PCR技术教程.ppt

Ct值的含义：每个反应管内的荧光信号到达设定的 阈值时所经历的循环数。
特别说明：
1、荧光探针和荧光染料：
分别用探针或荧光染料与特异序列结合来指示扩增产物，前者特异性高， 后者操作简单。
TaqMan探针：寡核苷酸探针，荧光基团连接在5’端，淬灭基因连在3’
端。5’端荧光基团吸收能量后转移给临近的3’端淬灭基团，发生共振能 量转移（FRET），只要探针完整，能量就会被淬灭。
PCR类型：
普通PCR RT-PCR TAIL-PCR Real-time PCR 数字PCR
普通PCR仪 梯度PCR仪
原位PCR仪
定量PCR（Real-time quantification PCR）
1、历史
实时荧光定量PCR技术于1996年由美国Applied Biosystems公 司推出，该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且与常 规PCR相比，它的特异性更强、更能有效解决PCR污染问题、自动 化程度更高等特点。
95℃ 56℃
72℃
12℃
预变性 1 min 变性 1 min 目的：DNA双链成单链 退火 目的：引物先与模板匹配 延伸 1-2 min 目的：聚合酶在引物3’端加 核苷酸，合成新链 保存
特异性强、灵敏度高、快速、简便
循环次数 1 2 3 20 30
DNA数量 2 4 8
1048576 1073741824
实，采用大肠杆菌DNA聚合酶Klenow片断（37℃）， 并获1993年诺贝尔化学奖。 • 1988年 R.K. Saiki 应用Taq DNA聚合酶（水生栖热菌） 于PCR反应；同年，Cetus公司发明自动热循环仪。
K.B.Mullis
2、原理
预变性－变性－退火－延伸－保存
循环（30次）
95℃
循 环
荧光阈值：在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它 可以设定在荧光信号指数扩增阶段的任意位置上。
默认阈值＝基线（背景）荧光信号的标准偏差的10倍。
Ct值的含义：每个反应管内的荧光信号到达设定的阈 值时所经历的循环数。
［DNA］0：样本起始DNA浓度。
理论上PCR是一个指数增长的过程，但实际的PCR 扩增曲线并标准的指数曲线，而是S形曲线。这是因为 随着PCR循环的增多，扩增规模迅速增大，Taq酶、 dNTP、引物，甚至DNA模板等各种PCR因素逐渐不满足 要求，PCR效率越来越低，产物增长的速度逐渐减缓。
不适合染料法
卤素灯（白光）
定量
线性图与对数图正好相反，基线期在对数图中增高。
基线
荧光阈值
Ct值
［DNA］0
基线：扩增线中的水平部分，由环境的噪音产生。
实验结束软件自动分析数据，基线取默认值3-15 （循环数）。
如果最小的Ct值>18，保持默认； 如果最小的Ct值<18，基线终点改成［最小的Ct值减 3］，重新分析。
一对引物
引物之间一条
寡核苷酸，即 探针
报告基因与 淬灭基团
FRET
完整探针，不发光；水解后，发光。
变性（95℃） 退火（60℃）
DNA聚合酶
5’→3’外切酶活性；可将探针5’ 端的荧光基团切割下来。
荧光基团游离下 来后发光了！
因为探针是完全与目的基因互补，当它被水解后 就发光，因此发光的强度与目标基因量成正比。
4、引物：互补；引物长度；3’碱基序列必须与模板配对；尽量提高 GC含量；避免连续相同碱基排列或开成回纹结构；避免形成引 物二聚体。
5、Tm=(G+C)×4+(A+C) ×2 6、primer 5.0 7、模板纯度：不一定要纯，但要确定不含蛋白变性剂、DNA酶、
Mg2+螯合剂等。模板量（100ng/100μl） 8、dNTP浓度 2.5 mM each
只与双链结合，发光；不与单链结合，不发光。
染料法做，探针法不做
随温度升高，DNA双螺旋结构降解程度的曲线即熔解曲线， 可用对数图和线性图表示。在扩增产物的溶解温度上有一特征峰 （Tm，DNA双链解链50％的温度），用这个特征峰就可以将特 异产物与其它产物如引物二聚体区分开，因为它们在不同的温度 溶解。
聚合酶链式反应（PCR） 原理与相关技术
一、PCR技术 二、定量PCR技术 三、数字PCR技术
一、PCR原理
Polymerase Chain Reaction(PCR)：在 体外特异性地扩增某个基因。
1、历史
• 1971年，Khorana提出体外人工复制DNA的设想。 • 1985年 Cetus公司科学家K.B.Mullis使设想变成现
SYBR GREEN 1：结合双链DNA小沟后，荧光强度增强，但也会结合引物
二聚体或单链引起的二级结构。变性时，双链分开，荧光消失。
荧光定量PCR的优点
1. 荧光信号的强弱可实时反映DNA的扩增； 2. 灵敏度极高，用于准确定量初始模板数量； 3. 既能用于定性，判断一段DNA序列的有无，也可
用于定量，确定起始DNA拷贝数。
绝对
处理与对照
定量PCR仪特点
，污染机会少
定量PCR的实验因素
DNA纯度：OD260/OD280=1.8, 1.6-2.0之间 DNA用量：0.05-100ng RNA纯度：OD260/OD280=2.0 cDNA用量：1-100ng总RNA反转录的cDNA取1μl
样品和标准品都需要重复，重复次数遵循统计学要求。
定量PCR实验要素：
目标基因： 未知样品 生成标准： 曲线标准品梯度 监控系统： 阳性对照 监控污染： 阴性对照 校准生物学误差：管家基因 校准物理误差：参比荧光（ROX） 降低其它误差：重复实验
特殊说明：
1、Taq酶：具有5’→3’聚合酶和外切酶活性，无3’→5’外切酶活性，不 能修复错误的碱基配对，因此必须测序。需激活剂：Mg2+
2、pfu DNA 聚合酶：有5’→3’和3’→5外切酶活性，出错率最低，但 PCR产物平端。
3、Taq Plus DNA 聚合酶：是Taq和pfu的混合物，Taq PCR产物3’端带－ A。
原理：在PCR反应体系中加入非特异性的荧光染料（如 SYBR GREEN 1）或特异性的荧光探针（如Taqman探 针），利用荧光信号累积实时检测整个PCR过程，再 通过标准曲线或内参基因对未知基因进行定量分析 的方法。
也就是通过荧光的变化，获得不同样品达到一定荧 光信号（阈值）所需要的循环次数Ct（Cycle Threshold）。