析仪器的两大核心部分决定了其关键技术指 标．主要有温度控制指标和荧光检测系统指标两大类。其 他的性能指标有最大样品数和最大循环次数等．对于定 量ＰＣＲ分析仪器．性能指标还包括定量检测结果的准确 性和重复性。温度控制指标包括控温范围、升降温速度、 控温准确度和均匀性。控温范围一般在环境温度到１０００Ｃ 之间．采用制冷措施后温度下限可以低于环境温度。升降