细胞培养的污染及控制
防止动物细胞培养过程中污染的实验室技术
防止动物细胞培养过程中污染的实验室技术动物细胞培养是生物学研究中重要的手段之一，其应用广泛，涉及基础研究、医药生产等多个领域。
在动物细胞培养的过程中，污染是不可避免的问题，因此保持培养物的纯度至关重要。
本文介绍一些防止污染的实验室技术。
保持实验室的清洁实验室的清洁是防止污染的第一步。
实验室的设备和工具、培养物的储存和传递都需要保持干净。
髓液、血浆等可能带有微生物的实验材料应该妥善处理，使用一次性消毒的物品避免二次污染。
实验室中应该保持良好的通风和空调，实验台面应经常消毒。
培养器具的消毒与无菌操作培养器具是培养细胞的载体，在使用前需要消毒。
培养器具的消毒方式包括自然气化法、物理消毒法和化学消毒法等多种方法。
推荐使用化学消毒方法，能够有效地杀灭微生物，并且不影响细胞生长。
使用无菌技术避免由人员操作不当导致的污染。
控制细胞培养环境细胞培养环境是影响细胞生长的关键因素，其包括温度、湿度、氧气浓度等多个方面。
恰当地控制细胞培养环境能够减少细胞的死亡率和异质性，同时能够有效地预防污染的发生。
建议使用具有恒温、恒湿和恒气的培养箱或培养室，并定期对培养箱进行消毒处理。
培养物的储存与传递在动物细胞培养实验中，培养物的储存与传递也是防止污染的重要环节之一。
存储培养物时，应该避免不同种类的细胞相互接触，同时勿与其它实验室材料混合。
在传递培养物时，要保持无菌技术和细胞存活率的同时，减少培养物瓶口周围的污染。
结语动物细胞培养是生物学研究中不可缺少的技术之一，同时也是保持实验室操作的纯洁度非常关键的一步。
通过建立完善的实验室操作规范，采用正确的培养方法和技术手段，我们经过艰辛的努力能够有效地向污染说“不”，保证细胞培养的成功和有效性。
细胞常见污染情况分析报告
细胞培养常见污染的判别及应对措施2011-01-02 10:19:04| 分类：实验| 标签：污染无菌细胞培养基灭菌|字号大中小订阅一、避免细胞培养污染的措施：污染是细胞培养中一个大敌，一旦污染，前功尽弃！决定要进行细胞培养，首先一定要有强烈的无菌意识！操作中要遵守严格的操作规程，不要怕麻烦，越细心越好！注意以下几点，大部份的污染是可以避免的：1. 每次开始实验前，先用紫外照无菌台和实验室20分，用酒精擦手，台面和不消毒的器械（如移液枪等）；实验中，如允许，尽量多过火，开起或盖盖都靠近火焰或在无菌台深处；使用无菌台后，再用酒精擦台面，紫外照20分！2. 滴管不要接触瓶口，吸取废液及加入新鲜培养基时都要注意不要滴在瓶口上等等。
3. 凡是接触瓶口后都要用酒精灯烧烧。
4. 提取组织时，往往头会距离组织很近，所以带口罩很重要！还要换无菌衣（紫外照过的白大褂）。
5. 注意配制完全培养基时不要发生污染，在使用前一定要做无菌培养，因为一般应用污染后的培养基培养细胞后，很快就会发生特别严重的污染。
6. 操作时一定按照实验室的要求，切忌粗心大意。
7. 使用完的东西尽快移出无菌台！另外无菌台上的器械，试剂摆放，也尽量遵循一定的顺序！依污染可能程度依次向外摆。
二、常见的细胞培养污染：下面是几种细胞培养过程中常见的污染：1. 支原体污染：传说中的黑焦虫，长得暴快。
24小时就满视野都是了。
污染源大多数情况下是培养用血清。
图1 支原体污染的光镜检测（圆圈所示，×10倍）图2 支原体污染的光镜检测（×20倍）图3 支原体污染的荧光检测图4 支原体污染的电镜检测（×30k，煎蛋状和其他形状）图5 支原体污染的电镜检测2. 念珠菌污染：似乎无处不在，而且顽固得很。
长得暴快（12h就能在细胞上面密布）。
培养液澄清。
低倍显微镜下像黑色的沙子铺在细胞上，高倍镜下呈树枝状或葡萄状。
图6 念珠菌污染的光镜检测（低倍镜）图7 念珠菌污染的光镜检测（高倍镜）图8 念珠菌污染的光镜检测（高倍镜）图9 念珠菌污染的检测（革兰氏染色阳性）这么大面积的污染，你可以看看是不是操作上出了问题，要不然就是培养基的问题。
细胞培养中的污染问题与对策
细胞培养中的污染问题与对策细胞培养是一种常见的实验室技术，用于研究细胞的生长、分化和功能。
然而，在进行细胞培养的过程中，污染是一个不可忽视的问题。
污染源可以来自外部环境、工作环境或实验操作不当。
对于细胞培养的研究结果的准确性和有效性而言，解决污染问题的对策至关重要。
首先，污染问题可能来自实验室环境以及操作者自身。
实验室环境中存在的微生物污染可能会导致细胞培养的受损。
因此，保持实验室环境的清洁是非常重要的。
定期进行实验室卫生和表面消毒是降低微生物污染的有效措施。
此外，操作者在进行细胞培养时需要严格遵守无菌操作规程，以减少自身的污染对细胞的影响。
操作者需要穿戴合适的实验室清洁工作服、手套和口罩，并在操作过程中注意避免直接接触细胞培养物。
其次，细胞培养中使用的培养基和试剂也是潜在的污染源。
为了避免污染，选择高纯度的培养基和试剂是至关重要的。
购买来自可靠供应商的培养基和试剂，严格遵循使用说明书的指导，可以减少产品本身的污染。
此外，在实验进行过程中，避免将培养基和试剂暴露在不洁的环境中，并妥善保存这些试剂，以防止其受到污染。
另外，细胞培养过程中的传代也是容易导致污染的环节。
细胞传代是保持细胞生长的关键步骤，但传代时的细胞污染可能会导致细胞功能和表型的变化。
为了避免细胞污染，应该定期对细胞进行鉴定和检测，特别是使用发展中的分子标识技术。
这些技术可以帮助确定细胞是否保持纯种，以及是否受到污染。
此外，定期保存冻存品库并且用来传代的细胞不要超过特定的传代次数，以保持细胞的良好生长状态。
另一个需要关注的污染问题是培养器具的污染。
培养器具包括培养皿、培养瓶、移液器等。
这些器具在使用之前需要经过高温高压灭菌处理，以确保其无菌状态。
在使用过程中，需要注意避免直接接触器具内外部分，以减少污染的可能性。
同时，定期更换使用的培养器具也是非常重要的，以防止积累污染物。
最后，除了以上提到的对策，培养载体选择也可以在一定程度上减少细胞培养时的污染问题。
细胞培养污染的途径、危害及预防措施
细胞培养污染的途径、危害及预防措施污染是细胞培养技术中面临的主要问题。
由于每一种细胞有其独特的培养体系，因此污染造成的后果也不尽相同。
某些污染的发生往往难以察觉和检测，而且污染源能长期共存于培养体系中，这类污染事实上大部分被人们忽视了。
培养的细胞作为一个生物体，会对培养环境以及环境中的污染物作出相应的反应，造成培养细胞生物学特性的改变，而对实验结果造成潜在的威胁，而且随着污染时间的延长而增加。
培养环境中的物理、化学及生物因素都可能侵入培养环境造成污染。
由于入侵的微生物在培养体系中不断增殖、代谢，因此生物性的污染对细胞的危害最大。
随着污染微生物的不断增殖，交叉污染的可能性也不断增加。
此外，微生物代谢消耗大量必需的养分，同时产生多种有毒的代谢产物，如酶、抗原及毒素等，进一步对细胞产生毒害作用。
因此，熟悉细胞培养污染的途径及其危害性，建立细胞培养规范的操作方法及规章制度，可以有效地防止污染，保证实验体系的稳定性和可靠性。
1细胞培养基本技术为了减少污染对细胞培养的影响，必须建立细胞冻存库。
细胞冻存库应该分主细胞库和工作细胞库，当需要做实验时从主细胞库中复苏细胞建立工作细胞库。
每一个冻存标本都应明确记录细胞的性质、代数及有无污染。
同时还应建立规范的检测程序进行菌检及细胞鉴定［1］。
为了保证培养细胞系的完整性，必须进行具体的实验记录，应包括以下内容：细胞系的种类及来源、有无污染、细胞代数和倍增时间、以及选择性突变。
具体的记录有利于对细胞的遗传及生理特性在常规传代培养中因突变、污染及各种原因导致的改变进行分析。
经过连续传代培养的细胞与它较早代数的冻存细胞相比，随着培养时间的延长，细胞在适应环境的过程中，其生物特性已发生了改变。
培养的细胞由若干生长速度及活力各异的亚群组成。
随着培养时间的延长，生长速度快及活力高的细胞亚群逐渐占优势，这种选择性趋势会影响整个细胞群的生物特性。
应用不同代数的细胞连续进行实验则结果会发生偏差。
细胞培养中常见的污染的处理
细胞培养中常见的污染情况总结如下:常见的污染如下：1、细菌：细菌在普通倒置显微镜下为黑色细沙状，根据感染细菌的不同，可有不同的外形，培养液一般会浑浊变黄，对细胞生长影响明显。
仔细检查一下器皿的灭菌情况，是否在高压灭菌时放气时间足够，压力足够！尤其是和储存培养液接触的移液管等物品，连续两次污染的话有可能造成储存液污染，一定要注意！下次使用前检查一下培养液是否存在浑浊的现象！可在培养液中加相应的抗生素处理2、霉菌：培养液是清亮的，倒置显微镜下无杂质，37度孵箱培养2-3天，仍清亮，但出现絮状杂质，镜下可见呈细丝状的团状漂浮物，可看到明显的菌丝，细胞仍可生长，但时间长之后，细胞的活力状态变差，用硫酸铜溶液擦拭CO2孵箱内，再把水盘里也加上饱和量的硫酸铜。
或者在培养箱的托盘加入饱和的消毒磷酸氢二钠高盐液体,可以防止霉菌污染。
CO2孵箱被霉菌污染后，可把所有细胞暂时转移，采用过氧乙酸擦洗孵箱（包括隔板，箱壁）。
并把过氧乙酸放置在孵箱内一个小时，使其蒸汽弥漫。
待过氧乙酸的气味消散后，再移入细胞。
孵箱应定期清洁（2月左右），尤其在多雨的季节。
其它培养箱清洗方法是：用84液擦洗－清水擦洗－75%酒精擦洗－紫外灯照。
预防霉菌污染，可在培养基里加3u/ml的两性霉素或制霉菌素或放线菌素D或双抗；但细胞一旦污染，很难挽救，制霉菌素或放线菌素D或双抗都于事无补，建议舍弃该污染细胞。
，将环境彻底消毒，如果所有细胞都污染，可能是系统污染，检查一下培养基和器材，如果只是个别污染，可能是操作问题，就要注意操作3、支原体：黑色的，好象多为多形，培养液一般培养液一般会浑浊，原体感染，国内血清很多都没有做支原体阴性检测，而支原体是牛血清中最常见的微生物之一。
而且它不能用过滤的办法除去。
支原体感染细胞以后，细胞病变不很明显，只是慢慢死去。
用泰乐菌素，兽用支原体病的药，但可用于细胞培养，无任何不良反应。
Sigma公司的使用时用50ug/ml Tylosin培养液培养6天或连续传两代即可清除支原体污染。
细胞培养中的微生物污染预防与处理
细胞培养中的微生物污染预防与处理细胞培养作为一种重要的实验手段，在生物医学研究领域中得到广泛应用。
然而，在细胞培养的过程中，微生物污染往往成为一个严重的问题，可能对实验结果产生不良影响甚至导致实验结果的无效化。
因此，预防和处理细胞培养中的微生物污染是细胞培养实验中不可或缺的一环。
首先，预防细胞培养中的微生物污染至关重要。
以下是一些有效的预防措施：1. 严格执行无菌操作：细胞培养实验中，无菌操作是最基本也是最重要的环节。
在进行培养操作前，实验人员应该经过相关的培训和指导，了解无菌操作的正确步骤和技巧。
例如，在实验操作前经常更换手套、使用经过有效消毒的培养器具和培养基等。
2. 经常清洁和消毒实验环境：实验室环境和设备的清洁和消毒是预防微生物污染的另一个重要方面。
实验室的工作台面、实验室衣物、培养箱、孵化器等都需要经常进行清洁和消毒，以减少微生物的存在和传播。
3. 控制空气中的微生物：空气中的微生物往往是细胞培养中的污染源之一。
为了降低空气污染带来的风险，实验室应该配备高效过滤器的实验室通风设备，定期更换过滤器。
此外，实验室应该设置限制进出实验室的措施，例如，安装空气帘或者设置冲洗区域。
4. 识别和处理污染源：在细胞培养中排查和识别潜在的污染源是很重要的。
实验人员应经常检查培养器具、培养基和试剂等是否存在污染，一旦发现污染，应及时处理。
处理污染源的方法包括更换受污染的培养器具、重新配制新的培养基或试剂等。
其次，当细胞培养中发生微生物污染时，采取适当的处理方法也是至关重要的。
1. 立即停止受污染的实验：一旦发现细胞培养被污染，实验人员应立即停止受污染的实验，并将受污染的培养器具和培养基等隔离处理，以防止污染的进一步传播。
2. 进行污染源检查：在处理微生物污染的同时，必须找出污染源，并加以处理。
通过对培养器具、培养基和试剂等进行检查，可以找到导致污染的原因，进而采取相应的措施。
3. 清洁和消毒工作环境：在处理污染源的同时，必须对实验室的工作环境进行清洁和消毒。
如何预防细胞培养污染问题
如何预防细胞培养污染问题细胞培养是生物学和医学研究中常用的一种技术方法，但细胞培养过程中常常会面临细胞污染问题。
细胞培养污染会严重影响实验结果的准确性，因此需要采取一系列措施来预防细胞培养污染。
本文将介绍几种常见的细胞培养污染问题以及预防措施。
1. 细菌污染细菌污染是细胞培养中最常见的问题之一。
来自操作人员、试剂、培养器具和工作环境等多方面的细菌污染都可能导致细胞培养中的细菌污染。
预防措施：•穿戴合适的实验服和手套，并进行消毒处理，减少操作人员带入的细菌污染。
•使用无菌、高质量的试剂，并在实验中进行常规无菌操作，保持培养器具的无菌状态。
•经常对实验室进行清洁和消毒，保持工作环境的无菌。
2. 真菌污染真菌污染是细胞培养中另一个常见的问题。
真菌往往来自环境中的空气、试剂、培养器具或操作人员。
真菌污染会导致细胞生长异常，细胞死亡或实验结果异常。
预防措施：•定期消毒工作环境，特别是操作台和培养箱，避免真菌的滋生。
•使用高质量的培养基和抗生素，抑制真菌的生长。
•采取无菌技术操作，减少操作人员带入的真菌污染。
•定期更换培养器具，特别是培养瓶和培养皿，避免真菌滋生。
3. Mycoplasma 污染Mycoplasma 污染是细胞培养中常见但容易被忽视的问题。
Mycoplasma 是一类细小的细菌样微生物，常常会导致细胞株的污染。
Mycoplasma 污染会影响细胞生长、代谢以及实验结果的可靠性。
预防措施：•定期检测细胞株的 Mycoplasma 污染情况，可以使用 PCR 或流式细胞术等方法进行检测。
•新购买的细胞株进行隔离培养，并进行 Mycoplasma 检测，确保细胞株的无菌性。
•严格控制培养器具、培养基和操作人员的无菌操作，减少Mycoplasma 污染的可能性。
•定期更换培养基并添加抗生素，可以抑制 Mycoplasma 的生长。
4. 交叉污染交叉污染是指在细胞培养过程中，不同细胞株之间发生的细胞混合现象。
防止细胞污染的操作方法
防止细胞污染的操作方法细胞污染是细胞培养中常见的问题之一，它会对实验结果产生不可预知的影响，严重时可能会导致实验结果完全无效。
因此，及早识别和防止细胞污染非常重要。
下面是一些常见的防止细胞污染的操作方法。
1. 经常检查细胞培养的外观：在培养细胞的过程中，定期观察细胞的外观，检查有无明显的变化，如细胞聚集、颜色变化、结块、附着性变差等。
这些都可能是细胞污染的征兆。
及时发现细胞污染征兆，有利于尽早采取措施。
2. 维持培养器具的清洁：用过的培养器具必须清洗干净，避免细胞残留在器具表面。
在清洁器具时，最好使用清洁剂将培养器具浸泡一段时间，然后用纯净水冲洗。
同时，定期清洁培养箱和工作台，以确保无尘无菌的环境。
3. 做好工作区的消毒：在进行细胞培养前，务必将工作台等操作区域用70%的乙醇或其他适当的消毒液进行消毒。
消毒液应遵循使用说明，充分喷洒并等待一定时间以确保消毒效果。
4. 使用无菌技术：在进行细胞培养前，务必采取无菌技术操作。
如穿戴干净的实验服、手套、口罩等。
同时，使用无菌的工具（如无菌吸管、移液器、移液枪等）以及培养基和其他试剂。
避免细胞培养物受到外界的污染。
5. 定期更换培养基：细胞的培养基是提供细胞生长所必需的营养物质和生长因子的重要条件。
长时间使用同一瓶培养基，极易导致培养基受到细菌、真菌等微生物的污染。
因此，为了避免细胞污染，应定期更换新的培养基。
6. 使用抗生素：对于一些易受污染的细胞系，可在培养基中加入适量的抗生素，如青霉素、链霉素等。
抗生素的添加可以有效地避免细菌和其他微生物对培养细胞的污染。
7. 培养细胞的操作要规范和细致：在培养细胞的过程中，应遵循操作规程，确保每一步都得到妥善处理。
如避免细胞悬液直接接触容器的外壁，避免使用过时、变质的培养基和试剂等。
同时，在更换培养液或进行细胞分离时，注意不要将废液溢出，并及时清理溢出的部分。
8. 细胞常规检测：为了及早发现细胞污染并及时采取相应措施，应定期进行细胞的常规检测。
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细胞的冻存
概述：超低温保存（-196°C） 低温保存（-80°C或-105°C） 保护剂 慢速
目前，细胞冻存最常用的技术是液氮冷冻保存法，
主要采用加适量保护剂的缓慢冷冻法冻存细胞。细 胞在不加任何保护剂的情况下直接冷冻，细胞内外 的水分会很快形成冰晶，从而引起一系列不良反应。 如果细胞内冰晶形成较多，随冷冻温度的降低，冰 晶体积膨胀造成细胞核DNA空间构型发生不可逆的 损伤，而致细胞死亡。因此，细胞冷冻技术的关键 是尽可能地减少细胞内水分，减少细胞内冰晶的形 成。采用甘油或二甲基亚砜作保护剂，这两种物质 分子量小，溶解度大，易穿透细胞，可以使冰点下 降，提高细胞膜对水的通透性，且对细胞无明显毒 性。慢速冷冻方法又可使细胞内的水分渗出细胞外， 减少胞内形成冰结晶的机会，从而减少冰晶对细胞 的损伤。
预防：最有效，严密消毒、谨慎操 作。
第八章 细胞的冷冻保存复苏技 术
细胞的传代是有限制的，长期连续 传代的细胞，不仅消耗大量的人力和物 力，而且细胞的生长与形态等会有一定 退变或转化，因而细胞失去原有的遗传 特性，有时还会由于细胞污染而造成传 代中断，种子丢失。因此，在实际工作 中常需冻存一定数量的细胞，以备替换 使用。细胞冷冻与复苏是细胞培养室的 常规工作和通用技术。
冻存方法 观察细胞，洗涤细胞，计数并调整数 量。 滴加冻存保护剂，慢速。 逐步降温，慢速。
细胞的复苏 快速、无菌。 稀释冻存液，洗涤细胞。 观察细胞，及时换液。
细胞的运输 冷冻储存运输 充液法运输
第九章 培 养 细 胞 的 观 察 与检测方法
常规检查和观察方法
肉眼观察：颜色、透明度。 显微镜观察：细胞形态、折光度、 排列。 细胞生长状态：数量、形态。 无菌状态：培养基清晰度、细胞状 态。
污染来源及鉴别 来源：1. 取材不慎或处理不当 2. 空气尘埃 3. 消毒不严 4. 操作不当 5. 试剂尤其是血清污染
鉴别：
1. 细菌、真菌的检测 肉眼观察、镜下观察、接种观察。
2. 支原体检测 培养、电镜、荧光等 。
污染的清除和预防
清除：较困难，抗生素、加温、抗 体等。如传代细胞有留存，或可购 置，生长曲线 分裂指数 接种存活率 克隆形成率
细胞生物活性的检测
MTT比色法 考马斯亮蓝法 蛋白质合成的3H亮氨酸掺入试验 DNA合成测定（ 3H-TdR掺入法、流 式细胞仪测定法）
电子显微镜观察法 透射电镜 扫描电镜
活细胞的观察方法
倒置相差显微镜观察 暗视野显微镜观察 缩时显微镜观察 活细胞染色：台盼蓝染色
细胞固定观察法 固定剂：甲醇/醋酸、FAA液、Carnoy 等
常用染色法： H.E(苏木精－伊红）染色法 Giemsa染色法
特殊染色方法 Feulgen染色法：胞核粉红色 免疫荧光染色法：抗原抗体反应，荧光 免疫酶染色法：抗原抗体反应，棕褐色 细胞银染色法：反映增殖，黑色颗粒 考马斯亮蓝（Coomassie，BB)染色 法： 蓝色 微丝
细胞培养的污染及控制
污染是细胞培养的大敌。预防和 避免污染是细胞培养成功的关键之 一。一开始就要十分重视，应积极 采取措施，防止污染，否则会前功 尽弃，不仅浪费时间，而且浪费人 力、物力，甚至造成无法弥补的损 失。
污染的类型 一、细菌：较常见，G+菌较多，多浑浊。 二、真菌：最常见，霉菌较多，见菌丝。 三、支原体：常见，不易检测。 四、病毒：影响疫苗生产。 五、非同种细胞：细胞系丢失。 六、化学成分：出现毒害或营养不良。