最新ELISA双抗体夹心法
ELISA双抗体夹心法
点击次数：320 作者：百奥迈科发表于：2009-03-13 16:18转载请注明来自丁香园
1、原理
ELISA 的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。
结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。
受检标本与固相载体表面的抗原或抗体起反应。
用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。
加入酶标记的抗原或抗体，通过反应也结合在固相载体上。
加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，根据呈色的深浅进行定性或定量分析。
酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，使测定方法达到很高的敏感度。
2、特点
某些分泌型蛋白，用siRNA 干扰后可以用ELISA 进行检测。
3、ELISA 实验流程示图（以双抗体夹心法为例）
4、试剂与耗材
（1）包被缓冲液（pH 9.6 0.05 M 碳酸盐缓冲液）：
（2）洗涤缓冲液（pH 7.4，0.15 M PBS）：
（3）稀释液：
（4）终止液（2 M H2SO4）：
（5）底物缓冲液（pH 5.0）：
（6）四甲基联苯胺（TMB）使用液：
（7）2，2’-连氮基-双-3-乙基-苯丙噻唑啉磺胺（ABTS）使用液：
（8）抗原、抗体和酶标记抗体：按说明书处理。
（9）标准品：用稀释液稀释成梯度浓度溶液。
（10）96 孔聚苯乙烯塑料板（酶标板）。
2、实验步骤（双抗体夹心法）：
（1）包被：用包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1-10 μg/mL。
在酶标板反应孔中加0.1 mL，4℃过夜。
次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗板3 次，每次3 min。
（2）加样：加一定浓度稀释的待检样品（同时做空白对照，阴性对照孔及阳性对照）0.1 mL 于上述已包被的反应孔中，置湿盒中，37℃， 1 hr。
用洗涤缓冲液洗板3 次，每次3 min。
（3）加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体（经滴定后的稀释度）0.1ml。
37℃，0.5 - 1 hr，用洗涤缓冲液洗板3 次，每次3 min。
（4）加底物液显色：于各反应孔中加入现配的TMB 底物溶液0.1 mL，37 ℃，10 - 30min。
（5）终止反应：于各反应孔中加入终止液0.05 mL。
（6）结果判定：将酶标板在酶标仪上，于450 nm （若ABTS 显色，读410 nm），读数，输出到Excel 中。
（7）以标准品浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，生成标准曲线和直线回归方程式，根据公式计算未知样品的浓度，并记录。
双抗夹心法-ELISA
双抗夹心法ELISA（TAS-ELISA）步骤：1、准备可控温培养箱或摇床和样品。
样品用液氮或研钵研磨碎，再用组织：1×GEB 缓冲液=1:10（g:ml）浓度液提取。
2、用碳酸盐包被缓冲液稀释一抗，稀释倍数为200倍。
每孔加入稀释后的一抗100μl。
将加入一抗的酶标板用锡箔纸包裹，置于4℃下过夜或室温下放置4小时或37℃下放置2小时。
3、一抗包被结束时，在水池中倒出剩余液体，用1×PBST洗4-5次，每次将酶标板在吸水纸上用力拍一下以去除多余液体。
4、每孔加入100μl事先处理好的样品，每批实验均需加入阳性对照和样品提取液（GEB）。
将加入样品的酶标板用锡箔纸包裹，置于4℃下过夜或室温下放置4小时或37℃下放置2小时。
5、样品包被时间结束时，在水池中快速倒出剩余样品液体，用1×PBST洗7次，最后一次在吸水纸上用力拍一下以去除多余液体。
在室温中放置5min，或用枪头吸尽孔中液体。
6、用ECI抗体稀释液稀释酶标二抗，稀释倍数为200倍。
每孔加入稀释后的二抗100μl。
将加入二抗的酶标板用锡箔纸包裹，置于4℃下过夜或室温下放置4小时或37℃下放置2小时。
7、二抗包被结束时，在水池中快速倒出剩余抗体，用1×PBST洗8次，最后一次在吸水纸上用力拍一下以去除多余液体。
在室温中放置5min，或用枪头吸尽孔中液体和气泡。
8、在二抗包被结束前15min中准备底物显色液。
PNPP/1×PNP Buffer=1mg/ml的浓度配制，避光保存。
每孔加入底物100μl。
将加入底物的酶标板用锡箔纸包裹，置于37℃下孵育1小时。
9、显色30min时用肉眼观察显色结果，阳性孔应该显色，GEB孔应该无色。
直到显色1h时，阴性仍然无色就在酶标仪上测405nm处的OD值，求出阴性对照的OD值的值N，若样品OD值P≥2N，则视为阳性，否则为阴性。
试剂：。
双抗体夹心法原理
双抗体夹心法原理
双抗体夹心法（double-antibody sandwich assay）又称为酶联免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）是一种常用的免疫学检测方法，用于检测目标物质，如蛋白质、抗原或抗体等。
双抗体夹心法的原理是利用两种不同的抗体，一种用于固定在检测板上，另一种被标记着酶，并用于检测样本中的目标分子。
在检测时，将待测样本加入到固定抗体覆盖的检测板孔中，待目标分子结合到固定抗体上后，洗涤样本，加入酶标记的抗体，酶与目标分子再次结合形成“夹心”复合物。
通过在底物的作用下，酶能够将底物转化为荧光或颜色生成物，由于只有与目标分子结合的酶标记的抗体才能够被夹持，因此可以确定样本中目标分子的数量，通过比较标准品样本的反应值得出定量。
总的来说，双抗体夹心法的优点是具有高灵敏度、特异性、精确度高以及批量化检测的优点，同时也非常适合小样本检测。
因此，双抗体夹心法被广泛应用于医学、食品安全、环境监测等领域的检测中。
ELISA操作步骤(双抗体夹心法)
ELISA操作步骤（双抗体夹心法）1. 包被过程(注意设置空白对照,阴性对照):将所用抗原用包被稀释液稀释到适当浓度，每孔抗原加入100μl, 置37℃,4h,或4℃,24h;弃去孔中液体，(为避免蒸发,板上应加盖或将板平放在底部有湿纱布的金属湿盒中)。
2 PBS洗3次，每次3分钟。
具体为.吸干或甩干孔内反应液；.用洗涤液过洗一遍（将洗涤液注满板孔后，即甩去）；浸泡，即将洗涤液注满板孔，放置1-2分钟，间歇摇动，浸泡时间不可随意缩短；吸干孔内液体，可甩去液体后在清洁毛巾或吸水纸上拍干；.重复操作涤3次。
3. 加入待检测样品(建立合适的浓度梯度):检测时一般采用1:50-1:400的稀释度, 应采用较大稀释体积进行,一般保证样品吸取量>20μl。
将稀释好的样品加入酶标反应孔中，每样品至少加双孔，每孔100μl，置于37℃,40-60min。
4 PBS洗3次，每次3分钟。
5. 加入酶标抗体:酶标抗体: 根据酶结合物提供商提供的参考稀释度进行或建立浓度梯度，37℃,30-60min之间，短于30min往往结果不稳定，每孔加100μl。
6 PBS洗3次，每次3分钟。
7. 加入底物液(现用现配):TMB(四甲基联苯胺)使用液:TMB(10mg／5ml无水乙醇) 0.5ml底物缓冲液(PH5.5) 10ml0.75％H2O2 32μl，底物加入量每孔100μl（TMB空白显色孔除外）,置37℃避光放置20-25分钟。
8. 终止反应:每孔加入终止液50μl(2M H2SO4)终止反应,此时蓝色立转黄色，于20min内测定实验结果。
9 结果判断:可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅。
也可测吸光值：在ELISA检测仪上，TMB反应产物检测需要450nm波长，检测时一定要首先进行空白孔系统调零。
用测定标本孔的吸收值与一组阴性标本测定孔平均值的比值(P/N)表示，当P/N大于2时作为抗体的效价即大于阴性对照吸光值的2倍，(数值的大小依具体检测要求而定)。
免疫学实验ELISA双抗夹心法课件
小于判断值为阴性。 注：阴性对照OD值小于0.05按0.05计算，
大于0.05按实际OD值计算判断值。
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注意事项：
1. 试剂及待测标本使用前应平衡至室温，并将试剂混匀， 弃去1～2滴垂直滴加；
2. 严格按照操作程序依次加样，以保证实验结果准确性； 3. 应尽量避免孔中有气泡，以免所测得OD值不准确。
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思考题：
1.免疫标记技术有哪些？各有何特点？。 2.ELISA操作过程中应注意哪些问题？
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2009级医疗专科复习题
一、名词解释2.5*8,共20分
免疫、抗原、抗原决定基(表位)、异嗜性抗原、白细胞分 化抗原、TD-Ag、 TI-Ag、抗体、免疫球蛋白、单（多）克 隆抗体、补体、经典途径、旁路途径、细胞因子、IL、IFN、 CSF、TNF、MHC、MHC限制性、TCR、BCR、模式识别 受体（PRR）、抗原提呈细胞（ APC）、适应性免疫应答、 免疫耐受、免疫调节、超敏反应、人工主动免疫、人工被动 免疫、计划免疫 注：红色标记为要求掌握英文
实验原理：
酶联免疫吸附试验（ELISA）是将抗原、抗体的特异性反应与酶对底 物的高效催化作用相结合的一种敏感性很高的实验技术，可用于检测体 液中微量的特异性抗体或抗原。首先，抗原、抗体的特异性反应在一种 固相载体表面－聚苯乙烯微量反应板孔中进行，通过洗涤去除多余的游 离反应物；然后加入酶标记的抗体或酶标记的抗抗体，从而形成抗体－ 抗原－酶标抗体复合物（双抗体夹心法）或抗原－抗体－抗抗体复合物 （间接法）；此时加入酶底物和显色剂，在酶催化底物后，液体呈现显 色反应。液体显色的强弱与复合物中待测抗原或抗体的量呈正比，借此 可检测待测抗原或抗体的有无及含量。
elisa双抗体夹心法实验报告
elisa双抗体夹心法实验报告实验报告：ELISA双抗体夹心法实验一、实验目的本实验旨在通过ELISA双抗体夹心法，检测待测样品中目标蛋白的含量，为相关研究提供依据。
二、实验原理ELISA（酶联免疫吸附试验）是一种灵敏的免疫学检测方法，通过将特异性抗体与酶标记结合，实现对目标蛋白的定量检测。
双抗体夹心法是一种常用的ELISA 技术，其原理是将两种特异性抗体分别固定在酶标板的不同位置上，形成两个“抗体夹心”，实现对目标蛋白的双重捕获，从而提高检测的灵敏度和特异性。
三、实验步骤1.酶标板包被：将第一种特异性抗体（capture antibody）包被在酶标板孔中，以固定化抗体形式捕获目标蛋白。
2.封闭：加入封闭液（通常为正常血清或BSA），填充孔内未结合的位点，以减少非特异性吸附。
3.洗涤：洗涤液清洗酶标板，去除未结合的物质。
4.样本加入：将待测样本加入酶标板孔中，与固定化的抗体发生特异性结合。
5.洗涤：再次洗涤酶标板，以去除未结合的物质。
6.酶标二抗加入：将第二种特异性抗体（detection antibody）与酶标记结合，形成酶标二抗。
将酶标二抗加入酶标板孔中，与目标蛋白发生特异性结合，形成“抗体夹心”。
7.洗涤：洗涤液清洗酶标板，去除未结合的物质。
8.显色反应：加入底物溶液，发生显色反应。
若目标蛋白存在，则呈现颜色变化。
9.终止反应：加入终止液，停止显色反应。
10.吸光度测定：用酶标仪测定各孔的吸光度值（通常在450nm处测量），根据吸光度值判断目标蛋白的含量。
四、实验结果根据实验数据，绘制标准曲线图和散点图，分析待测样品中目标蛋白的含量。
通常，标准曲线图横坐标为蛋白浓度，纵坐标为吸光度值。
通过将待测样品的吸光度值与标准品进行比较，计算出待测样品中目标蛋白的浓度。
五、实验总结本实验通过ELISA双抗体夹心法成功检测了待测样品中目标蛋白的含量。
实验过程中需注意保持操作环境的清洁和干燥，避免影响实验结果。
elisa双抗体夹心法临床应用
elisa双抗体夹心法临床应用ELISA（酶联免疫吸附试验）是一种广泛应用于生物医学领域的实验技术，可以用于检测特定抗体或抗原的存在。
在ELISA实验中，常用的检测方法之一就是双抗体夹心法。
本文将介绍ELISA双抗体夹心法在临床应用中的重要性和优势。
一、ELISA双抗体夹心法原理ELISA双抗体夹心法是一种通过两种抗体反应来检测目标分子的方法。
首先，在试验板上吸附抗原，然后加入第一种对抗原特异的抗体，使其与抗原结合。
接着，加入第二种与第一种抗体不同的抗体，这第二种抗体常被标记有酶等物质，以便后续检测。
通过测量酶的底物反应程度，可以确定目标分子的存在量。
二、ELISA双抗体夹心法在临床诊断中的应用1. 疾病诊断：ELISA双抗体夹心法可以用于检测患者体液中特定抗原或抗体的存在，帮助医生进行疾病的早期诊断。
例如，在HIV感染的诊断中，ELISA双抗体夹心法有着很高的敏感性和特异性，可以快速准确地检测出HIV抗体的存在。
2. 肿瘤标记物检测：ELISA双抗体夹心法也常用于检测患者体液中的肿瘤标记物，帮助筛查和监测肿瘤患者的疾病进展。
通过检测血清中特定肿瘤标记物的水平，医生可以及早发现肿瘤的复发或转移。
3. 药物检测：在药物治疗过程中，ELISA双抗体夹心法可以帮助医生监测患者体内药物浓度的变化，确定药物的治疗效果，以及调整治疗方案。
三、ELISA双抗体夹心法的优势1. 敏感性高：ELISA双抗体夹心法可以检测非常低浓度的抗原或抗体，具有较高的敏感性。
2. 特异性好：通过选择特异性较好的抗体，可以确保ELISA双抗体夹心法对目标分子的检测具有较高的特异性。
3. 操作简便：ELISA双抗体夹心法操作简单，不需要复杂的仪器设备，适合临床快速检测的需求。
总结：ELISA双抗体夹心法作为一种重要的生物医学检测技术，在临床应用中发挥着重要作用。
其高敏感性、良好特异性和操作简便性，使其成为临床诊断和治疗中不可或缺的工具，有助于提高疾病的早期诊断率和治疗效果，促进患者的健康管理。
ELISA测定的常用模式--双抗体夹心法测抗原
ELISA测定的常用模式--双抗体夹心法测抗原临床ELISA测定的常用模式--双抗体夹心法测抗原对于含多个抗原决定簇的大分子蛋白，使用双抗体夹心ELISA模式测定相当简便，现有的商品试剂盒基本上都采用此种测定模式。
具体测定方法如下：1．首先以双抗体之一于碳酸盐缓冲液中4℃下过夜包被聚苯乙烯等固相，形成固相抗体，洗涤去除未与固相结合或结合不紧的抗体后，用小牛血清或牛血清白蛋白等封闭，洗涤去除未结合的部分及杂质。
2．加入含待测物的临床样本如血清等，温育一定时间后洗板；此时，待测抗原就会与固相上特异抗体反应而吸附于固相上。
3．加入酶标记的双抗体之二，温育一定时间后洗板；此时，在固相上即形成双抗体与特异抗原的夹心产物。
4．加入酶底物，温育显色测定(图2—1)。
在该测定模式中，有两步温育和板孔洗涤步骤，如果将上述测定步骤2和3并为一步，即将待测样本和酶标抗体同时加入，从而仅有一步温育和洗板过程，即为通常所说的“一步法”。
最初的双抗夹心ELISA试剂盒，均采用两步法。
后来，人们为了节省时间，简化操作步骤，试剂生产厂家逐步推出了“一步法”试剂盒。
目前在我们的临床实验室中，测定大分子抗原如HAg、。
FP和hCG等，基本上都采用一步法。
一步法相比于两步法，虽然操作简单‘但有其固有的缺陷，处理不好，对ELISA测定结果有严重影响。
在通常的两步温育洗涤方法中，抗原抗体反应将遵循下述规律，即在第一步中加入的待测标本中抗原(Ag)浓度逐步增加时，将使固相抗体(Ab)与抗原的结合逐步达到饱和[(1)式]，这样当随后加入一定浓度的酶标抗体(Ab’)后，a复合物的形成将直接与在第一步中形成的b复合物相关[(2)式]，因此，待测抗原浓度的逐步增加导致了显色的逐步加深，当抗原浓度增加到一定程度时，反应显色达到平台，而呈S形变化曲线。
而一步法双抗夹心ELISA的反应曲线则为钟形曲线。
也就是说测定显色随着待则标本中抗原浓度的增加而升高至一定程度后，测定吸光度即随抗原浓度的增加而开始下降直至不显色，即所谓的“钩状效应”(hook eHect)，也就是我们在免疫沉淀试验中所称的“带现象”(zonephen。
酶联免疫吸附双抗体夹心法
性抗体作用。显色。
结合在固相载体表面的抗原（或抗体）仍保持其免疫学活性。
固相(包被)抗体Ab + 样品(抗原Ag) + 酶标抗体Ab * ELISA的三条基本原理
这种方法欲测的抗原必须有两个可以与抗体结合的部位，因为其一端要与包被于固相载体上的抗体作用，而另一端则要与酶标记特异
性抗体作用。
这种方法欲测的抗原必须有两个可以与抗体结合的部位， 加入封闭蛋白溶液以封闭载体
这种方法欲测的抗原必须有两个可以与抗体结合的部位，因为其一端要与包被于固相载体上的抗体作用，而另一端则要与酶标记特异
性载抗体体 连作接用形。成因固相为抗体其一端要与包被于固相载体上的抗体作用，而另一端
则要与酶标记特异性抗体作用。 由于酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，使测定方法达到很高的敏感度。
酶联免疫吸附双抗体夹心法
优选酶联免疫吸附双抗体夹心法
一、实验目的 1 掌握酶联免疫吸附实验（ELISA）的原理 2 熟悉酶联免疫吸附实验的操作方法
二、实验原理
❖ 基础知识
1971年瑞典学者Engvail和Perlmann,荷兰学者 Van Weerman和Schuurs分别报道将免疫技术发 展为检测体液中微量物质的固相免疫测定方法， 即酶联免疫吸附测定法 (enzyme-linked immunosorbent assay , ELISA) 。ELISA现在 已成为目前分析化学领域中的前沿课题 ，它是 一种特殊的试剂分析方法，是在免疫酶技术 ( immunoenzymatic techniques ) 的基础上 发展起来的一种新型的免疫测定技术。
双抗体夹心elisa方法的原理
双抗体夹心elisa方法的原理
宝子，今天咱来唠唠双抗体夹心ELISA方法的原理哈。
ELISA呢，就是酶联免疫吸附测定，这双抗体夹心ELISA可有意思啦。
它就像是给抗原这个小坏蛋设了个包围圈。
有两种抗体参与哦。
一种是捕获抗体，就像一个小陷阱，先被固定在检测板上，就等着抗原上钩呢。
这个捕获抗体的形状和抗原的某个部分特别匹配，就像一把钥匙配一把锁一样。
然后呢，咱们要检测的抗原就大摇大摆地来了，它一头就扎进了捕获抗体这个小陷阱里，紧紧地结合在一起啦。
这时候，另一种抗体，也就是检测抗体就登场啦。
检测抗体也是专门针对抗原的，它从另一个方向和抗原结合，就像给抗原来了个前后夹击。
这个检测抗体还带着特殊的标记呢，就像是它的小标签。
这个标记可以是酶之类的东西。
接下来就更有趣啦。
当我们加入底物的时候，因为检测抗体上带着酶标记，这个酶就像一个小工匠，它会对底物进行加工。
底物被加工之后呢，就会发生一些变化，比如说变色啦。
我们就可以根据这个变化的程度来判断抗原的量。
如果颜色变得很深，那就说明抗原的量比较多；要是颜色浅，那抗原的量就少啦。
双抗体夹心ELISA方法可厉害了，它能够很灵敏地检测出抗原。
在医学上呀，它能检测出身体里是不是有病毒或者细菌的抗原，帮助医生判断病情。
在食品检测里呢，也能检测出有没有有害的微生物抗原，保障我们的食品安全。
反正这双抗体夹心ELISA方法就像一个小小的侦探，在微观的世界里，把抗原这个小目标给找出来，然后告诉我们它的情况呢。
是不是很神奇呀，宝子？ 。
双抗原抗体夹心法的原理
双抗原抗体夹心法的原理
双抗原抗体夹心法（Sandwich ELISA）是一种常用的酶联免疫吸附试验方法，用于检测具有两个抗原表位的物质，如蛋白质。
该方法的原理是，在试验板上固定一种特异性抗体，使其与待测物质中的目标抗原结合。
然后，通过洗涤步骤去除非特异性结合物质。
接下来，在试验板上加入第二种特异性抗体，这种抗体与目标抗原的另一个表位结合，与第一种抗体形成"夹心"结构。
然后，再次进行洗涤步骤，以去除非特异性结合物质。
最后，加入带有酶标记的二抗，这种二抗能够与第二种抗体结合，形成夹心结构，并且带有酶标记的二抗能够与底物反应，产生可检测的信号。
通过测量底物的反应产物的颜色或发光强度，就可以确定目标抗原的存在量。
双抗原抗体夹心法的优势在于能够提高检测的灵敏度和特异性，因为需要两个特异性抗体结合目标抗原才能形成夹心结构，减少了非特异性结合的干扰。
这种方法广泛应用于生物医学研究和临床诊断中，用于检测各种蛋白质、肽、细胞因子等分子的含量。