变性梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)new
变性梯度凝胶电泳精品PPT课件
的序列差异都能被区分开。
凝胶变性剂浓度梯度的确定
在分析微生物群落的 PCR 扩增产物时，一般 先要用垂直电泳来确定一个大概的变性剂范围
垂直电泳和水平电泳
A ：凝胶的变性梯度方向与电泳方向垂直。 B：左泳道，突变型等位基因；中，野生型等位基因；右，突变型与野生型等位基因
电泳时间的确定
一般采用时间间歇（timetravel）的方法，即 每隔一定时间加一次样品，从而使样品的电泳 时间有一个梯度，根据这个结果，确定最佳的 电泳时间
微生物生态学中应用的缺点
除了前面提到过的一些优缺点，分析微生物群落结构组 成是还存在以下缺点：
1、分析微生物群落结构组成时，有很多偏差。不同细菌 的基因组大小和核糖体 RNA 拷贝数不同；提取基因 组总 DNA 时细胞的裂解效率不同；DNA提取和纯化 时有偏差；PCR 扩增过程中有偏差。
2、DGGE一般只能分析 500 个碱基对以下的 DNA 片段， 因此得到的系统进化相关的信息就很少
PCR反应 16SrDNA 聚丙烯酰胺凝胶电泳 解链温度
解链温度
既使是很小的变化也会引起DNA片段Tm值 的改变，如单碱基替代可引起1.5℃的差异
DGGE 技术在一般的聚丙烯酰胺凝胶基础上， 加入了变性剂（尿素和甲酰胺）梯度，从而能 够把同样长度但序列不同的 DNA 片段区分开 来
根据以往经验，参考文献
染色方法的选择：
溴化乙啶（ethidium bromide, EB），SYBR Green I, SYBR Gold和银染法。
染色法的优缺点
EB 法染色的灵敏度最低，且致癌，但价廉。 SYBR Green I 和 SYBR Gold 相比 EB，能更
变性梯度凝胶电泳(DGGE)的研究进展
变性梯度凝胶电泳（DGGE）的研究进展【摘要】DGGE 技术是由Fischer等于1979年提出的一种用于检测DNA 突变的电泳技术[1]，之后Myers等首次在DGGE的引物中使用“GC夹子”，使得突变检出率大大提高，从而进一步完善了该技术。
1993年，Muyzer等将DGGE 技术应用于微生物的生态学研究，并且证实了该技术在研究自然界微生物群落的种群差异性和遗传多样性方面具有突出的优越性[2]。
与传统的菌种分离培养技术及生理生化指标检测相比，DGGE技术通过对微生物群落的核酸信息进行分析，能更准确、更快速的对菌群进行鉴定，同时可鉴定出自然状态下不可培养的菌株。
由于DGGE技术具有重现性高、可靠性强和高效快捷等优点[3]，现以用于微生物群落的复杂性分析、检测微生物种群动态变化、对比细菌的富集培养及分离培养、单基因组中rRNA的多样性分析、DNA提取方法比较等方面，在废水、海洋、森林、土壤等环境样品研究以及发酵工艺、植物内生真菌研究、种群演替规律研究等领域广泛应用。
【关键词】DGGE；微生态；纯培养1.DGGE技术的原理变性梯度凝胶电泳（DGGE）是根据小片段DNA分子（1kb以下）的熔解温度不同来分析DNA分子的多样性，理论上可以检测到单个碱基替换的DNA 分子。
DNA片段在丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于自身的物理性状，熔解状态的DNA分子片段在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移速度比双链DNA分子慢[4]。
当DNA片段处在变性剂浓度不断增加的凝胶系统中，随着电泳的迁移就会部分融化，达到一定变性剂浓度时DNA就会熔解为单链的分子，这些离散的碎片集中在一个比较狭窄的变形梯度范围内，这样不同的DNA分子在不同变性剂浓度下熔解，在整个电泳图谱中成楼梯式排列。
通过对比熔解状态下DNA片段的多态性，就可以推测有碱基突变或序列差异的DNA分子片段。
为了提高检出率可在DNA一端加入一个高熔点区—GC夹（GC clamp）；GC夹就是在一侧引物的5′端加上一个30～40bp的连续GC碱基，这样在PCR 产物的一侧可产生一个GC夹的高熔点区，从而使相应的部分序列处于低熔点区而便于检测分析；这样，DGGE的突变检出率可提高到接近于100%[4]。
变性梯度凝胶电泳
变性梯度凝胶电泳《变性梯度凝胶电泳》是一种有效的分离技术，它可以帮助科学家快速有效地分离不同类型的分子。
它和其他分离技术相比，有着独特的优势和不可替代的优势。
变性梯度凝胶电泳（DGGE）采用特殊的凝胶在不同变性环境中电泳，以有效地分离不同类型的DNA片段和蛋白质。
正常情况下，由于更多的低能量的片段的存在，特定的变性环境会吸引这些较低能量的片段，并且它们走的路程也会比较短，而其他高能量的片段则会走的路程会更长。
因此，将凝胶改变到一种低能量的片段可以吸引，而走得路程更长的片段，则可以有效地将这些片段分离开来。
DGGE的优点是它可以有效分离不同片段的DNA和蛋白质，并且可以更快地分离出更多的细小片段。
此外，由于DGGE有一个独特的低能量环境，它可以更好的区分不同的片段，而不会受到其他分离技术的限制。
另外，DGGE是一种半定量的分离技术，可以让研究者比较不同片段之间的相对含量。
除了上述优势，DGGE还具有一些缺点。
首先，由于梯度凝胶电泳系统搭建起来比较复杂，使用它来进行分离技术需要比较复杂的实验技术。
其次，由于梯度凝胶电泳系统比较复杂，对系统的调整和控制非常复杂，只有熟练的实验室人员才能处理好这些技术。
变性梯度凝胶电泳的应用非常广泛，它可以用来分离和分析不同类型的DNA片段和蛋白质，甚至可以用来检测细菌的抗药性。
它也可以用来研究基因的多样性，用于癌症和免疫系统的研究，以及对特定疾病的诊断。
最后，它也可以作为一种植物鉴定技术，用于比较不同植物类型间的分子差异。
总之，变性梯度凝胶电泳（DGGE）是一种有效的分离技术，它可以用于研究不同类型的DNA片段和蛋白质，还可以用于分析肿瘤细胞的分子结构，对特定疾病的诊断和植物鉴定。
它具有独特的低能量环境，可以更好的区分不同的片段，而不会受到其他分离技术的限制。
它具有快速、高效和半定量的优势，是研究DNA分子和蛋白质的有效分离技术。
变性梯度凝胶电泳
变性梯度凝胶电泳摘要：变性梯度凝胶电泳（DenaturingGradientGelE1ectrophoresiS，DGGE）是由Fisher 和Lerman发明用于检测DNA突变的技术，其主要是基于突变型和野生型棱酸序列的不同而导致其变性浓度的差异，利用变性梯度凝胶进行分离, 该手段分辨率达一个碱基。
恒定变性凝胶电泳(CDGE)、瞬时温度梯度电泳(TTGE)和温度梯度凝胶电泳(TGGE)是由DGGE经改进而成。
它们在突变分析上都有着重要的作用。
关键词：变性梯度凝胶电泳、恒定变性凝胶电泳、瞬时温度梯度电泳、温度梯度凝胶电泳1、前言：随着结构基因组计划接近尾声，人类基因神秘的面纱已逐步揭开，GenBank中已知基因的数目也与日俱增，各种遗传病的相关基因也了解得越来越多。
但是，在找到了候选基因后，还需要在相关的遗传病病人中进行突变检测，只有找到了相应的突变。
才能真正确定该基因与疾病的关系，从而服务于临床。
变性梯度凝胶电泳就是一种很有实用价值的突变分析方法。
该方法经改进，又发展出了恒定变性凝胶电泳(constant denaturant gel elec—trophoresis，CDGE)、瞬时温度梯度电泳(temporaltemperature gradient electrophoresis，TTGE)和温度梯度凝胶电泳(temperature gradient gel elec—trophoresis，TGGE)。
现在上述方法已经广泛应用于遗传病的诊断、突变分析和肿瘤相关基因的筛查等许多方面。
2、基本原理2.1变性梯度凝胶电泳由Fisher和Izrman口3于1983年创立，以后该技术和PCR技术相结合被广泛应用于各种突变分析。
它主要是利用梯度变性胶来分离DNA片段。
电泳开始时，DNA在胶中的迁移速率仅与分子太小有关，而一旦DNA泳动到某一点时，即到达该DNA变性浓度位置时，使得DNA双链开始分开，从而大大降低了迁移速率。
TGGE变性梯度凝胶电泳DGGE-Equl
变性梯度凝胶电泳（DGGE）和温度梯度凝胶电泳（TGGE）变性梯度凝胶电泳（DGGE）产品说明DGGE变性梯度凝胶电泳系统包括内置式温度控制系统、可编程控电源、梯度凝胶生成器、内置式缓冲液循环泵及搅拌桨、电泳槽、梯度生成器、制胶配件及玻璃板等。
DGGE介绍：变性梯度凝胶电泳法（denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE）分析PCR产物，如果突变发生在最先解链的DNA区域，检出率可达100％，检测片段可达1kb，最适围为100bp-500bp。
基本原理基于当双链DNA 在变性梯度凝胶中进行到与DNA变性温度一致的凝胶位置时，DNA发生部分解链，电泳迁移率下降，当解链的DNA链中有一个碱基改变时，会在不同的时间发生解链，因影响电泳速度变化的程度而被分离。
由于变性梯度凝胶电泳法是利用温度和梯度凝胶迁移率来检测，需要一套专用的电泳装置，合成的PCR引物最好在5`末端加一段40bp-50bp的GC夹，以利于检测发生于高熔点区的突变。
DGGE原理：变性梯度凝胶电泳系统(denaturing gradient gel electrophoresis, DGGE)的原理是使用一对特异性引物，PCR扩增微生物自然群体的16s rRNA基因，产生长度相同但序列有异的DNA片段的混合物。
然后用变性梯度凝胶电泳分离产物混合物。
变性梯度凝胶电泳DGGE胶是在6％聚丙烯酰胺胶中添加线性梯度的变性剂，变性剂的浓度由上到下，从低到高成线性梯度。
在一定温度下，在同一浓度的变性剂浓度下，序列不同的产物，其部分解链程度也不同，而产物解链程度又直接影响其电泳迁移率，结果不同的产物在凝胶上分离开来。
在引物的5’端加上40个碱基左右的G-C串可使变性梯度凝胶电泳DGGE对序列差异的分辨率提高到近100％。
所以变性梯度凝胶电泳法可用于微生物群落结构的研究、微生物种群动态的分析、富集培养物及分离物的分析、核糖体RNA同源性的分析。
DGGE操作步骤
变性梯度凝胶电泳（DGGE）的溶液配制、操作步骤及注意事项一、实验试剂及配置1、40%丙烯酰胺/双丙烯酰胺（37.5：1）试剂用量丙烯酰胺38.93g双丙烯酰胺 1.07gMilliQ 水加到100mL 溶液采用0.45µm滤膜过滤，储存在4℃2、0％的变性储存液凝胶梯度6％8％10％12％40%丙烯酰胺/双丙烯酰胺15mL 20mL 25mL 30mL 50×TAE缓冲液2mL 2mL 2mL 2mL MilliQ 水83mL 78mL 73mL 68mL总容积100mL 100mL 100mL 100mL3、100％的变性储存液凝胶梯度6％8％10％12％40%丙烯酰胺/双丙烯酰胺15mL 20mL 25mL 30mL 50×TAE缓冲液2mL 2mL 2mL 2mL去离子甲酰胺40mL 40mL 40mL 40mL 尿素42g 42g 42g 42g MilliQ 水加到100mL 加到100mL 加到100mL 加到100mL4、50×TAE缓冲液试剂用量终浓度Tris碱242.0g 2M冰乙酸57.1 1M 0．5M EDTA，pH8.0 100.0mL 50mM MilliQ 水加到1000.0mL将溶液混合溶解，121℃下蒸汽灭菌20-30min,储存在室温5、银染液的配制:原液：8×固定液（250 ml）：乙醇200 ml冰乙酸10mlMilliQ 水40ml（A）：1×固定液（400 ml）：8×固定液50mlMilliQ 水350ml（B）银染溶液(400ml)：AgNO3 0.8 g8×固定液50mlMilliQ 水350ml（C）：显影剂（500ml）：NaOH 7.5gMilliQ 水500 ml甲醛 1.5ml6、10％过硫酸铵（AP）：过硫酸胺0.3g超纯水 3.0ml溶解后使用0.45µm微孔滤膜过滤，4℃保存，保存时间为1周。
实验4 变性梯度凝胶电泳(DGGE)和温度梯度凝胶电泳(TGGE)
Y-fitting
tube 2. 共有三根聚乙烯细管，其中两根较长的为15.5cm， 短的那根长9cm。 将短的那根与Y形管相连， 两根长的则与小套管相连，并连在30ml的注射器上。
Level attachment screw Syringe sleeve
tube
Plunger cap screw
如何确定变性剂（温度）梯度
垂直胶 水平胶
如何确定最佳电泳时间
时间间歇(time travel)
样品前处理
去除单链DNA污染（single-stranded DNA, ssDNA)
优化PCR反应条件和 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（d-PAGE）纯化 1 2 3 4 1 2 3 4 Mung bean nuclease digestion
双链DNA分子在一般的聚丙烯酰胺凝胶电泳时，其迁 移行为决定于其分子大小和电荷。不同长度的DNA片 段能够被区分开，但同样长度的DNA片段在胶中的迁 移行为一样，因此不能被区分。 DGGE/TGGE技术在一般的聚丙烯酰胺凝胶基础上，加 入了变性剂（尿素和甲酰胺）梯度或是温度梯度，从 而能够把同样长度但序列不同的DNA片段区分开来。
SYBR Green I
1. 拨开一块玻璃板，将胶（带着一块玻璃板）放入一 容器中。 2. 取2 ul SYBR Green I，稀释20000倍至20 ml，均匀 涂于胶上。 3. 染色40分钟，紫外灯下照相。
原理
变性梯度凝胶电泳（denatured gradient gel electrophoresis，DGGE）最初是Lerman等人于20世纪 80年代初期发明的，起初主要用来检测DNA片段中的 点突变。 Muyzer等人在1993年首次将其应用于微生物群落结构 研究。后来又发展出其衍生技术，温度梯度凝胶电泳 （temperature gradient gel electrophoresis， TGGE）。此后十年间，该技术被广泛用于微生物分子 生态学研究的各个领域，目前已经发展成为研究微生 物群落结构的主要分子生物学方法之一。
变性梯度凝胶电泳DGGE实验报告
变性梯度凝胶电泳DGGE刘琳 1131428 环境科学一、 实验目的1． 学习掌握变性梯度凝胶电泳的原理和方法。
2． 练习变性梯度凝胶电泳的操作步骤。
3． 分析并掌握变性梯度凝胶电泳的思路，并了解其在微生物群落研究中的地位。
二、 实验原理双链DNA 分子在一般的聚丙烯酰胺凝胶电泳时，其迁移行为决定于其分子大小和电荷。
不同长度的DNA 片段能够被区分开，但同样长度的DNA 片段在凝胶中的迁移行为一样，因此不能被区分。
DGGE 技术在一般的聚丙烯酰胺凝胶基础上，加入了变性剂（尿素和甲酰胺）梯度，从而能够把同样长度但序列不同的DNA 片段区分开来。
不同的双链DNA 片段因为其序列组成不一样，所以其解链区域及各解链区域的解链温度也是不一样的。
同样长度但序列不同的DNA 片段会在胶中不同位置处达到各自最低解链区域的解链温度，因此它们会在胶中的不同位置处发生部分解链导致迁移速率大大下降，从而在胶中被区分开来。
然而，一旦温度（或变性剂浓度）达到DNA 片段最高的解链区域温度时，DNA 片段会完全解链，成为单链DNA分子，此时它们又能在胶中继续迁移。
因此，如果不同DNA 片段的序列差异发生在最高的解链区域时，这些片段就不能被区分开来。
DNA 片段在DGGE 胶中的迁移行为（如下图）：变性剂LowHigh在DNA 片段的一端加入一段富含GC 的DNA 片段（一般30-50个碱基对），使DNA 片段最高的解链区域在GC 夹子这一段序列处，它的解链温度很高，可以防止DNA 片段在DGGE/TGGE 胶中完全解链。
当加了GC 夹子后，DNA 片段中基本上每个碱基处的序列差异都能被区分开（Myers, 1985)。
DGGE 有两种电泳形式：垂直电泳和水平电泳。
垂直电泳是为了确定变性剂梯度；而水平电泳则是对比分析不同样品的微生物差异。
本次试验做的是水平电泳，主要对比分析不同样品的微生物差异。
三、 实验器材与药剂器材：DGGE system (D-Code, Bio-Rad)、移液管、移液枪、枪头、制胶设备、30ml 针筒、聚乙烯细管、电泳仪试剂：16s rDNA V3区PCR 扩增产物、胶浓度为8%变性剂浓度分别为0%和90%丙烯酰胺胶、50×TAE buffer、去离子甲酰胺、尿素、去离子水、10%过硫酸铵(Aps)、TEMED 、sDNA 染料 变性剂Low high四、实验步骤1．首先按照实验要求将50x TAE buffer稀释为1×TAE buffer，并利用90%和0%的变性胶分别配置15.5ml的35%和55%的变性胶溶液。
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环境样品基因组DNA的提取 环境样品基因组DNA的提取 DNA 目标片段的PCR扩增 目标片段的PCR扩增 PCR
电泳前准备工作
DGGE 分析
图像的采集和条带的回收
电泳分析 剥胶、 ห้องสมุดไป่ตู้胶、染色
DGGE条带测序 条带测序
DGGE图谱的分析 DGGE图谱的分析
总DNA的提取是DGGE研究微生物群落的基础。适合 的DNA提取方法对环境样品微生物群落结构分析非常 重要。 适合DNA提取方法的考量：①DNA的得率。②能否 进行PCR扩增以及扩增的重复性。③制备DNA花费时 间的长短。 关于DNA提取的建议： 关于DNA提取的建议： DNA提取的建议 优先考虑基于原位裂解的方法， 优先考虑基于原位裂解的方法，根据实际情况采用 酶解/酚氯仿抽提法，或者DNA提取试剂盒（ DNA提取试剂盒 酶解/酚氯仿抽提法，或者DNA提取试剂盒（建议购 Qiagen公司相关产品 公司相关产品） 买Qiagen公司相关产品） 。
DGGE图谱的聚类分析、 DGGE图谱的聚类分析、相似性分析 图谱的聚类分析
Br+CSM
CSM
Br+sCSM
用Quantity One（Bio-Rad，USA）软件对DGGE图谱 进行数字化处理。按照如下公式计算多样性指数 （Shannon-Wiener index）
其中，s代表每泳道中的条带数量；Pi为泳道中第i条带灰 度（height of the peak）占该泳道总灰度的比例。 菌群均匀度（evenness，E）：E=H′/H′max， H′max=ln S
选择适合的目标片段， 设计合适的引物，注意 有GC夹子情况下引物 二聚体的行程。 环境样品目标片段的扩 增最好采用Touch down PCR。 注意PCR的环境，V3区 产物扩增极易污染。
细节决定成败！ 细节决定成败！
从这一步开始，带上手套。 从这一步开始，带上手套。 配置试剂时一定要用去离子水，可以配置不同梯度的变 性溶液备用，注意变形溶液中大颗粒的过滤及脱气。 制胶洗膜时用的各个容器要用去离子水洗涤干净，以防 止氯离子污染。 灌胶前准备好所有需要的东西，试剂、枪头，甚至物品 摆放的位置。 制胶是实验的关键，在往玻璃板中灌胶时要匀速地转动 滑轮，将凝胶液匀速地灌入玻璃板。 灌胶后立刻清洗注射器，以防丙烯酰胺凝固，堵塞管子。
变性梯度凝胶电泳（DGGE）: 一种分离相似大小DNA片段 的电泳方法。即双链DNA在变性剂(如尿素或甲酰胺)浓度或 温度梯度增高的凝胶中电泳，随变性剂浓度升高，由于Tm 值不同，DNA的某些区域解链，降低其电泳泳动性，导致 迁移率下降，从而达到分离不同片段的目的。 由于各类微生物（如细菌和古细菌）的16sRNA基因序 列中可变区的碱基顺序有很大的差异，其中不同土壤微生 物的16sRNA基因的V3区扩增的DNA片断在DGGE中的应用最为 广泛，根据电泳条带的多寡和条带的位置可以初步辨别出 样品中微生物的种类多少，粗略分析土壤样品中微生物的 多样性。
停止电泳后注意把电泳仪调 零之后在关闭电源 剥胶需要细致，用好去离子 水和保鲜膜。 染色前做好胶样品顺序的标 记。 银染、EB染色和 SYBRGreen染色。
——垂直电泳
获得高质量的DGGE图谱。 获得高质量的DGGE图谱。 DGGE图谱 DGGE条带的回收 DGGE条带的回收 －－注意紫外条件下操作的安全。 －－尽量减少DNA在紫外下的照射时间。 －－不同长度目标片段从切胶条带中的回收。 测序注意要点 －－回收条带的DNA在PCR扩增后，一定要克隆 －－确认克隆与母条带可以跑到同一个位置后，再送 去测序 －－每个条带至少测3个克隆
2011年 2011年9月X日
变性梯度凝胶电泳(denatured gradient gel electrophoresis，DGGE)最初是Lerman 等人于20 世 纪80 年代初期发明的，起初主要用来检测DNA 片 段中的点突变。Muyzer 等人在1993 年首次将其应 用于微生物群落结构研究 。后来又发展出其衍生技 术，温度梯度凝胶电泳（temperature gradient gel electrophoresis，TGGE）。此后十年间，该技术被 广泛用于微生物分子生态学研究的各个领域，目前 已经发展成为研究微生物群落结构的主要分子生物 学方法之一。
Quantity one的应用 的应用 问题和讨论
DGGE制胶主体部件： DGGE制胶主体部件：
上样的胶孔要用去离子水冲洗干净并吸干。 PAGE胶装入电泳支架时注意用去离子水润滑橡胶垫。 装入后在胶孔中加入缓冲液。 上样时上样器要深入胶孔底部。 尽量在同一个胶上比较所有样品，每一个胶上要有 marker lane。 将胶放入电泳槽中时注意正负极。 建议低电压电泳一段时间，在样品完全进入胶中之 后再升电压。