PCR技术
PCR技术
PCR技术PCR（Polymerase Chain Reaction）技术是一种用于扩增DNA片段的重要分子生物学技术。
通过PCR技术，可以在体外迅速扩增出特定的DNA序列，使得该技术在基因分型、基因克隆、基因重组、遗传病检测等领域得到广泛应用。
PCR技术主要包括三个步骤：变性、退火和延伸。
首先，通过高温（通常为94-98°C）将DNA双链变性为两个单链。
然后，通过降低温度（通常为50-65°C）使引物与目标序列互补结合。
最后，通过DNA聚合酶的活性，在适当的温度条件下（通常为72°C），引物通过DNA聚合酶的催化作用将目标序列进行扩增。
PCR技术中，引物的设计起着至关重要的作用。
引物是指在DNA序列两侧能够与目标序列互补结合的寡核苷酸序列。
在PCR扩增的第一步中，引物通过与目标序列的互补性结合来引导DNA的扩增。
因此，引物的设计需要考虑以下几个因素。
首先，引物的长度应该在18-30个碱基对之间，通常为20-25个碱基对。
引物过短可能无法确保特异性扩增，引物过长可能导致目标序列的特异性降低。
其次，引物的Tm（熔解温度）应该在55-65°C之间。
熔解温度是引物与目标序列结合的温度，过低的熔解温度可能导致非特异性产物的扩增，过高的熔解温度可能导致引物无法结合目标序列。
此外，引物的GC含量也是设计引物时需要考虑的因素之一、GC含量的适宜范围通常为40-60%，过高或过低的GC含量可能导致引物的特异性降低。
最后，引物之间不能有自身互补性或引物之间的互补性。
自身互补性可能导致引物形成二聚体，而引物之间的互补性可能导致不特异性产物的扩增。
在引物设计方面，可以借助于计算机软件进行引物的全面评估。
目前常用的引物设计软件有Primer3、OligoAnalyzer等。
通过在这些软件中输入目标序列，可以获得一系列满足上述设计准则的引物。
综上所述，PCR技术是一种重要的分子生物学技术，而引物的设计是PCR技术中至关重要的一环。
pcr技术有几种
PCR技术有几种PCR（聚合酶链式反应）是一种广泛应用于分子生物学领域的技术，其原理和过程都非常重要。
PCR技术可以迅速复制DNA片段，并在实验室中进行分析和研究。
PCR技术有几种不同的变体，每一种都有其特定的应用领域和优势。
1. 标准PCR标准PCR，也被称为常规PCR或传统PCR，是PCR技术最常用的形式。
在标准PCR中，需要使用DNA模板、一对引物、四种核苷酸和DNA聚合酶。
PCR反应从一段DNA的两端引导酶链的扩张，通过多次循环反复进行，最终产生大量的DNA复制产物。
标准PCR可用于多种应用，如基因克隆、基因表达定量分析、基因突变检测等。
它是分子生物学研究中最重要且最常用的工具之一。
2. 实时定量PCR实时定量PCR（qPCR）是PCR技术的一种改进形式，可以在PCR反应过程中实时监测扩增产物的积累量。
该技术利用荧光染料或探针标记扩增产物，通过测量荧光信号的强度来确定反应体系中的DNA量。
实时定量PCR广泛应用于基因表达分析、病原体检测、药物研发等领域。
由于其高灵敏度、准确性和快速性，成为许多实验室和医学机构的首选技术。
3. 逆转录PCR逆转录PCR（RT-PCR）是用于将RNA转录为相应的DNA的技术。
逆转录PCR结合了逆转录酶的作用和标准PCR的扩增机制，可以从RNA中合成DNA，进而进行进一步的分析。
逆转录PCR在研究基因表达和分析RNA病毒等方面发挥着重要作用。
它可用于确定基因是否转录为RNA，并量化RNA的表达水平。
4. 梯度PCR梯度PCR是一种对PCR反应条件进行逐步优化的技术。
通过在反应管中创建不同温度的梯度，可以在一个PCR实验中测试多个不同条件下的扩增效果。
这有助于确定最佳的PCR条件，以提高扩增效率和特异性。
梯度PCR在优化引物和降低非特异引物扩增的干扰方面非常有用。
对于特定的PCR 反应，梯度PCR可以提供更准确和高效的结果。
综上所述，PCR技术有多种不同的变体，每一种都有其特殊的应用领域。
pcr技术
pcr技术PCR技术简述PCR（聚合酶链式反应）是一种在分子生物学领域中广泛应用的技术，它通过扩增DNA序列，使得微量的DNA可被放大到足够进行分析和检测。
PCR技术的发明者是美国生物化学家凯瑟琳·穆利斯和基瑞克·穆利斯，他们在1983年首次描述了PCR技术的原理和应用。
PCR技术的原理基于DNA的双链结构以及DNA聚合酶的酶活性。
首先，需要将DNA样本经过解链处理，使得DNA的两条链分离。
然后，通过引物（primers）的引导，DNA聚合酶在适当的温度下，将碱基按序合成新的DNA链。
在这个过程中，由于DNA聚合酶的高保真性，其错误复制的错误率非常低。
PCR技术的应用非常广泛。
一方面，PCR技术可以用于DNA的克隆，即通过扩增特定目标序列，大量复制所需的DNA片段。
这项技术在基因工程、遗传学、疾病诊断以及法医学中有着重要的应用。
另一方面，PCR技术还可用于DNA的测序，即通过大量扩增DNA片段的方法，快速获取准确的DNA序列信息。
这项技术在基因组学、进化生物学等领域具有重要意义。
PCR技术具有许多优点。
首先，PCR技术具有高效快速的特点。
在PCR反应中，只需几个小时就能从微量的DNA样本扩增出大量的DNA。
其次，PCR技术的扩增过程是在体外进行的，不依赖于生物体，也不受DNA序列的限制。
第三，PCR技术对DNA样本的要求较低，只需微量的DNA就可以进行扩增。
最后，PCR技术的扩增结果可以被检测和分析，从而实现对特定DNA序列的定量和定性研究。
然而，PCR技术也存在一些限制。
首先，由于PCR技术的扩增过程是指数型增长，因此存在扩增产物的竞争问题，这可能导致非特异性扩增。
其次，PCR技术对引物的设计和选择要求较高，如果引物选择不当，可能会导致扩增失败或非特异性扩增。
此外，PCR技术还存在杂交、污染和抑制等问题，这可能对结果的准确性产生影响。
为了解决PCR技术的一些限制，研究人员对PCR技术进行了改进和创新。
PCR技术
循环次数 按变性，退火，延伸的程 序进行PCR循环，可以根据需要确定 循环次数。 循环次数决定PCR扩增程 度。PCR循环次数主要取决于模板 DNA的浓度。一般的循环次数选在 30～40次之间。如有需要，可将上次 的PCR产物稀释后，重新进行PCR循 环。
上述过程结束后，从PCR仪中取出PCR管，用微 量移液器从中取10μL ，加入Loading Buffer(12μL)，充分混匀，制成混和均匀的混合物。 六﹒ PCR扩增产物的检测分析 凝胶电泳常用的有琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺 凝胶电泳，前者主要用于DNA片段大于100bp者， 后者主要用来检测小片段DNA。
（1）制胶 琼脂糖凝胶厚度要适中。过薄则加样孔样品 会溢出来，过厚观察时荧光穿透不强以至有 些小片段DNA带型不易分辨。如配制2%凝 胶100ml，称取琼脂糖2g于三角瓶中，加入 100ml 0.5×TBE液，微波炉加热2-5min， 使琼脂糖完全溶解（注意不要暴沸），置室 温等温度下降至60℃时，加入终浓度 0.5μg/ml的EB液，充分混匀后倒板（注意排 除气体）。
PCR仪：
冷冻离心机：
核酸电泳仪：
制冰机：
实验步骤：
一.引物设计 引物设计原则： 1. 引物与模板的序列要紧密互补 2. 引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构 3. 引物不能在模板的非目的位点引发DNA聚合反 应(即错配)。 使用不合适的 PCR 引物容易导致实验失败：表现为扩增 出目的带之外的多条带（如形成引物二聚体带） ，不出 带或出带很弱，等等。
ddH2O 21μL
总计 50μL
三.将装有上述混合物的PCR管放入冷 冻离心机，1000r/m离心10s,用于混匀 反应物。 四.将管置于PCR仪中，设置反应参数： 预变性 95℃ 5min 变性 95℃ 30s
pcr技术介绍
PCR技术介绍1、聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction，PCR），是一项在短时间内采用两引物大量扩增特定的DNA片段的分子生物学技术。
每个循环之后，模板量为原来的2倍。
它可将极微量的靶DNA特异地扩增上百万倍。
极大地提高核酸分子检测的灵敏度，理论上其检测的灵敏度可以达到一个细胞甚至一个分子水平。
2、PCR扩增模式图PCR反应的特点：高度特异性、高度敏感性、高丰度产量3、PCR技术原理循环次数DNA的链数121222243238102101024202201,048,576302301,073,741,82410亿一、PCR的基本原理PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。
PCR由变性——退火——延伸三个基本反应步骤构成：1、模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；2、模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；3、引物的延伸：DNA模板——引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链。
4、重复循环变性——退火——延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。
每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。
（一）普通PCR系统1.PCR反应体系：DNA聚合酶DNA靶序列两端引物脱氧核苷酸dNTPs缓冲液2.DNA的合成方向：5’→3’3.Taq DNA聚合酶4.PCR循环：变性退火延伸（二）PCR循环第一步——变性（93~98℃）：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备。
pcr技术原理及步骤
pcr技术原理及步骤PCR技术原理及步骤。
PCR（Polymerase Chain Reaction）技术是一种分子生物学技术，它能够在短时间内从少量DNA样本中扩增出足够多的DNA片段，是分子生物学实验中常用的技术之一。
本文将介绍PCR技术的原理及步骤。
一、PCR技术原理。
PCR技术是通过DNA聚合酶（DNA polymerase）在一系列温度循环中，不断地复制DNA片段，从而实现DNA的扩增。
其基本原理如下：1. 双链DNA解旋，首先将DNA样本加热至94-98°C，使双链DNA解旋成两条单链DNA。
2. 引物结合，将温度降低至50-65°C，引物（primers）与单链DNA互相结合，为DNA聚合酶提供复制的起点。
3. DNA聚合，将温度升高至72°C，DNA聚合酶开始复制DNA片段，合成新的DNA链。
通过这样的温度循环，可以在短时间内扩增出大量的目标DNA片段。
二、PCR技术步骤。
1. 样本处理，首先需要从样本中提取DNA，通常使用酚/氯仿法或商用DNA提取试剂盒进行DNA提取。
2. 引物设计，根据目标DNA序列设计引物，引物的选择对PCR扩增的效果至关重要。
3. PCR反应体系配置，配置PCR反应体系，包括DNA模板、引物、DNA聚合酶、缓冲液、dNTPs等成分。
4. PCR扩增，将反应体系置于PCR仪中，进行一系列温度循环，完成DNA的扩增。
5. PCR产物分析，通过琼脂糖凝胶电泳或其他方法对PCR产物进行分析，验证扩增效果。
三、PCR技术应用。
PCR技术在分子生物学研究、医学诊断、法医学和生物工程等领域有着广泛的应用。
例如，可以用于基因克隆、基因突变分析、病原微生物检测等。
总之，PCR技术作为一种快速、高效的DNA扩增技术，已经成为现代生物学和医学研究中不可或缺的工具之一。
掌握PCR技术的原理及步骤，对于开展相关实验和研究具有重要的意义。
以上就是关于PCR技术原理及步骤的介绍，希望对您有所帮助。
pcr的原理和应用领域
PCR的原理和应用领域1. PCR的原理PCR（Polymerase Chain Reaction，聚合酶链式反应）是一种在体外扩增DNA片段的技术。
它是由美国生物学家凯瑟琳·梅利斯（Kary B. Mullis）在1983年发明的，因其在分子生物学领域的重要应用而获得了1993年的诺贝尔化学奖。
PCR的原理主要包括三个步骤：变性、退火和延伸。
1.1 变性（Denaturation）将待扩增的DNA样品加热至94-98℃，使双链DNA解开成两条单链DNA。
这一步是为了使DNA分子的双链结构完全解链，以便后续的退火步骤。
1.2 退火（Annealing）将待扩增的DNA样品降温至50-65℃，加入引物（寻找特定靶序列的DNA寡核苷酸链），使引物与单链DNA序列互补配对结合。
这一步是为了使引物与待扩增的DNA序列特异性地结合，以启动PCR反应。
1.3 延伸（Extension）将待扩增的DNA样品在72℃下加入DNA聚合酶（如Taq聚合酶），使DNA引物双链结构被DNA聚合酶复制成两条新的DNA双链。
这一步是为了合成新的DNA链，使扩增物数量呈指数倍增。
经过多个循环的变性、退火和延伸步骤，可以在短时间内扩增出大量特定目标序列的DNA片段。
2. PCR的应用领域PCR技术具有高效、灵敏、特异性强等优点，因此在许多领域得到了广泛应用。
2.1 分子生物学研究PCR技术在分子生物学研究中扮演着重要角色，广泛应用于：•基因克隆和表达研究：PCR可以扩增特定基因片段，用于克隆和构建重组DNA。
可以通过PCR检测基因在不同组织和细胞类型中的表达水平，研究基因的功能和调控机制。
•突变检测和基因诊断：PCR可以检测基因突变，用于遗传病的诊断和预测。
例如，PCR可以用于检测致病基因的特定突变，如BRCA1和BRCA2基因突变与乳腺癌的关联。
•DNA指纹和个体识别：PCR可以扩增DNA中的特定序列，用于DNA指纹分析和个体识别。
PCR技术
使双链DNA解链为单链
94oC 20-30秒
(2) 退火
温度由引物长度和GC含量决定。 增加温度能减少引物与模板的非特异 性结合;降低温度可增加反应的灵敏性。
（3）延伸
70-75℃,一般为72℃ 延伸时间由扩增片段长度决定
（4）循环次数
主要取决于模版DNA的浓度
一般为25-35次 次数过多：扩增效率降低
启动子序列 定点突变 探针标记
3）操作简便易行
PCR扩增法,只需要数小时,就可以用电泳 法检出1μg基因组DNA中仅含数个拷贝的模板 序列。
通常的DNA 扩增法是分子克隆法, 首先要 构建含有目的的基因的载体, 然后将它导入 细胞后进行扩增,还要用同位索探针进行筛选; 这种方法,要经过DNA内切、连接、转化和培 养等相关的过程,操作复杂,一般需要数周时 间。
错误掺入率增加
Principle of TA Cloning
T-A克隆的原理是基于Taq DNA聚合酶具有非模板依赖性 的活性, 可将PCR双链产物的每一条链的3′端加入单A核苷 酸尾。 在70～75℃时，Taq DNA聚合酶的这种活性尤为显著, 而常规的PCR反应程序最后的步骤均为72℃延伸7～10 min, 故可满足PCR产物3′端为突出的单A核苷酸尾。 另一方面,在仅有适量的dTTP存在的情况下, Taq DNA聚 合酶也可将切成平端的质粒的3′端加入单T核苷酸尾, 故 用Taq DNA聚合酶也造成了切成平端的pBS质粒3′端产生 了突出的单T核苷酸。 PCR产物的3′末端单A核苷酸尾与切成平端的pBS质粒的 3′末端突出的单T核苷酸实现了T-A互补, 称为T-A克隆, 它 实际上是一种粘性末端连接, 因而具有较高的连接效率.
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Mg2+浓度
Mg2+是激活DNA polymerase的活性中心。 Mg2+对PCR的特异性和产量有显著的影响，在一 般的 PCR 反应中，各种 dNTP 浓度为 200umol/L 时，Mg2+浓度以1.5～2.0mmol/L为宜。 Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩 增，浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性，使 反应产物减少。
PCR反应体系的基本成分
• • • • • • •
10×PCR Buffer MgCl2或MgSO4 dNTP Mixture (dATP, dTTP, dCTP, dGTP) 引物 (随机引物或特异引物) 模板DNA Taq DNA polymerase ddH2O
PCR引物设计的基本原则
合理的设计可在扩增的特异性和有效性之间找到一个平衡点。 1 引物长度通常18～30bp； 2 解链温度(Tm); Tm=4(G+C)+2(A+T) 3 GC含量以40%～60%为宜，GC太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非 特异条带；
PCR反应的基本过程
PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成： ①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模 板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以 便它与引物结合，为下轮反应作准备； ②模板DNA与引物的退火（复性）：模板DNA经加热变性成单链后， 温③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在72℃、DNA聚合酶（如 TaqDNA聚合酶）的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板， 按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互 补的半保留复制链，重复循环变性--退火--延伸三过程就可获得更 多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。 每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增 放大几百万倍。
PCR技术与肿瘤
PCR技术检测肿瘤就是通过对原癌基因和抑癌 基因的检测来诊断机体是否有肿瘤滋生 · 通过对原癌基因表达时的mRNA进行逆转录PCR 分析 · 或者对原癌基因的PCR产物进行是否有缺失的 分析 · 这样便能判断机体是否有肿瘤并且能在前期检 测出来，让患者及时得到治疗
Thanks
聚合酶链式反应 （Polymerase Chain Reaction，PCR）
——生化实验第四小组
目录
PCR的定义 PCR反应的基本过程 PCR反应程序的优化
PCR的优点
PCR的应用 PCR的临床应用
PCR技术
PCR技术即聚合酶链式反应技术，是1986年 由Kallis Mullis发现的。
通过模拟体内DNA复制的方式，在体外选择
PCR反应程序优化的基本原则
③延伸温度与时间 PCR反应的延伸温度常用72℃。PCR延伸反应的时间，可根据待扩增片段的 长度而定： 1 kb的靶序列 延伸时间1min； 3～4kb的靶序列 延伸时间3～4min； 10kb以上的靶序列 延伸时间15min。 2 循环次数 PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度。一般的循环次数选在25～40次 之间，循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多。
①加样
⑤结果分析
PCR流程
②扩增
④观测 ③电泳
PCR的优点
1 特异性强 PCR反应的特异性决定因素为： ①引物与模板DNA特异正确的结合； ②碱基配对原则； ③Taq DNA聚合酶合成反应的忠实性； ④靶基因的特异性与保守性。 2 灵敏度高 能将pg级的起始待测模板扩增到 ug水平。能从100万个细胞中检出一个靶细 胞；在病毒的检测中，PCR的灵敏度可达3个RFU(空斑形成单位)；在细菌学 中最小检出率为3个细菌。 3 简便、快速 PCR反应用耐高温的Taq DNA聚合酶，一次性地将反应液加好后，即在PCR 仪上进行扩增反应，一般在2～4小时完成。扩增产物一般用电泳分析，不一 定要用同位素，无放射性污染、易推广。 4 对样本DNA的纯度要求低 不需要分离病毒或细菌及培养细胞，DNA 粗制品均可作为扩增模板。可直接 用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等粗制的DNA样 品进行PCR检测。
PCR反应程序优化的基本原则
1 温度与时间的设置 在标准反应中采用三温度点法，双链DNA在90～95℃变性，再迅速冷却至 40～60℃，引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至70～75℃，在Taq DNA聚合酶的作用下，引物链沿模板延伸。 较短靶序列(长度为100～300bp时)可采用二温度点法，除变性温度外，退火 与延伸温度可合二为一，一般采用94℃变性，65℃左右退火与延伸。 ①变性温度与时间 变性温度低，解链不完全是导致PCR失败的最主要原因。一般情况下，93℃ ～94℃ l min足以使模板DNA变性，但温度过高对酶的活性有影响。此步若 不能使模板DNA完全变性，就会导致PCR失败。 ②退火温度与时间 退火温度是影响PCR特异性的较重要因素。退火温度与时间，取决于引物的 长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度： Tm值(解链温度)=4(G+C)＋2(A+T) 复性温度=Tm值-(5～10℃)
PCR技术的应用
PCR技术从原理便知该技术与基因有关，因此， 它可以运用于基因分离克隆和核酸序列分析， 还可用于突变体和重组体的构建，基因表达 调控的研究，基因多态性分析，遗传病和传 染病诊断，肿瘤机制探查，法医鉴定等方面
示例
基因克隆
PCR技术的临床应用
· PCR技术因与基因相关，因此，在临床上的 应用也是和基因有关的疾病检测 例如：对遗传病相关基因的检测
性地将DNA某个特殊区域扩增出来的技术。
广泛用于分子生物学和基因工程及其它与 DNA鉴定相关的领域，如疾病检测、临床应 用、商品检疫、法医鉴定、新药品的开发等 。
PCR技术产生的历史背景
1971年，KHORANA等人就提出了利用PCR在体外扩 增DNA的概念； SAIKI（1985）和MULLIS（1986）两家研究室分 别用改进的KLEPPE法获得了大量染色体DNA单拷 贝基因； 1988年，CHIEN从水生栖热菌（THERMUS AQUATICUS）中分离出耐热DNA聚合酶，简称TAQ DNA聚合酶； MULLIS正式确定了体外扩增DNA技术，1987年获 得专利，命名为POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR)。
4 ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列； 5 避免引物内部出现二级结构，以及避免两条引物间互补，特别是3’端的互补，否 则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带； 6 引物3’端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末 端碱基不配对而导致PCR失败；
· 如果碱基突变的位置与某种限制性内切酶的识别位点相关， 图便会产生新的或消除原有的内切酶位点，那么用特定的限 制性内切酶消化PCR产物，通过电泳技术与正常人对比就能 得治是否有突变，借此诊断遗传病
· 如：苯丙酮尿症，镰刀型贫血症，血友病等遗传病
PCR技术与病原微生物的检测 根据病毒或其他病原体的已知保守核苷酸序列 设计出引物，对待测核酸的特异性片段进行扩 增，之后对扩增产物进行电泳分析，通过是否 能扩增出特异性条带来判断样品中是否有病原 DNA 类似刚刚的遗传病诊断 由于PCR技术具有敏感、专一等特点,不仅可以 对病原微生物进行特异性识别,而且可以鉴别 同一种类病原微生物的致病性菌株和非致病性 菌株,因此应用PCR技术进行病原微生物的检测 具有十分独特的优势。
7 引物中有或能加上合适的酶切位点，被扩增的靶序列最好有适宜的酶切 位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处； 8 引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。
dNTPs
• dNTP的质量、浓度与PCR扩增效率有密切关系， • dNTP溶液的pH为7.0～7.5，小量分装，-20℃冰 冻保存。反复冻融会使dNTP降解。 • 在 PCR 反应中， dNTP 应为 50 ～ 200umol/L，尤 其是注意4种dNTP的摩尔浓度要相等，如果其中 任何一种浓度不同，就会引起错配。 • dNTP能与Mg2+结合,使游离的Mg2+浓度降低