变性梯度凝胶电泳.
变性梯度凝胶电泳
变性梯度凝胶电泳《变性梯度凝胶电泳》是一种有效的分离技术，它可以帮助科学家快速有效地分离不同类型的分子。
它和其他分离技术相比，有着独特的优势和不可替代的优势。
变性梯度凝胶电泳（DGGE）采用特殊的凝胶在不同变性环境中电泳，以有效地分离不同类型的DNA片段和蛋白质。
正常情况下，由于更多的低能量的片段的存在，特定的变性环境会吸引这些较低能量的片段，并且它们走的路程也会比较短，而其他高能量的片段则会走的路程会更长。
因此，将凝胶改变到一种低能量的片段可以吸引，而走得路程更长的片段，则可以有效地将这些片段分离开来。
DGGE的优点是它可以有效分离不同片段的DNA和蛋白质，并且可以更快地分离出更多的细小片段。
此外，由于DGGE有一个独特的低能量环境，它可以更好的区分不同的片段，而不会受到其他分离技术的限制。
另外，DGGE是一种半定量的分离技术，可以让研究者比较不同片段之间的相对含量。
除了上述优势，DGGE还具有一些缺点。
首先，由于梯度凝胶电泳系统搭建起来比较复杂，使用它来进行分离技术需要比较复杂的实验技术。
其次，由于梯度凝胶电泳系统比较复杂，对系统的调整和控制非常复杂，只有熟练的实验室人员才能处理好这些技术。
变性梯度凝胶电泳的应用非常广泛，它可以用来分离和分析不同类型的DNA片段和蛋白质，甚至可以用来检测细菌的抗药性。
它也可以用来研究基因的多样性，用于癌症和免疫系统的研究，以及对特定疾病的诊断。
最后，它也可以作为一种植物鉴定技术，用于比较不同植物类型间的分子差异。
总之，变性梯度凝胶电泳（DGGE）是一种有效的分离技术，它可以用于研究不同类型的DNA片段和蛋白质，还可以用于分析肿瘤细胞的分子结构，对特定疾病的诊断和植物鉴定。
它具有独特的低能量环境，可以更好的区分不同的片段，而不会受到其他分离技术的限制。
它具有快速、高效和半定量的优势，是研究DNA分子和蛋白质的有效分离技术。
变性梯度凝胶电泳技术及其在人工湿地及养殖水体中应用的研究进展
（ １ ． 南京农业 大学无锡渔业学院 ， 江苏无锡 ２ １ ４ ０ ８ １ ；
２ ． 中国水产科学研究院淡水渔业研究中心／ 农业部 淡水渔业和种质资源利用重点实验室， 江苏无锡 ２ １ ４ ０ ８ １ ）
摘要 ： 简要 介绍了 Ｄ Ｇ Ｇ Ｅ技术的基本原理及技术路线 ， 概述 了该技术在检测 中存在 的主要优缺点并对其存在的主 要缺点进行 了技术优化 ， 重点综述了 Ｄ Ｇ Ｇ Ｅ技术在人工湿地及养殖水体微 生物群落 多样 性和动态性 研究 中的最新进
Ｄ Ｇ Ｇ Ｅ技术是所有可 以不依赖培养指 纹技术 中应用最广
泛 的技术之一 ， 它经 常被用 来评估环境样 品 中的微 生物群落 结构， 并且 随着 相应 的环 境变 化来 决定 微生 物群 落 的动态 性 。所采 用的 Ｄ Ｇ Ｇ Ｅ技术与以往 的电泳技 术不 同， 它不是
将分子量不 同的 Ｄ Ｎ Ａ分 子分开 ， 而是将序列 不 同的 Ｄ Ｎ Ａ分 子分开 ， 该Ｄ Ｎ Ａ分子在 聚丙烯酰胺凝胶电泳中根据变性剂浓 度梯度 的不 同彼此之 间相 互分离 。该技术 的主要原理如 下 ： 当双链 Ｄ Ｎ Ａ分子 在含梯度 变性剂 （ 尿 素、 甲酰胺 ） 的聚丙烯
的微生物群落 ， 然后开发微生物制剂 。研究发现 ， 微生物群落 对有机物质 的矿化 和 氮、 硫、 磷 等物 质 的移 除 至关 重 要 。
一
稳定 和提高提供理论基础 ， 而此是 一个值得研 究的课题 。本
文简要概述 了 Ｄ Ｇ Ｇ Ｅ相 关 的原 理及 技 术路 线 ， 重 点介 绍 了 Ｄ Ｇ Ｇ Ｅ技术在人工湿地和养殖池塘中应用 的最新研究进展。
目前 ， 关于湿地科学 的研 究主要集 中在湿地资 源的开发
变性梯度凝胶电泳
变性梯度凝胶电泳摘要：变性梯度凝胶电泳（DenaturingGradientGelE1ectrophoresiS，DGGE）是由Fisher 和Lerman发明用于检测DNA突变的技术，其主要是基于突变型和野生型棱酸序列的不同而导致其变性浓度的差异，利用变性梯度凝胶进行分离, 该手段分辨率达一个碱基。
恒定变性凝胶电泳(CDGE)、瞬时温度梯度电泳(TTGE)和温度梯度凝胶电泳(TGGE)是由DGGE经改进而成。
它们在突变分析上都有着重要的作用。
关键词：变性梯度凝胶电泳、恒定变性凝胶电泳、瞬时温度梯度电泳、温度梯度凝胶电泳1、前言：随着结构基因组计划接近尾声，人类基因神秘的面纱已逐步揭开，GenBank中已知基因的数目也与日俱增，各种遗传病的相关基因也了解得越来越多。
但是，在找到了候选基因后，还需要在相关的遗传病病人中进行突变检测，只有找到了相应的突变。
才能真正确定该基因与疾病的关系，从而服务于临床。
变性梯度凝胶电泳就是一种很有实用价值的突变分析方法。
该方法经改进，又发展出了恒定变性凝胶电泳(constant denaturant gel elec—trophoresis，CDGE)、瞬时温度梯度电泳(temporaltemperature gradient electrophoresis，TTGE)和温度梯度凝胶电泳(temperature gradient gel elec—trophoresis，TGGE)。
现在上述方法已经广泛应用于遗传病的诊断、突变分析和肿瘤相关基因的筛查等许多方面。
2、基本原理2.1变性梯度凝胶电泳由Fisher和Izrman口3于1983年创立，以后该技术和PCR技术相结合被广泛应用于各种突变分析。
它主要是利用梯度变性胶来分离DNA片段。
电泳开始时，DNA在胶中的迁移速率仅与分子太小有关，而一旦DNA泳动到某一点时，即到达该DNA变性浓度位置时，使得DNA双链开始分开，从而大大降低了迁移速率。
DGGE实验
DGGE的基本原理DGGE(denaturing gradient gel electrophoresis变性梯度凝胶电泳)不是将分子量不同的DNA分开,而是通过PAGE(聚丙烯酰胺)凝胶中变性剂浓度梯度的不同,将序列不同的DNA分开。
该方法的原理是根据DNA 的解链特性,不同碱基组成的DNA双螺旋发生变性所要求的变性剂浓度不同,混合双链DNA在变性剂浓度呈线性梯度增加的聚丙烯酰胺凝胶电泳时,当泳动到与DNA变性所需变性剂浓度一致的凝胶位置时,相对应的DNA发生解链变性,导致电泳迁移速率降低。
由于泳动受阻DNA分子在凝胶中的停留位置不同,从而使不同DNA分子得以分离。
根据变性剂梯度方向的不同, DGGE可分为:垂直DGGE,即变性剂梯度与电场方向垂直,常用于试验决定分离型、野生型和变异型的最佳变性剂梯度范围;平行DGGE,其变性剂的梯度和电场方向平行,主要用于解链范围明确的DNA片段的检测。
DGGE实验一．1.制胶：使用梯度胶制备装置，分别制备30%和60%的变性胶。
DGGE制胶参数制胶30%变性胶的配置20（ml）60%变性胶的配置20（ml）40%丙烯酰胺（Bis-Acr）5ml 5ml50×TAE 400ul 400ulFormamide去离子甲酰胺 2.4ml 4.8ml尿素（urea） 2.52g 5.04gDdH2O 定容至20ml 定容至20ml最后加（几分钟内凝固）10%AP(APS) 100ul 100ul TEMED 20ul 20ul试剂配方：40%丙烯酰胺（Bis-Acr）：Acrylamide 丙烯酰胺 38.93gBis-acylamide 双丙烯酰胺 1.07g蒸馏水定容至100ml50×TAE：TrisBase 242.0g冰醋酸 57.1mlEDTA o.5M PH 8.0 100ml去离子水定容至1000ml。
10%APS； Ammonium persulfate 过硫酸铵 0.1g，蒸馏水定容至1.0ml.2.灌胶具体步骤见设备说明3.点样缓冲液加热至60℃后准备点样。
TGGE变性梯度凝胶电泳DGGE-Equl
变性梯度凝胶电泳（DGGE）和温度梯度凝胶电泳（TGGE）变性梯度凝胶电泳（DGGE）产品说明DGGE变性梯度凝胶电泳系统包括内置式温度控制系统、可编程控电源、梯度凝胶生成器、内置式缓冲液循环泵及搅拌桨、电泳槽、梯度生成器、制胶配件及玻璃板等。
DGGE介绍：变性梯度凝胶电泳法（denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE）分析PCR产物，如果突变发生在最先解链的DNA区域，检出率可达100％，检测片段可达1kb，最适围为100bp-500bp。
基本原理基于当双链DNA 在变性梯度凝胶中进行到与DNA变性温度一致的凝胶位置时，DNA发生部分解链，电泳迁移率下降，当解链的DNA链中有一个碱基改变时，会在不同的时间发生解链，因影响电泳速度变化的程度而被分离。
由于变性梯度凝胶电泳法是利用温度和梯度凝胶迁移率来检测，需要一套专用的电泳装置，合成的PCR引物最好在5`末端加一段40bp-50bp的GC夹，以利于检测发生于高熔点区的突变。
DGGE原理：变性梯度凝胶电泳系统(denaturing gradient gel electrophoresis, DGGE)的原理是使用一对特异性引物，PCR扩增微生物自然群体的16s rRNA基因，产生长度相同但序列有异的DNA片段的混合物。
然后用变性梯度凝胶电泳分离产物混合物。
变性梯度凝胶电泳DGGE胶是在6％聚丙烯酰胺胶中添加线性梯度的变性剂，变性剂的浓度由上到下，从低到高成线性梯度。
在一定温度下，在同一浓度的变性剂浓度下，序列不同的产物，其部分解链程度也不同，而产物解链程度又直接影响其电泳迁移率，结果不同的产物在凝胶上分离开来。
在引物的5’端加上40个碱基左右的G-C串可使变性梯度凝胶电泳DGGE对序列差异的分辨率提高到近100％。
所以变性梯度凝胶电泳法可用于微生物群落结构的研究、微生物种群动态的分析、富集培养物及分离物的分析、核糖体RNA同源性的分析。
DGGE操作步骤
变性梯度凝胶电泳（DGGE）的溶液配制、操作步骤及注意事项一、实验试剂及配置1、40%丙烯酰胺/双丙烯酰胺（37.5：1）试剂用量丙烯酰胺38.93g双丙烯酰胺 1.07gMilliQ 水加到100mL 溶液采用0.45µm滤膜过滤，储存在4℃2、0％的变性储存液凝胶梯度6％8％10％12％40%丙烯酰胺/双丙烯酰胺15mL 20mL 25mL 30mL 50×TAE缓冲液2mL 2mL 2mL 2mL MilliQ 水83mL 78mL 73mL 68mL总容积100mL 100mL 100mL 100mL3、100％的变性储存液凝胶梯度6％8％10％12％40%丙烯酰胺/双丙烯酰胺15mL 20mL 25mL 30mL 50×TAE缓冲液2mL 2mL 2mL 2mL去离子甲酰胺40mL 40mL 40mL 40mL 尿素42g 42g 42g 42g MilliQ 水加到100mL 加到100mL 加到100mL 加到100mL4、50×TAE缓冲液试剂用量终浓度Tris碱242.0g 2M冰乙酸57.1 1M 0．5M EDTA，pH8.0 100.0mL 50mM MilliQ 水加到1000.0mL将溶液混合溶解，121℃下蒸汽灭菌20-30min,储存在室温5、银染液的配制:原液：8×固定液（250 ml）：乙醇200 ml冰乙酸10mlMilliQ 水40ml（A）：1×固定液（400 ml）：8×固定液50mlMilliQ 水350ml（B）银染溶液(400ml)：AgNO3 0.8 g8×固定液50mlMilliQ 水350ml（C）：显影剂（500ml）：NaOH 7.5gMilliQ 水500 ml甲醛 1.5ml6、10％过硫酸铵（AP）：过硫酸胺0.3g超纯水 3.0ml溶解后使用0.45µm微孔滤膜过滤，4℃保存，保存时间为1周。
(完整)PCR-DGGE技术
PCR-DGGE技术一、实验原理变性梯度凝胶电泳（denatured gradient gel electrophoresis，DGGE）最早是Lerman 等人于20 世纪80 年代初期发明的，起初主要用来检测DNA 片段中的点突变 .Muyzer 等人在1993 年首次将其应用于微生物群落结构研究。
后来又发展出其衍生技术,温度梯度凝胶电泳(TGGE）。
该技术被广泛用于微生物分子生态学研究的各个领域，目前已经发展成为研究微生物群落结构的主要分子生物学方法之一。
双链DNA分子在一般的聚丙烯酰胺凝胶电泳时，其迁移行为取决于其分子大小和电荷.不同长度的DNA片段能够被区分开，但同样长度的DNA片段在胶中的迁移行为一样,因此不能被区分.DGGE技术在一般的聚丙烯酰胺凝胶基础上，加入了变性剂（尿素和甲酰胺）梯度，从而能够把同样长度但序列不同的DNA片段区分开来。
一个特定的DNA片段有其特有的序列组成，其序列组成决定了其解链区域和解链行为。
一个几百个碱基对的DNA片段一般有几个解链区域，每个解链区域有一段连续的碱基组成。
当变性剂浓度逐渐增加达到其最低的解链区浓度时，该区域这一段连续的碱基对发生解链.当变性剂那浓度再升高依次达到其他解链区域浓度后，最高的解链区域也发生解链，从而双链DNA完全解链。
不同的双链DNA片段因为其序列组成不一样，所以其解链区域和解链区域的解链浓度也是不一样的。
当进行DGGE电泳时，一开始变性剂浓度比较小，不能使双链DNA片段最低的解链区域解链，此时DNA片段的迁移行为和在一般的聚丙烯酰胺凝胶中一样.然而一旦DNA片段迁移到一特定位置,其变性剂浓度刚好能使双链DNA片段最低的解链区域解链时，双链DNA片段最低的解链区域立即发生解链。
部分解链的DNA片段在胶中的迁移速率会急剧下降。
因此同样长度但序列不同的DNA片段会在胶中不同位置处达到各自最低解链区域的解链变性剂浓度,因此它们会在胶中不同的位置分开.然而，一旦变性剂浓度达到DNA片段最高的解链区域变性剂浓度时，DNA片段会完全解链，成为单链DNA分子,此时他们又能在胶中继续迁移.因此如果不同DNA片段的序列差异发生在最高的解链区域时，这些片段就不能被区分开来。
变性梯度凝胶电泳技术在微生物实验教学中的应用
物多样性的Ｄ Ｇ Ｇ Ｅ 检测结果的重要 因素 ， 学生通过 比较不 同提取 方 法对 Ｄ Ｎ Ａ 产量 和纯 度 的影 响 ，确 定 了针 对不 同的 实验样品（ 土壤或污泥 ） 的最佳提取方法 ， 在这一过程中加 深 了对Ｄ Ｎ Ａ 提取原理和方法的认识 。通过Ｄ Ｇ Ｇ Ｅ 图谱的分 析 ，学 生可 以直 观地 了解 到 污染胁 迫 等环 境 条件 下微 生物 群落结构的改变及优势菌群形成的动态过程 ，更加深刻地 理 解 富集 培养技 术 在分 离特 定功 能微 生物 上 的应 用 。学生 通 过后 续 的序列 比对分 析 ，可 以学 习到相 关环 境 中常 见 的 微 生物 优势 菌 属 ，特 别 是一 些非 培养微 生 物序 列 的 出现 丰 富 了学 生对 微 生物 多样 性 的认 识 。通 常 面 向本 科 生开 设 的
、
生物 以未可培养的形式存在。Ｄ Ｇ Ｇ Ｅ 是一种不依赖微生物 培养 技术 的研 究方 法 ，能快 速 、准确 鉴定 环 境 中微 生物 种 群 ，在揭 示复 杂微 生物 群落 演替 规律 和 功能 基 因多 样性 方 面具 有独 特 的优越 性 ，已被 广泛 应用 于微 生 物分 子 生态 学 研 究 各领 域闭 。Ｄ Ｇ Ｇ Ｅ 技 术的基 本 原理 是在 聚丙 烯酰 胺凝 胶
力、 动 手能 力有 着积 极 的作用 ＿ ｌ ＿ １ 】 。 本校 非 常重 视实 验教学 改 革工 作 ，鼓励 学 生在 掌握 基 本实验技能后 ， 积极参加设计性 、 研究性实验 ， 包括院校两 级 的大学 生科 研 立项 或教 师 的研究 课题 ，并 给 予相 应 的创 新学分。 通过 该项 措施 进 一步激 发 了学 生 的学 习兴趣 ， 并 有 效提 高 了学 生 的实 验技 能 及分 析 问 题 和解 决 问题 的能 力 。 目前 微 生 物 实验 教 学 主要 包括 传 统 的微 生 物 实验 技 术 ， 随 着分 子生 物技 术 的发 展 ， 微 生 物研究 技 术 突破 了 以往 主要
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4.平行变性梯度凝胶电泳
变性梯度递增的方向与电泳方向平行。根据垂直变性梯度凝胶电泳检测的解链区域的变性浓度,制备相应变性浓度的平行变性梯度凝胶,检测各标本是否存在突变。
PCR产物加上样缓冲液后,25μl~30μl/孔,电压150V,温度60℃,时间3~6小时。
实验材料
∙DNA样品
试剂、试剂盒
∙尿素
∙去离子甲酰胺
∙丙烯酰胺
∙甲叉双丙烯酰胺
∙琼脂糖
仪器、耗材
∙PCR扩增仪
∙变性梯度凝胶电泳仪
∙凝胶成像及分析系统
∙ห้องสมุดไป่ตู้外透射仪
∙高速离心机
∙电泳仪
∙电泳槽
∙微量加样器
∙Tip头
∙Tip头盒
∙Eppendorf管
∙Eppendorf管架
一、实验原理
变性梯度凝胶电泳(DGGE是一种根据DNA片段的熔解性质而使之分离的凝胶系统。核酸的双螺旋结构在一定条件下可以解链,称之为变性。核酸50%发生变性时的温度称为熔解温度(Tm。Tm值主要取决于DNA分子中GC含量的多少。DGGE将凝胶设置在双重变性条件下:温度50~60 ℃,变性剂0~100%。当一双链DNA片段通过一变性剂浓度呈梯度增加的凝胶时,此片段迁移至某一点变性剂浓度恰好相当于此段DNA的低熔点区的Tm值,此区便开始熔解,而高熔点区仍为双链。这种局部解链的DNA分子迁移率发生改变,达到分离的效果。Tm的改变依赖于DNA序列,即使一个碱基的替代就可引起Tm值的升高和降低。因此,DGGE可以检测DNA分子中的任何一种单碱基的替代、移码突变以及少于10个碱基的缺失突变。
为了提高DGGE的突变检出率,可以人为地加入一个高熔点区——GC夹。GC夹(GC clamp就是在一侧引物的5′端加上一个30~40bp的GC结构,这样在PCR产物的一侧可产生一个高熔点区,使相应的感兴趣的序列处于低熔点区而便于分析。因此,DGGE的突变检出率可提高到接近于100%。
作为一种突变检测技术,DGGE具有如下的优点:(1突变检出率高。DGGE的突变检出率为99%以上。(2检测片段长度可达1kb,尤其适用于100~500 bp的片段。(3非同位素性。DGGE不需同位素掺入,可避免同位素污染及对人体造成的伤害。(4操作简便、快速。DGGE一般在24小时内即可获得结果。(5重复性好。但是,该方法需要特殊的仪器,而且合成带GC夹的引物也比较昂贵。
5.染色5分钟,凝胶成像仪分析结果。
四、注意事项
1、该实验中提取DNA,以及DGGE操作中接触到得很多药品都有毒,还有致癌、变性等毒害,一定要严格操作,做好防护保护自己。
2、严格按操作步骤。
二、实验用品
1.PCR扩增仪;变性梯度凝胶电泳仪;凝胶成像及分析系统;紫外透射仪;高速离心机;电泳仪;电泳槽。
2.尿素、去离子甲酰胺、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、琼脂糖
3.微量加样器(200μl,20μl;Tip头(200μl,20μl。Tip头盒(200μl,2 0μl;Eppendorf管(0.5ml,0.2ml,Eppendorf管架。
4.PCR扩增相关试剂
三、实验步骤
1.PCR反应(同前
其中,上游引物加40bp [GC] Clamp。
2.PCR产物经琼脂糖凝胶电泳确认。
3.垂直变性梯度凝胶电泳
变性梯度递增的方向与电泳方向垂直。所使用的胶为6%聚丙烯酰胺凝胶,变性浓度为0~100%。其中,含7 M尿素和40%去离子甲酰胺的胶为100%变性,不含尿素和去离子甲酰胺的胶为0%变性。垂直变性梯度凝胶电泳主要是检测引物的最适解链条件(即变性浓度。
变性梯度凝胶电泳(DGGE是一种根据DNA片段的熔解性质而使之分离的凝胶系统。核酸的双螺旋结构在一定条件下可以解链,称之为变性。
核酸50%发生变性时的温度称为熔解温度(Tm。Tm值主要取决于DNA
分子中GC含量的多少。DGGE将凝胶设置在双重变性条件下:温度
50~60 ℃,变性剂0~100%。当一双链DNA片段通过一变性剂浓度呈梯度增加的凝胶时,此片段迁移至某一点变性剂浓度恰好相当于此段DNA
的低熔点区的Tm值,此区便开始熔解,而高熔点区仍为双链。这种局
部解链的DNA分子迁移率发生改变,达到分离的效果。Tm的改变依赖
于DNA序列,即使一个碱基的替代就可引起Tm值的升高和降低。因此, DGGE可以检测DNA分子中的任何一种单碱基的替代、移码突变以及少于10个碱基的缺失突变。
详细
实验方法
∙变性梯度凝胶电泳(DGGE