PCR技术原理模板
PCR技术基本原理及相关知识资料讲解
P C R技术基本原理及相关知识PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。
PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA 经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。
每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。
到达平台期(Plateau)所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。
PCR的反应动力学 PCR的三个反应步骤反复进行，使DNA扩增量呈指数上升。
反应最终的DNA 扩增量可用Y＝(1＋X)n计算。
Y代表DNA片段扩增后的拷贝数，X表示平(Y)均每次的扩增效率，n代表循环次数。
平均扩增效率的理论值为100%，但在实际反应中平均效率达不到理论值。
反应初期，靶序列DNA片段的增加呈指数形式，随着PCR产物的逐渐积累，被扩增的DNA片段不再呈指数增加，而进入线性增长期或静止期，即出现“停滞效应”，这种效应称平台期数、PCR扩增效率及DNA聚合酶PCR的种类和活性及非特异性产物的竟争等因素。
大多数情况下，平台期的到来是不可避免的。
PCR反应体系的基本成分：模板DNA、特异性引物、DNA聚合酶、dNTP、 Mg2+的缓冲液。
PCR反应体系与反应条件--------------------------------------------------------------------------------标准的PCR反应体系：10×扩增缓冲液 10ul4种dNTP混合物各200umol/L引物各10～100pmol模板DNA 0.1～2ugTaq DNA聚合酶 2.5uMg2+ 1.5mmol/L加双或三蒸水至100ulPCR反应五要素：参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+引物：引物是PCR特异性反应的关键，PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。
PCR技术应用的原理
PCR技术应用的原理一、背景介绍PCR（聚合酶链反应）是一种广泛应用于生物医学和生物科学研究中的分子生物学技术。
它可以在简单的实验室条件下，通过扩增DNA片段，大大提高了DNA分析的效率和准确性。
PCR技术的应用领域非常广泛，涵盖了基因检测、遗传学研究、疾病诊断等多个方面。
二、PCR技术原理PCR技术的原理是在体外复制DNA片段，通过多次的循环反应扩增目标DNA，使其数量呈指数级增加。
1. 反应组分PCR反应的核心组分包括模板DNA、引物、dNTPs、聚合酶和缓冲液。
其中，模板DNA是待扩增的DNA片段，引物是用于特异性选择目标序列的短小DNA片段。
dNTPs 是构建新DNA链所需的四种碱基单元，聚合酶则起到合成新DNA链的作用。
缓冲液用于提供适宜的酶活性和反应环境。
2. 反应步骤PCR反应一般包括三个主要步骤：变性、退火和延伸。
首先，将PCR反应管中的反应体系升至95摄氏度，以使DNA中的双链变性成为单链。
然后，将反应管温度降低至适宜的温度，使引物与目标DNA序列互补结合，形成引物-模板DNA复合物。
最后，将温度升高至聚合酶适宜的温度，使聚合酶在引物的引导下，在模板DNA上合成新的DNA链。
这个过程将重复多次，每一次循环都会产生两条DNA链。
3. 反应循环PCR反应的最关键特点是可重复的循环反应。
每个循环可以将DNA数量扩增一倍，经过若干个循环后，扩增的DNA数量将呈现几何级数增长。
通常，PCR反应的循环次数在20-40次之间。
三、PCR技术的应用PCR技术在许多领域中应用广泛，下面列举几个典型应用案例：1. 基因检测PCR技术可用于快速检测DNA中是否存在特定的基因序列。
通过PCR扩增目标基因序列后，可以使用各种检测方法（如凝胶电泳）来确认特定基因的存在与否。
这种快速、高效的基因检测方法被广泛应用于医学、法医学等领域。
2. 疾病诊断PCR技术可以用于疾病的早期诊断。
通过扩增与特定疾病相关的基因，可以快速、敏感地检测出患者体内是否存在疾病相关的基因序列。
PCR检测技术(一) 模板
3.DNA聚合酶
目前PCR扩增中最常用的DNA聚合酶是TagDNA聚合酶，它是由水生栖热菌(Ther-masaquaticus)产生，热稳定性好，可耐94℃高温，在此温度下短时光内对活力无多大影响。最适反应温度为72℃,70℃催化核酸链延伸的速度是2800核苷酸/min，在100uL反应体系中普通用2单位，它的用量多少对PCR扩增效率及特异性有一定影响。除了TagDNA聚合酶外，近年来耐热的pfuDNA聚合酶也被广泛地用于PCR反应，此酶是山极端嗜热的激烈热球菌(Pyrococcusfuriosus)产生的DNA聚合酶，是迄今发觉的掺人错误率最低的耐热DNA聚合酶，但其延长速度比TagDNA聚合酶低550核苷酸/min；另外得到应用的还有一种rTthDNA聚合酶，因为PCR反应以DNA模板举行扩增反应，而rTthDNA聚合酶可将反转录和聚合作用融合在一起，挺直由其将RICA反转录后扩增出大量的DNA片段，因而可大大简化操作程序，提高效率。
TagDNA聚合酶往往会在DNA链3'末端加上非模板互补核苷酸，从而产生不易克隆的PCR产物。通过用其他DNA聚合酶(如T4DNA聚合酶)处理扩增产物，补平或除去突出末端可解决这一问题。
4．反应缓冲液
PCR反应中常用的反应缓冲液含10～50mmol/L(pH8.3～8.8)的Tris-HCl,50mmol/LKCl和1.5mmol/LMgCl2。反应缓冲液的pH至关重要，假如KCl浓度过高，则会抑制酶的活性。在反应中存在适当浓度的Mg2+至关重要，它是TagDNA聚合酶活力所必须的，并可影响PCR产物的特异性和产量、引物退火的程度、模板与PCR产物链的解离温度、引物的特异性、引物二聚体的形成以及酶的活性和精确性等。因为EDTA或磷酸根能影响Mg2+的浓度，所以应注重模板DNA溶液中的EDTA浓度和PCR反应中所加模板和引物的量以及dNTP浓度(dNTP可提供磷酸基团，从而影响Mg2+浓度)。要获得最佳反应结果，必需挑选合适的Mg2+浓度，普通为2～5mmol/L。
PCR技术的原理与方法
PCR技术的原理与方法
PCR定义
PCR（Polymerase Chain Reaction）即聚合酶链式反应，是指在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程。
是一项DNA体外合成放大技术，能快速特异地在体外扩增任何目的DNA。
可用于基因分离克隆，序列分析，基因表达调控，基因多态性研究等许多方面。
PCR技术的基本原理
一、PCR反应成分：
1、模板DNA；
2、引物；
3、四种脱氧核糖核苷酸；
4、DNA聚合酶；
5、反应缓冲液、Mg2+等。
二、PCR反应基本步骤：
1、变性(denaturation)：通过加热使模板DNA的双链之间的氢键断裂，双链分开而成单链的过程，高温使双链DNA解离形成单链（94℃，30s）。
2、退火(annealling)：当温度降低时，引物与模板DNA中互补区域结合成杂交分子，低温下，引物与模板DNA互补区结合（55℃，30s）。
3、延伸(extension)：在DNA聚合酶、dNTPs、 Mg2+存在下，DNA聚合酶催化引物按5’→3’方向延伸，合成出与模板DNA 链互补的DNA子链，中温延伸，DNA聚合酶催化以引物为起始点的DNA链延伸反应（70～72℃，30～60s）
以上述三个步骤为一个循环，每一循环的产物均可作为下一个循环的模板，经过n次循环后，目的DNA以2n的形式增加。
简述pcr技术原理
简述pcr技术原理
PCR技术原理
PCR（聚合酶链式反应）是一种在体外扩增DNA片段的技术，它是分子生物学中最重要的技术之一。
PCR技术的原理是利用DNA聚合酶在适当的温度下，将DNA模板的两条链分离，然后在模板DNA的两端引导的引物的作用下，通过DNA聚合酶的催化作用，将引物与模板DNA的单链互补配对，从而在每个引物的5'端开始合成新的DNA链，最终得到两条与模板DNA相同的DNA片段。
PCR技术的步骤包括三个主要的温度阶段：变性、退火和延伸。
在变性阶段，PCR反应体系中的DNA双链被加热至95℃，使其分离成两条单链。
在退火阶段，反应体系中的温度被降低至50-60℃，引物与模板DNA的单链互补配对，形成引物-模板DNA复合物。
在延伸阶段，反应体系中的温度被升高至72℃，DNA聚合酶在引物的作用下，从引物的5'端开始合成新的DNA链，最终得到两条与模板DNA相同的DNA片段。
PCR技术的应用非常广泛，包括基因克隆、基因检测、DNA测序、DNA指纹鉴定等。
PCR技术的优点是快速、灵敏、特异性高、操作简单、成本低等。
PCR技术的发明和应用，极大地促进了分子生物学和生物技术的发展，为人类健康和生命科学研究提供了强有力的工具。
pcr的原理及应用
pcr的原理及应用
PCR(聚合酶链反应)是一种常用的基因扩增技术，其原理是通过复制DNA模板来扩增目标DNA片段的数量。
该技术主要包括三个步骤：变性、退火和延伸。
在PCR反应开始时，通过将反应体系加热至95℃左右，DNA 双链分子会解旋成两条单链DNA。
然后，将反应温度降低至50-65℃，进入退火阶段。
在此温度下，引物(一对常规是20-30碱基的DNA片段)会与模板DNA的互补序列结合，形成DNA-RNA杂交体。
最后，将反应体系温度升高至72℃，此时酶Taq聚合酶能够在DNA模板上从引物的3'端向5'端逆向延伸，合成一条与模板DNA互补的新的DNA链。
PCR技术有广泛的应用。
首先，PCR常用于基因测序，可以扩增目标DNA片段，使其达到测序所需的足够数量。
此外，PCR也可用于检测基因突变、揭示疾病相关的遗传变异以及进行谱系分析。
另外，PCR还可用于鉴定DNA样本的来源，如在法庭上用作法医学证据。
此外，PCR也被广泛应用于生物学研究、医学诊断和农业领域等。
值得注意的是，在进行PCR实验时，需要严格控制反应条件和杂交引物的设计，以确保扩增的目标片段具有高度的专一性和准确性。
pcr技术基本原理
pcr技术基本原理
PCR技术是聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction）的简称，是一种常用于扩增DNA片段的分子生物学技术。
其基本
原理是以DNA作为模板，通过酶促反应在体外体内特定条件下，利用DNA聚合酶等酶的作用，在特定的温度下进行
DNA的连续扩增。
PCR反应通常包括三个主要步骤：变性、退火和扩增。
第一步是变性。
将含有待扩增DNA的反应混合液加热至94-96℃，使其中的DNA双链解开，形成两股单链DNA。
这一
步是为了使DNA解开，以使其能够作为酶的模板。
第二步是退火。
将温度降至50-65℃，在这个温度下引入特异
性的引物（引物是一段DNA或RNA序列，与待扩增DNA片
段的两个端部序列互补），引物能够在特定的一对DNA链上
结合形成稳定的DNA-DNA双链。
第三步是扩增。
将温度升高至72℃，此时加入DNA聚合酶。
DNA聚合酶从引物处开始合成新的DNA链，将双链DNA复
制成两份完全一致的DNA分子。
这样，通过多次循环变性、
退火和扩增，可以在短时间内获得大量特定序列的DNA片段。
PCR技术具有高效、快速、灵敏和特异性的特点，它在分子
生物学和遗传学研究中广泛应用。
例如，可以用PCR技术快
速检测病原体、基因突变、身份鉴定和基因测序等。
通过改变
引物的序列，可以扩增不同长度和不同序列的DNA片段，从而满足不同的实验需求。
PCR技术原理模板
PCR 技术原理PCR 产物的电泳检测时间一般为48h 之内，有些最好于当天电泳检测，大于48h 后带型不规则甚致消逝。
一.假阴性，不出现扩增条带PCR 反响的重点环节有①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量及活性④PCR 循环条件。
找寻原由亦应针对上述环节进行剖析研究。
模板：①模板中含有杂蛋白质，②模板中含有Taq 酶克制剂，③模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白，④在提取制备模板时丢掉过多，或吸入酚。
⑤模板核酸变性不完全。
在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化办理，模板核酸提取过程出了缺点，因此要配制有效而稳固的消化办理液，其程序亦应固定不宜任意改正。
酶失活：需改换新酶，或新旧两种酶同时使用，以剖析能否因酶的活性丧失或不够而致使假阴性。
需注意的是有时忘加Taq 酶或溴乙锭。
引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度能否对称，是 PCR 失败或扩增条带不理想、简单弥散的常有原由。
有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：①选定一个好的引物合成单位。
②引物的浓度不单要看 OD 值，更要着重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，必定要有引物条带出现，并且两引物带的亮度应大概一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR 有可能失败，应和引物合成单位磋商解决。
如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要均衡其浓度。
③引物应高浓度小量分装保留，防备多次冻融或长久放冰箱冷藏部分，致使引物变质降解无效。
④引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成二聚体等。
Mg2+ 浓度： Mg2+ 离子浓度对PCR 扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR 扩增的特异性，浓度过低则影响PCR 扩增产量甚至使 PCR 扩增失败而不出扩增条带。
反响体积的改变：往常进行PCR 扩增采纳的体积为20ul、30ul、50ul。
或 100ul，应用多大概积进行PCR 扩增，是依据科研和临床检测不一样目的而设定，在做小体积如20ul 后，再做大体积时，必定要模索条件，不然简单失败。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
PCR技术原理
PCR产物的电泳检测时间一般为48h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h后带型不规则甚致消失。
一.假阴性，不出现扩增条带
PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量及活性④PCR循环条件。
寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。
模板：①模板中含有杂蛋白质，②模板中含有Taq酶抑制剂，③模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白，④在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。
⑤模板核酸变性不彻底。
在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应固定不宜随意更改。
酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致假阴性。
需注意的是有时忘加Taq 酶或溴乙锭。
引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。
有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：①选定一个好的引物合成单位。
②引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做琼脂糖
凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。
如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。
③引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效。
④引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成二聚体等。
Mg2+浓度：Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR扩增的特异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。
反应体积的改变：通常进行PCR扩增采用的体积为20ul、30ul、50ul。
或100ul，应用多大体积进行PCR扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如20ul后，再做大体积时，一定要模索条件，否则容易失败。
物理原因：变性对PCR扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，极有可能出现假阴性;退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。
有时还有必要用标准的温度计，检测一下扩增仪或水溶锅内的变性、退火和延伸温度，这也是PCR 失败的原因之一。
靶序列变异：如靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列，其
PCR扩增是不会成功的。
二.假阳性，出现非特异性扩增带
1.假阳性
出现的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致，有时其条带更整齐，亮度更高。
引物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行PCR扩增时，扩增出的PCR产物为非目的性的序列。
靶序列太短或引物太短，容易出现假阳性。
需重新设计引物。
靶序列或扩增产物的交叉污染：这种污染有两种原因：一是整个基因组或大片段的交叉污染，导致假阳性。
这种假阳性可用以下方法解决：①操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。
②除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。
所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。
③必要时，在加标本前，反应管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。
二是空气中的小片段核酸污染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。
可互相拼接，与引物互补后，可扩增出PCR产物，而导致假阳性的产生，可用巢式PCR方法来减轻或消除。
2.出现非特异性扩增带
PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或
者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。
非特异性条带的出现，其原因：一是引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体。
二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数过多有关。
其次是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。
其对策有：①必要时重新设计引物。
②减低酶量或调换另一来源的酶。
③降低引物量，适当增加模板量，减少循环次数。
④适当提高退火温度或采用二温度点法(93℃变性，65℃左右退火与延伸)。
3.出现片状拖带或涂抹带
PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。
其原因往往由于酶量过多或酶的质量差，dNTP浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。
其对策有：①减少酶量，或调换另一来源的酶。
②减少dNTP的浓度。
③适当降低Mg2+浓度。
④增加模板量，减少循环次数。
三.PCR污染与对策
PCR反应的最大特点是具有较大扩增能力与极高的灵敏性，但令人头痛的问题是易污染，极其微量的污染即可造成假阳性的产生。
污染原因
(一)标本间交叉污染:标本污染主要有收集标本的容器被污染，
或标本放置时，由于密封不严溢于容器外，或容器外粘有标本而造成相互间交叉污染;标本核酸模板在提取过程中，由于吸样枪污染导致标本间污染;有些微生物标本尤其是病毒可随气溶胶或形成气溶胶而扩散，导致彼此间的污染。
(二)PCR试剂的污染:主要是由于在PCR试剂配制过程中，由于加样枪、容器、双蒸水及其它溶液被PCR核酸模板污染. (三)PCR扩增产物污染:这是PCR反应中最主要最常见的污染问题，因为PCR产物拷贝量大(一般为1013拷贝/ml)，远远高于PCR检测数个拷贝的极限，所以极微量的PCR产物污染，就可造成假阳就可形成假阳性。
还有一种容易忽视，最可能造成PCR产物污染的形式是气溶胶污染;在空气与液体面摩擦时就可形成气溶胶，在操作时比较剧烈地摇动反应管，开盖时、吸样时及污染进样枪的反复吸样都可形成气溶胶而污染.据计算一个气溶胶颗粒可含48000拷贝，因而由其造成的污染是一个值得特别重视的问题.
(四)实验室中克隆质粒的污染:在分子生物学实验室及某些用克隆质粒做阳性对照的检验室，这个问题也比较常见。
因为克隆质粒在单位容积内含量相当高，另外在纯化过程中需用较多的用具及试剂，而且在活细胞内的质粒，由于活细胞的生长繁殖的简便性及具有很强的生命力，其污染可能性也很大。
污染的监测一个好的实验室，要时刻注意污染的监测，考虑有无污染是什么原因造成的污染，以便采取措施，防止和消除污染。
四.对照试验
1.阳性对照:在建立PCR反应实验室及一般的检验单位都应设有PCR阳性对照，它是PCR反应是否成功、产物条带位置及大小是否合乎理论要求的一个重要的参考标志。
阳性对照要选择扩增度中等、重复性好，经各种鉴定是该产物的标本，如以重组质粒为阳性对照，其含量宜低不宜高(100个拷贝以下)，但阳性对照尤其是重组质粒及高浓度阳性标本，其对检测或扩增样品污染的可能性很大。
因而当某一PCR试剂经自己使用稳定，检验人员心中有数时，在以后的实验中可免设阳性对照。
2.阴性对照:每次PCR实验务必做阴性对照。
它包括①标本对照:被检的标本是血清就用鉴定后的正常血清作对照;被检的标本是组织细胞就用相应的组织细胞作对照。
②试剂对照:在PCR试剂中不加模板DNA或RNA，进行PCR扩增，以监测试剂是否污染。
3.重复性试验
4.选择不同区域的引物进行PCR扩增
五.防止污染的方法
(一)合理分隔实验室:将样品的处理、配制PCR反应液、PCR循环扩增及PCR产物的鉴定等步骤分区或分室进行，特别注意样本处理及PCR产物的鉴定应与其它步骤严格分开。
最好能划分①标本处理区;②PCR反应液制备区;③PCR循环扩增区;④PCR产物鉴定区。
其实验用品及吸样枪应专用，实验前应将实验室用紫外线消毒以破坏残留的DNA或RNA。
(二)吸样枪:吸样枪污染是一个值得注意的问题。
由于操作时不慎将样品或模板核酸吸入枪内或粘上枪头是一个严重的污染源，因而加样或吸取模板核酸时要十分小心，吸样要慢，吸样时尽量一次性完成，忌多次抽吸，以免交叉污染或产生气溶胶污染。
(三)预混和分装PCR试剂:所有的PCR试剂都应小量分装，如有可能，PCR反应液应预先配制好，然后小量分装，-20℃保存。
以减少重复加样次数，避免污染机会。
另外，PCR试剂，PCR 反应液应与样品及PCR产物分开保存，不应放于同一冰盒或同一冰箱。
(四)防止操作人员污染，使用一次性手套、吸头、小离心管应一次性使用。
(五)设立适当的阳性对照和阴性对照，阳性对照以能出现扩增条带的最低量的标准病原体核酸为宜，并注意交叉污染的可能性，每次反应都应有一管不加模板的试剂对照及相应不含有被扩增核酸的样品作阴性对照。
(六)减少PCR循环次数，只要PCR产物达到检测水平就适可而止。
(七)选择质量好的Eppendorf管，以避免样本外溢及外来核酸的进入，打开离心管前应先离心，将管壁及管盖上的液体甩至管底部。
开管动作要轻，以防管内液体溅出。