布鲁菌多位点可变数目串联重复序列分析的分型研究论文
DNA数目可变串联重复序列用于结核分枝杆菌分型研究
DNA数目可变串联重复序列用于结核分枝杆菌分型研究阚晓宏;唐婧;万康林;金玉莲;刘敬华;杨建安;刘志广;丁虹;赵秀琴;王庆【期刊名称】《中国防痨杂志》【年(卷),期】2005(027)002【摘要】目的采用数目可变串联重复序列(VNTR)分型方法对安徽省的52株结核分枝杆菌进行分子分型研究,探讨该方法用于结核分枝杆菌分型的作用.方法设计引物,采用PCR和琼脂糖凝胶电泳技术对结核分枝杆菌13个VNTR位点进行检测,并通过BioNumerics 3.0软件进行DNA指纹图谱多态性分析.结果 52株结核分枝杆菌可分4个类别,其中88.5%菌株属于一个型,其他3个型所占比例很小,分别为5.8%、3.8%和1.9%.结论来自安徽的结核分枝杆菌存在主要的流行型,VNTR分型技术简便、快速,是较好的结核分枝杆菌分型方法.【总页数】5页(P77-81)【作者】阚晓宏;唐婧;万康林;金玉莲;刘敬华;杨建安;刘志广;丁虹;赵秀琴;王庆【作者单位】安徽省结核病防治研究所,合肥,230022;安徽省结核病防治研究所,合肥,230022;中国疾病预防控制中心传染病预防控制所,北京,102206;安徽省结核病防治研究所,合肥,230022;中国疾病预防控制中心传染病预防控制所,北京,102206;安徽省结核病防治研究所,合肥,230022;中国疾病预防控制中心传染病预防控制所,北京,102206;安徽省结核病防治研究所,合肥,230022;中国疾病预防控制中心传染病预防控制所,北京,102206;安徽省结核病防治研究所,合肥,230022【正文语种】中文【中图分类】R378.911【相关文献】1.不同可变数目串联重复序列组合对中国流行结核分枝杆菌分辨力的评价研究 [J], 陈海霞;李卫民;蔡超;刘静仪;张治国;原梅;贾俊楠;孙照刚;黄海荣;高基民2.可变数目串联重复序列在上海崇明岛地区结核分枝杆菌北京基因型菌株微进化研究中的应用 [J], 乔可;王辉;杨崇广;罗涛;梅建;高谦3.不同可变数目串联重复序列组合对中国流行结核分枝杆菌分辨力的评价研究 [J], 陈海霞;蔡超;刘静仪;张治国;原梅;贾俊楠;孙照刚;黄海荣;高基民;李卫民;;;;;;;;;;;;;;4.数目可变串联重复序列分子指纹分型法鉴定北京基因型结核分枝杆菌 [J], 金嘉琳;姜昕;翁心华;胡忠义;张文宏5.数目可变串联重复序列用于江苏省168株结核分枝杆菌菌株的基因分型研究 [J], 许卫国;虞浩;杨丹丹;吕华坤;周扬因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
布鲁氏菌分离株MLVA分子分型鉴定
M LVA 技 术 具 有 高 分辨率和高通量特 点，能够区分同种 分离株之间的微小 差异，适用于大规 模流行病学调查和 溯源分析。
M LVA 技 术 可 以 提 供关于布鲁氏菌 流行病学和传播 途径的宝贵信息， 对于布鲁氏菌病 的防控和监测具 有重要意义。
提取DNA
扩增VNTR基因
电泳分离
数据分析
难度和误差率
新技术应用：随着基因组学和生物信息学的发展，将会有更高效、准确的鉴定方法出现。
标准化和普及化：MLVA技术有望在未来得到更广泛的应用和标准化，提高不同实验室之间的可 比性。
交叉学科融合：将MLVA技术与免疫学、流行病学等学科相结合，有望为布鲁氏菌病的防控和治 疗提供更多有价值的信息。
监测目的：了解布鲁氏菌病的流行 情况，为防控措施提供依据
监 测 方 法 ： 采 用MLVA分 子 分 型 鉴 定技术，对布鲁氏菌分离株进行分 型鉴定
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监测对象：某动物种群，如牛、羊 等
结 果 分 析 ： 通 过 MLVA分 子 分 型 鉴 定 技 术，成功分离出布鲁氏菌分离株并进 行分型鉴定，为防控措施提供科学依 据
● 实 验操 作步 骤： a . 采集样本并 进行 预处 理； b. 提 取DNA； c. 进行MLVA分子分型 鉴定 ； d. 分析 数据 并得 出结论 。
● a. 采集样本并进行预处理； ● b . 提 取DNA； ● c . 进 行MLVA分 子 分 型 鉴 定 ； ● d. 分析数据并得出结论。
实验室名称：某实验室 鉴 定 方 法 ：MLVA分 子 分 型 鉴 定 鉴 定 过 程 ： 分 离 株 培 养 、DNA提 取 、 PCR扩 增 、 凝 胶 电 泳 等 结 果 分 析 ： 通 过 与 标 准 序 列 比 对 ， 确 定 分 离 株 的MLVA类 型
利用多重聚合酶链反应和多色毛细管电泳分析布氏菌多位点可变数目串联重复序列
利用多重聚合酶链反应和多色毛细管电泳分析布氏菌多位点可变数目串联重复序列姜海;荣蓉;田国忠;赵娜;赵鸿雁;朴东日;赵赤鸿;崔步云【摘要】目的传统的布鲁氏菌多点可变数目串联重复序列分析方法涉及16个位点(MLVA-16),包括单重聚合酶链反应和琼脂糖凝胶电泳,一直以来都作为标准的基因分型方法,用于布病的病原监测和流行病学调查.然而,目前这种传统方法工作量较大,实验室间结果不宜比较;尤其是对大规模菌株进行基因分型或面临突发疫情时,急需一种高通量且快速的方法.方法用多重PCR和多色毛细管电泳方法建立一种可靠的,高通量的且自动化程度较高的MLVA-16改良分型系统,用82株菌进行测试.结果这种改良的MLVA-16分型系统具有很高的准确性,且具有快速和高通量的特点.结论改良的MLVA-16分型系统可用于基层布病实验室,为布病的病原监测提供高效的工具.【期刊名称】《中国人兽共患病学报》【年(卷),期】2015(031)004【总页数】8页(P303-310)【关键词】多重PCR;多色毛细管电泳;布鲁氏菌;基因分型【作者】姜海;荣蓉;田国忠;赵娜;赵鸿雁;朴东日;赵赤鸿;崔步云【作者单位】中国疾病预防控制中心传染病预防控制所,传染病预防控制围家重点实验室,感染性疾病协同诊治协同创新中心,北京102206;中国疾病预防控制中心,北京 102206;中国疾病预防控制中心传染病预防控制所,传染病预防控制围家重点实验室,感染性疾病协同诊治协同创新中心,北京102206;中国疾病预防控制中心传染病预防控制所,传染病预防控制围家重点实验室,感染性疾病协同诊治协同创新中心,北京102206;中国疾病预防控制中心传染病预防控制所,传染病预防控制围家重点实验室,感染性疾病协同诊治协同创新中心,北京102206;中国疾病预防控制中心传染病预防控制所,传染病预防控制围家重点实验室,感染性疾病协同诊治协同创新中心,北京102206;中国疾病预防控制中心,北京 102206;中国疾病预防控制中心传染病预防控制所,传染病预防控制围家重点实验室,感染性疾病协同诊治协同创新中心,北京102206【正文语种】中文【中图分类】R378.5布氏菌病(布病)是由布氏菌属细菌侵人机体后引起传染—变态反应性人兽共患的传染病[1-2]。
04多位点VNTR分析
多位点VNTR分析多位点VNTR分析（MLVA）是一种基于串联重复序列可变拷贝数（VNTR）对微生物分离株进行亚型分型的分子分型方法。
即使在高度相关的细菌菌株中，VNTR通常表现出大拷贝数目的不同。
对于一组选定的串联重复序列，拷贝数分析揭示了微观进化关系。
在实践中，选择的VNTR位点对于所研究的生物具有足够的互补性，并且在每个VNTR的串联重复序列外设计保守引物。
因此，每个PCR-扩增子的碱基对的大小是串联重复序列的大小加上两端的偏移的总和。
出于经济原因，有时会合并多个VNTR，即用相同的染料标记它们并以混合物的形式装入毛细管测序仪的同一列中。
条件是混合的VNTR PCR产物的大小范围不重叠。
例如，使用4种染料和2种不重叠的VNTR，每个毛细管电泳可以确定6种VNTR（一种染料包含用于大小计算的参考marker）。
Bionumerics中MLVA分析BioNumerics软件提供了用于多位点VNTR分析的全自动工作流程，该流程从原始毛细测序仪图谱文件或预处理峰表（Applied Biosystems和Beckman）开始。
最初必须在数据库中输入MLVA设置。
这涉及进入样品池的规则：样品池是在同一毛细管中一起加载的VNTR扩增产物的混合物。
这包括使用的不同染料以及（可选）具有不重叠大小范围的兼容VNTR。
因此，每个VNTR由池、染料和（可选）大小范围定义。
大小范围由重复长度、偏移量和复制范围定义。
因此，该软件确切知道应在哪个大小范围内查找特定的VNTR。
请注意，复制范围仅在不同的VNTR与同一染料合并的情况下才是必需的。
如果是原始色谱图文件（AB，Beckman），则该软件可以使用用户定义的解析字符串从文件名自动解析池、染料和菌株信息。
对于GeneMapper或Beckman峰表文件，将从制表符分隔的峰表中自动解析此信息（请参见下面的示例）。
稳健而可靠的方法，与仪器类型无关由于仪器、染料和毛细管柱的不同，根据拷贝数测得的VNTR扩增子大小通常与理论大小有所不同。
布鲁菌多位点可变数目串联重复序列分析的分型研究重点
Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｄ
Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ，Ｂｅｒｉｎｇ １０２２０６，Ｃｈｉｎａ｛Ｃｕｉ ＢＹ，Ｊｉａｎｇ Ｈ）
Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ａｕｔｈｏｒ：Ｊｉａｎｇ
Ｈａｌ，Ｅｍａｉｌ：ｊｉａｎｇｈａｉ＠ｉｃｄｃ．ｃａ
Ｔｏ ａｎａｌｙｚｅ ｔｈｅ ｇｅｎｏｔｙｐｅｓ ｏｆ Ｂｒｕｃｅｌｌａ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｉｎ Ｓｈａｎｘｉ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ ｕｓｉｎｇ ｍｕｌｔｉｐｌｅ
ＤＯＩ：１０．３７６０／ｅｍａ．ｊ．ｉｓｓｎ．２０９５—４２５５．２０１６．０４．００４
【摘要】
目的采用多位点可变数目串联重复序列分析（ＭＬＶＡ）方法对山西省分离的布鲁菌进行基因型
分析。方法２０１２、２０１３年，在山西省布鲁菌病（简称布病）监测点，采集已确诊的布病患者血液，进行血培养． 对培养出的布鲁菌进行传统的生物分型鉴定。选取ＭＬＶＡ的１６个位点［分为２组：ｐａｎｅｌ
１。
ａｎａｌｙｓｉｓ，ＭＬＶＡ）Ⅲ，是近
年发展起来的以ＰＣＲ为基础，根据被检菌株散在 于基因组中不同位点的可变数量串联重复序列
（ｖａｒｉａｂｌｅ ｎｕｍｂｅｒ ｔａｎｄｅｍ ｒｅｐｅａｔ，ＶＮＴＲ）的重复单元
拷贝数的差异来进行分子分型的技术，是近年新出 现的对细菌菌株之间的基因关系进行评价的方法。 为了对山西省布鲁菌感染情况的分子流行病学进 行更有效的分析，作者通过ＭＬＶＡ技术对山西省 ２０１２、２０１３年来分离的４７株布鲁菌的基因分型进 行了比较研究。 １对象与方法 １．１布鲁菌：从山西省布病监测点收集布病确诊病 例，采集患者静脉血５ ｍｌ，注入双相培养瓶中培养， 发现有菌生长后采用传统生物学方法进行分离鉴 定陇。参照标准菌株做血清凝集试验。硫堇、复红染 料抑菌试验，硫化氢（Ｈ２ｓ）产生试验及生物噬菌体 分型鉴定。 １．２主要试剂与仪器：血清及噬菌体由中国疾病预 防控制中心传染病所布病室提供：全基因组核酸提 取试剂盒购自德国ＱＩＡＧＥＮ公司：ＭＬＶＡ引物由上 海生工生物工程股份有限公司合成。微卫星测序由 北京天一辉远生物科技有限公司完成。２７２０型ＰＣＲ 热循环仪购自美国ＡＢ公司。
布鲁氏菌感染的分子诊断技术研究
布鲁氏菌感染的分子诊断技术研究布鲁氏菌感染是一种由布鲁氏菌引起的人畜共患传染病，其临床表现多样化，包括发热、关节炎、淋巴结肿大等症状。
为了准确快速诊断布鲁氏菌感染，研究人员们不断努力探索新的分子诊断技术。
本文将介绍目前在布鲁氏菌感染的分子诊断技术研究方面所取得的进展。
一、PCR技术在布鲁氏菌感染的诊断中的应用PCR技术（聚合酶链式反应）是一种基于DNA复制的技术，能够快速、敏感地检测布鲁氏菌的DNA。
研究人员使用PCR技术可以在患者的血液、尿液、关节液等样本中检测到布鲁氏菌的存在。
此外，研究人员还通过PCR技术鉴定了布鲁氏菌不同菌株之间的遗传变异，从而为疫情监测和菌株溯源提供了重要依据。
二、基因芯片技术在布鲁氏菌感染的诊断中的应用基因芯片技术是一种高通量并行检测方法，可以同时检测成千上万个靶基因。
研究人员通过设计布鲁氏菌相关基因的探针，运用基因芯片技术可以快速、高效地筛选出布鲁氏菌感染的标志性基因。
利用这些标志性基因，检测人员可以快速鉴定布鲁氏菌感染患者，并区分其感染类型和菌株特征。
三、下一代测序技术在布鲁氏菌感染的诊断中的应用下一代测序技术是一种高通量测序技术，可以在较短的时间内获取大量的DNA或RNA序列。
研究人员利用下一代测序技术对布鲁氏菌的基因组进行测序和分析，从中鉴定出与布鲁氏菌感染相关的基因和代谢途径。
这些信息将有助于理解布鲁氏菌的致病机制，并为研制新的靶向治疗和预防措施提供理论依据。
四、蛋白质芯片技术在布鲁氏菌感染的诊断中的应用蛋白质芯片技术是一种快速筛选和定量大规模蛋白质的方法，能够帮助研究人员发现与布鲁氏菌感染相关的蛋白质标志物。
这些标志物可以作为诊断试剂盒中的生物标记物，用于布鲁氏菌感染的快速诊断。
此外，蛋白质芯片技术还可用于研究感染机制、药物筛选和疫苗研发等方面。
总结：布鲁氏菌感染的分子诊断技术研究已经取得了显著进展。
PCR技术、基因芯片技术、下一代测序技术和蛋白质芯片技术的应用为布鲁氏菌感染的准确快速诊断提供了有力支持。
肠道病原菌的分子分型研究方法进展
ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ，ＡＦＬＰ）是由荷兰科学家Ｚｅｂｅａｎ
ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｆｒａｇ－
和Ｖｏｓ于１９９２年发明的一种检测ＤＮＡ多态性的新
方法，当时被称为ＳＲＦＡ（Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ
ｍｅｎｔ
行分型，分型率达１００％，分型结果显示存在８３个 ∥口Ａ型，其中空肠弯曲菌６７个型，结肠弯曲菌１７个
型，基本弄清了空肠和结肠弯曲菌．，ｚ口Ａ的ＰＣＲ－ ＲＦＬＰ型在美国的分布情况，有１４株血清不能分型 的菌株，可以用ｊａａＡ分型。 由于ＰＣＲ特异性位点ＲＦＬＰ所检测的细菌基因 区域有限，该方法的分辨力不如其它方法。 ８质粒图谱分析 质粒图谱通过分析细菌所携带的不同分子量大 小的质粒，经琼脂糖凝胶电泳，形成不同条带图谱， 据此对细菌进行鉴定分型。由于同源菌株所携带的
ａｎＭｙｍｓ，ＭＬＶＡ）。该方法简便快速，只需进行简单 的ＰＣＲ扩增和琼脂糖凝胶电泳，且对ＤＮＡ的质量 要求不高，重复性与特异性好，结果数字化，便于实 验室问进行结果比较。
万方数据
邀生堑堂鱼瘥堂选星２Ｑ！Ｑ生筮三！鲞筮２塑里蝼地丛堡婴塾丛！翌婴磐！！丛型至Ｑ！Ｑ：！生：兰墨№：兰 ＲＡＰＤ用于食源性致病菌的分子分型可以得到较为 理想的分型结果。 ＲＡＰＤ分型方法快速、成本低、操作简单，但是 可重复性差，不易于分析比较。而且对实验结果的 解释具有很大的主观性ｍ Ｊ。导致重复性差的原因 目前尚不确定，还要进行传染源鉴定溯源等工作。为此，在临 床检测和科学研究过程中，建立方便可行、分型力强
与分辨率高、重复性好的分型方法尤为重要。 根据病原体的表型特征，可进行生物分型、血清
亲缘关系、及时查明食物中毒暴发流行的传染源，可
作为致病菌分型的有效工具，对有效控制疫情的蔓 延有重要作用，对传染病的流行病学研究同样具有 重要意义，被誉为细菌分子分型技术的“金标准”。 １９９６年起，美国疾病预防控制中心建立起以
北方某地区牛布鲁菌病流行病学调查及布鲁菌多重pcr检测方法的建立
摘要为了解北方某地区牛群中布鲁菌病的疫情，采取更为有效的防控措施，本文利用虎红平板凝集试验（RBT）、试管凝集试验（SA T）和间接酶联免疫吸附试验（I-ELISA）随机对该地区牧场及散养牛群进行了布鲁菌病流行病学调查，同时对以上三种方法的检测水平进行了比较；根据GenBank已发表的布鲁菌基因序列计合成三对特异性引物，建立了同时检测布鲁菌属及牛、羊种布鲁菌的诊断鉴别性多重PCR方法，并对其进行了初步应用。
用上述三种方法随机对北方某地区牧场和散养牛的950份血清进行布鲁菌病血清抗体检测，表明该地区布鲁菌病流行情况较为严重，但不同群体阳性率差异较大，牧场阳性率最高达50%，最低阳性率仅为4.6%，种牛场未检出阳性血清，散养奶牛阳性率为39.3%；RBT检出阳性血清105份，阳性率为15.8%，SA T检出阳性血清128份，阳性率为19.2%，I-ELISA检出阳性血清262份，阳性率为27.6%，结果表明I-ELISA阳性率最高，SA T次之，RBT最低。
所建立多重PCR方法的敏感性可达100pg左右，且具有很好的特异性与重复性，对7株参考株葡萄球菌26001等的PCR扩增均为阴性，初步临床样品应用表明该方法可用于乳样、阴道及粪便棉拭的检测。
关键词：布鲁菌病；流行病学调查；多重PCR；应用Bovine Brucellosis Serological Investigation in a Region of North China and Formation of Multi-PCR Detecting for BrucellosisAbstactTo understand the situation of brucellosis in a region of north China and apply the more effective precautions, this study applied epidemiological survey stochastically in the grazing farms and distributive cattle groups in this region, using Rose Bengal Precipitation Test(RBT),Serum Agglutination Test(SA T) and Indirect Enzyme Linked Immunosorbent Assay(I-ELISA), and compared the three experiments, respectively. Based on the brucellosis gene sequence published on GenBank, specialized primer was synthesized, multi-PCR identification and diagnosis of Brucella and brucellosis on cows and sheep were established and primary application test was already conducted.Stochastically using the three methods above, 950 serum samples from the grazing farms and distributive cattle groups in a region of north China were inspected. Results showed that the epidemic situation of brucellosis is relatively serious. However, positive rates greatly vary among groups with the highest 50% and the lowest 4.6% in the grazing farms and no brucellosis were found in the breeding bull farms and the positive rate in distributive cattle groups was 39.3%; RBT tested 105 serum samples and the positive rate is 15.8%; SA T tested 128 serum samples and the positive rate was 19.2%; I-ELISA tested 262 serum samples and the positive rate was 27.6%. Results show the I-ELISA enjoys the greatest positive rate, higher than SA T and RBT. RBT ranks as the last.The sensitivity of multi-PCR could reach approximately 100pg, possessing excellent specificity and repeatability. PCR amplification of 7 staphylococcus samples appeared negative. Primary clinical sample applications indicate this method could be used for dairy samples, vagina and excrement cotton swab test.Key Words: Brucellosis; Epidemiological survey; Multi-PCR; ApplicationDirected by: Prof. XininigenApplicant for Master degree：Yun Tao(preventive veterinary science)(College of Veterinary Medicine.Inner Mongolia Agricultural University. Huhhot 010018. China)目录1 引言 (1)1.1 布鲁菌病概述 (1)1.2 病原学 (1)1.2.1 形态特征 (1)1.2.2 生长及培养特性 (1)1.2.3 种属分型 (2)1.2.4 分子生物学特征 (2)1.2.5 抗原结构 (2)1.2.6 变异性 (2)1.2.7 抵抗力 (3)1.2.8 致病性与感染机制 (3)1.3 流行病学 (4)1.4 临床症状 (5)1.5 诊断方法 (5)1.5.1 病原学诊断 (5)1.5.2 免疫学诊断 (6)1.5.3 分子生物学诊断 (8)1.6 布鲁菌病疫苗 (10)1.6.1 弱毒苗 (10)1.6.2 灭活疫苗 (11)1.6.3 新型疫苗 (12)1.7 本研究的目的意义 (12)2 实验一：北方某地区牛布鲁菌病血清学调查 (13)2.1 材料 (13)2.1.1 被检血清 (13)2.1.2 主要试剂 (13)2.1.3 主要设备 (13)2.2 血清学检测 (13)2.2.1 被检血清分离及保存 (13)2.2.2 虎红平板凝集试验（RBT） (13)2.2.3 试管凝集试验（SAT） (14)2.2.4 间接酶联免疫吸附试验（I-ELISA） (14)2.3 结果 (15)2.4 讨论 (16)3 实验二：多重PCR方法的建立 (17)3.1 材料 (17)3.1.1 菌株 (17)3.1.2 临床样品 (17)3.1.3 主要实验仪器 (18)3.1.4 主要试剂 (18)3.2 多重PCR方法的建立 (18)3.2.1 引物的设计与合成 (18)3.2.2 核酸提取 (18)3.2.3 引物特异性验证 (19)3.2.4 引物交叉特异性鉴定 (20)3.2.5 PCR产物纯化测序鉴定 (20)3.2.6 多重PCR反应条件优化 (20)3.2.7 多重PCR方法验证 (21)3.2.8 临床样本初步应用 (21)3.3 结果 (21)3.3.1 引物特异性结果 (21)3.3.2 引物交叉特异性结果 (22)3.3.3 PCR产物测序鉴定结果 (23)3.3.4 多重PCR反应条件优化结果 (25)3.3.5 多重PCR验证结果 (25)3.3.6 临床样本初步应用结果 (29)3.4 讨论 (31)4 结论 (32)致谢 (33)参考文献 (34)作者简介 (40)缩略词表OIE(Office International Des Epizooties) 世界动物卫生组织(原国际兽疫局) WHO(World Health Organization) 世界卫生组织pH(hydrogen ion concentration) 氢离子浓度指数LPS(lipopolysaccharide complex) 脂多糖复物OMP(outer membrane protein) 外膜蛋白RBT(rose—bengal plate agglutination test) 虎红平板凝集试验SAT(serum agglutination test) 试管凝集试验i-ELISA(indirect enzyme-linked immunosorbent assay) 间接酶联免疫吸附试验c-ELISA(competitive enzyme-linked immunosorbent assay) 竞争酶联免疫吸附试验PCR(polymerase chain reaction) 聚合酶链式反应RT-PCR(real-time fluorescence pcr) 实时荧光PCR bp(base pair) 碱基对Tm(melting temperature ) 解链温度内蒙古农业大学硕士学位论文 1 1 引言1.1 布鲁菌病概述布鲁菌病(Brucellosis）是由布鲁菌（Brucella）属细菌引起的一种人畜共患传染病，简称布病，也称波浪热、马耳他热等[1]。
布鲁氏菌分离株MLVA分子分型鉴定
布鲁氏菌分离株MLVA分子分型鉴定马晓菁;叶锋;姚刚;易新萍;刘帅;谷文喜;吐尔洪·努尔;马俊杰;钟旗【摘要】目的对牛奶、羊奶以及羊流产胎儿中分离布鲁氏菌进行分型鉴定.方法采集新疆4个地区牛奶20份,羊奶20份,羊流产胎儿10份,分离培养后,运用VirB8-PCR和布鲁氏菌分子分型PCR(AMOS-PCR)方法对分离株进行布鲁氏菌属、种的鉴定,同时采用MLVA方法对分离株进一步鉴定,并将测定结果与http://mlva.u-psud.fr/数据库提供的布鲁氏菌数据进行比较,结合软件BioNumerics 6.6进行聚类分析.结果 6株分离株均为羊种3型布鲁氏菌,与辽宁省分离羊种3型布鲁氏菌在聚类分析中关系较近.结论 MLVA作为布鲁氏菌基因分型鉴定的一种快速、可靠的方法,为今后布鲁氏菌传染源的追溯及防控措施的制定提供依据.【期刊名称】《中国人兽共患病学报》【年(卷),期】2016(032)008【总页数】6页(P722-727)【关键词】MLVA;牛乳;布鲁氏菌;鉴定【作者】马晓菁;叶锋;姚刚;易新萍;刘帅;谷文喜;吐尔洪·努尔;马俊杰;钟旗【作者单位】新疆畜牧科学院兽医研究所,乌鲁木齐 830011;新疆畜牧科学院兽医研究所,乌鲁木齐 830011;新疆农业大学动物科学院,乌鲁木齐 830052;新疆畜牧科学院兽医研究所,乌鲁木齐 830011;新疆农业大学动物科学院,乌鲁木齐 830052;新疆畜牧科学院兽医研究所,乌鲁木齐 830011;新疆畜牧科学院兽医研究所,乌鲁木齐830011;新疆畜牧科学院兽医研究所,乌鲁木齐 830011;新疆畜牧科学院兽医研究所,乌鲁木齐 830011【正文语种】中文布鲁氏菌病是由布鲁氏菌引起的世界范围内严重危害畜牧业和人类健康的人畜共患病。
布鲁氏菌属分为9个种[1]，其中牛种和羊种布鲁氏菌传染性较强，也是我国主要流行的布鲁氏菌菌种。
新疆地区早在20世纪50～80年代初就是我国主要的布病疫区，90年代初新疆布病疫情得到了有效的控制，但此后布病疫情不断回升[2]。
使用多位点变异重复序列(MLVA)法分析临床样本中猪肺炎支原体的分子类型
使用多位点变异重复序列(MLVA)法分析临床样本中猪肺炎支
原体的分子类型
V Neira-Ramirez;M Torremorell;P Rabinowitz;B Paccha;S Gibbs;毛慧
【期刊名称】《国外畜牧学-猪与禽》
【年(卷),期】2014(034)002
【摘要】1 绪论猪肺炎支原体（H．hyopneumoniae）是猪地方性肺炎的病原体，也是造成全球养猪生产损失的病因之一。
多项研究报道，猪群中流行的猪肺炎支原体有多种毒株。
因而急需要一种定型方法，以评估猪肺炎支原体的暴发、【总页数】1页(P7)
【作者】V Neira-Ramirez;M Torremorell;P Rabinowitz;B Paccha;S Gibbs;毛慧
【作者单位】
【正文语种】中文
【中图分类】S855
【相关文献】
1.猪EGR2基因外显子2变异位点分析 [J], 许尧;冯力;李金玲;刘娣
2.限制性片段长度多态性分析法在CXCL10G-201A位点变异检测中的应用 [J], 刘立明;许智慧;刘妍;谢红;王海滨;毛远丽;徐东平
3.多位点可变数量串联重复序列分析在北京家族结核分枝杆菌基因分型中的应用及位点筛选 [J], 郑晓静;郑素华;杜博平;贾红彦;李卫民;丁北川;王甦民;张宗德
4.老年住院患者肺炎克雷伯菌临床分离株多位点可变数目串联重复序列基因分型特征分析 [J], 张媛媛;徐雅萍;杜鹏程;强裕俊;张雯;陈晨;于季红;郭军
5.野猪和家猪MC4R基因的分子扫描及两个变异位点的PCR-RFLP分析 [J], 杨秀芹;关庆芝;王文涛;刘娣
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Ｐｌａｎｎｉｎｇ
Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ，Ｓｈａｎｘｉ
Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ，Ｔａｉｙｕａｎ ０３００１２．Ｃｈｉｎａ（Ｌｉ Ｈ）；Ｂｒｕｃｅｌｌａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｂｒ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｂｌｅ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ａｎｄ
Ｃｏｎｔｒｏｌ，Ｃｈｉｎｅｓｅ
Ｃｅｎｔｅｒｆｏｒ
Ｂｒｕｃｅｌｌａ ｍｅｌｉｔｅｎｓｉｓ ｔｙｐｅ ３
ａｎｄ ｈｉｇｈｌｙ ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ，ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ ｉｎ ｐａｎｅｌ １ ｔｏ ｔｈｅ“Ｅａｓｔ Ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅａｎ”Ｂｒｕｃｅｌｌａ ｍｅｌｉｔｅｎｓｉｓ ｇｒｏｕｐ．Ｔｈｅ ｓｔｒａｉｎｓ ｗｅｒｅ ｄｉｖｉｄｅｄ ｉｎｔｏ ｇｒｏｕｐｓ Ａ ａｎｄ Ｂ，ａｎｄ ｇｒｏｕｐ Ａ ｗａｓ
Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｄ
Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ，Ｂｅｒｉｎｇ １０２２０６，Ｃｈｉｎａ｛Ｃｕｉ ＢＹ，Ｊｉａｎｇ Ｈ）
Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ａｕｔｈｏｒ：Ｊｉａｎｇ
Ｈａｌ，Ｅｍａｉｌ：ｊｉａｎｇｈａｉ＠ｉｃｄｃ．ｃａ
Ｔｏ ａｎａｌｙｚｅ ｔｈｅ ｇｅｎｏｔｙｐｅｓ ｏｆ Ｂｒｕｃｅｌｌａ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｉｎ Ｓｈａｎｘｉ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ ｕｓｉｎｇ ｍｕｌｔｉｐｌｅ
份，相邻地区的布鲁菌菌株ＭＬＶＡ分型结果一致或相近，对追溯传染源、分析布病的流行和爆发有重要意义。
ｐａｎｅｌ ２Ｂ的Ｂｒｕｃｅ０４、Ｂｒｕｃｅｌ６及Ｂｒｕｃｅ３０位点的变异度高，提示这３个位点对分析研究同一生物型菌株的变异
情况有价值。
【关键词】
布鲁菌；
多位点可变数量串联重复序列分析；
基因；
聚类分析
Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ ｏｆ ｈｕｍａｎ Ｂｒｕｃｅｌｌａ Ｙａｎｇ Ｈｏｎｇｘｉａ，Ｚｈａｎｇ
结
果
２．１菌株一般情况：采用传统的方法，观察菌落形 态为圆形、无色透明，表面光滑湿润的菌落进行鉴
万方数据
主堡丝直痘堂盘查２Ｑ！鱼生垒旦２Ｑ旦差堑鲞筮垒塑￡ｂ也』垦！ｄ！迥！！，△Ｐ巫！！Ｑ：２Ｑ！鱼，ｙ！！：蜇，塑！：垒
・２４９・
因
差
Ｅ ＾ ●ｖ芒． ２０１３３３ｅ ｇ。Ｘ：５ ｌ：．：，１ １ １ ５ ５ ５ Ｉｌ：：●３ ３ ３ ３ ３ ３ ３ ３ ３ １， １， ３ ３ ３ ３ １， １ ３ ３
ａｒｅ
ｍｏｓｔ
ｕｓｅｆｕｌ ｆｏｒ ｔｙｐｉｎｇ ｔｈｅ ＢｒｕｃｅＵａ ｉｎ Ｓｈａｎｘｉ． Ｂｒｕｃｅｌｌａ； Ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｌｏｃｕｓ ｖａｒｉａｂｌｅ ｎｕｍｂｅｒ ｔａｎｄｅｍ
ｒｅｐｅａｔｓ
【Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ】
ａｎａｌｙｓｉｓ
ａｎａｌｙｓｉｓ；
Ｇｅｎｅ；
Ｃｌｕｓｔｅｒ
布鲁菌病（ｂｒｕｃｅｌｌｏｓｉｓ，简称布病）是由布鲁菌属 细菌（ＢｒｕｃｅＵａ）侵入机体引起的人兽共患的传染．变
ＭＬＶＡ基因分型方法：ＭＬＶＡ引物共１６对．可
２。ｐａｎｅｌ
分为２组：ｐａｎｅｌ １和ｐａｎｅｌ
１包括８个位点。
分别为Ｂｒｕｃｅ０６、Ｂｒｕｅｅ０８Ｂｒｕｃｅｌ １Ｂｒｕｅｅｌ２Ｂｒｕｅｅ４２、
Ｂｒｕｃｅ４３、Ｂｒｕｃｅ４５、Ｂｒｕｃｅ５５：ｐａｎｅｌ ｐａｎｅｌ
２包括ｐａｎｅｌ ２Ａ和 ２Ｂ含５个位点，
ａｎ
ａｄｖａｎｔａｇｅｏｕｓ ｇｅｎｅ ｇｒｏｕｐ；ｔｈｅ ｖａｒｉａｂｉｌｉｔｉｅｓ ｏｆ Ｂｒｕｃｅ０４，Ｂｒｕｃｅ ｌ ６ Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔ ｏｆ ＭＬＶＡ ｆｏｒ Ｂｒｕｃｅｌｌａ ｉｓ ｉｄｅｎｔｉｃａｌ
ｓｏｕｒｃｅ
ｏｒ
ａｎｄ Ｂｒｕｃｅ３０ ｉｎ ｐａｎｅｌ ２Ｂ ｗｅｒｅ ｈｉｇｈｅｒ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎｓ
态反应性疾病…。近些年，随着畜牧业的发展，山西 省布病疫情呈明显的上升趋势，发病率居全国前
万方数据
士堡丝立瘟堂盘查２Ｑ！鱼生４旦２Ｑ旦箜３１鲞箜垒塑￡ｂ也』Ｅ！ｄ！堡丛，△Ｐ互１ ２Ｑ，２Ｑ！鱼，ｙ丛：≥！，丛！：垒
列。给人民健康和经济带来了巨大的影响。多位点 可变数目串联重复序列分析（ｍｕｌｔｉｐｌｅ
ＤＯＩ：１０．３７６０／ｅｍａ．ｊ．ｉｓｓｎ．２０９５—４２５５．２０１６．０４．００４
【摘要】
目的采用多位点可变数目串联重复序列分析（ＭＬＶＡ）方法对山西省分离的布鲁菌进行基因型
分析。方法２０１２、２０１３年，在山西省布鲁菌病（简称布病）监测点，采集已确诊的布病患者血液，进行血培养． 对培养出的布鲁菌进行传统的生物分型鉴定。选取ＭＬＶＡ的１６个位点［分为２组：ｐａｎｅｌ
１。
ａｎａｌｙｓｉｓ，ＭＬＶＡ）Ⅲ，是近
年发展起来的以ＰＣＲ为基础，根据被检菌株散在 于基因组中不同位点的可变数量串联重复序列
（ｖａｒｉａｂｌｅ ｎｕｍｂｅｒ ｔａｎｄｅｍ ｒｅｐｅａｔ，ＶＮＴＲ）的重复单元
拷贝数的差异来进行分子分型的技术，是近年新出 现的对细菌菌株之间的基因关系进行评价的方法。 为了对山西省布鲁菌感染情况的分子流行病学进 行更有效的分析，作者通过ＭＬＶＡ技术对山西省 ２０１２、２０１３年来分离的４７株布鲁菌的基因分型进 行了比较研究。 １对象与方法 １．１布鲁菌：从山西省布病监测点收集布病确诊病 例，采集患者静脉血５ ｍｌ，注入双相培养瓶中培养， 发现有菌生长后采用传统生物学方法进行分离鉴 定陇。参照标准菌株做血清凝集试验。硫堇、复红染 料抑菌试验，硫化氢（Ｈ２ｓ）产生试验及生物噬菌体 分型鉴定。 １．２主要试剂与仪器：血清及噬菌体由中国疾病预 防控制中心传染病所布病室提供：全基因组核酸提 取试剂盒购自德国ＱＩＡＧＥＮ公司：ＭＬＶＡ引物由上 海生工生物工程股份有限公司合成。微卫星测序由 北京天一辉远生物科技有限公司完成。２７２０型ＰＣＲ 热循环仪购自美国ＡＢ公司。
Ｄｉｓｅａｓｅ Ｉｎｓｐｅｃｔｉｏｎ
ｉｓｏｌａｔｅｄ ｂｙ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｌｏｃｕｓ Ｒｕｌｅ，Ｙｏｏ Ｓｕｘｉａ，Ｚｈａｎｇ
ｖａｒｉａｂｌｅ ｎｕｍｂｅｒｓ ｏｆ ｔｉｓ
Ｑｉｕｘｉａｎｇ，Ｈｏｏ
Ｆａｎｆｅｉ，Ｌｉ
Ｂｕｙｕｎ，ｊｉ帆ｇ
Ｈａｌ
２０１／２
ｏＣ延伸３０ Ｓ，４０个循环。产物进行微卫星测
９２２）的
序分析。 １．４统计分析：根据ＰＣＲ产物大小换算为重复单 位数，采用ＢｉｏＮｕｍｅｒｉｅｓ（Ｖｅｒｓｉｏｎ ５．０）软件进行聚类 分析，将获得的分型与布鲁菌数据库在线比较。
２
县（区），发病率增长近４倍。５］，而山西省２０１２年布 病发病数为６ １３０例，２０１３年为６ ８９５例（数据来 自中国疾病预防控制中心疾病监测信息报告管理 系统），发病数在全国仅低于内蒙古自治区和黑龙 江省，居第三位，全省１１９个县区均有病例报告，疫 情形势非常严峻１６］。 ＭＬＶＡ分型技术现已广泛用于细菌的基因分
主竺堂直瘟堂盘查２１ １§生堡旦！Ｑ旦箜！！鲞箜垒塑ｇｈ也』垦！ｄ！坐ｉ！！：△画１ ２Ｑ，２Ｑ！ｉ，ｙ！！：１５，盟！：垒
・２４７・
・论著・
布鲁菌多位点可变数目串联重复序列分析的
分型研究
杨红霞 张秋香 郝瑞娥 姚素霞 张凡非 李虹 崔步云 姜海 ０３００１２太原，山西省疾病预防控制中心疾病检验科（杨红霞、张秋香、郝瑞娥、姚素霞、张凡 非），免疫规划科（李虹）；１０２２０６北京，中国疾病预防控制中心传染病预防控制布鲁氏菌病室 （崔步云、姜海） 通信作者：姜海．Ｅｍａｉｌ：ｊｉａｎｇｈａｉ＠ｉｃｄｃ．ｃｎ
２Ａ、ｐａｎｅｌ ｌ、ｐａｎｅｌ ２（包括ｐａｎｅｌ
２Ｂ）］，对分离的布鲁菌进行ＭＬＶＡ分型，并对分型结果进行聚类分析。结果２０１２、２０１３年，共分离
４７株羊种３型布鲁菌；ＭＬＶＡ分型后进行聚类分析，发现分离的菌株高度同源，均为东地中海型：菌株可分为
Ａ群和Ｂ群，Ａ群为优势基因群；ｐａｎｅｌ ２Ｂ的Ｂｒｕｃｅ０４、Ｂｒｕｃｅｌ６及Ｂｒｕｃｅ３０位点的变异度较高。结论在同一年
细酶（２．５ Ｕ／ｉｘｌ）０．２斗ｌ，引物（１０
Ｉｘｍｏｌ／Ｌ）各０．４斗ｌ，
ＤＮＡ模板１．０¨ｌ，用灭菌蒸馏水补至２５．０斗ｌ。扩增条 件为９５℃预变性５ ｒａｉｎ：９５℃变性３０ ｓ，６０℃退火
３０ Ｓ、７２
越来越频繁，使得布病的发病率也不断增高。２００４—
２０１０年，布病已分布于我国４１％（１
ｓａｍｅ ｙｅａｒ
ｓｉｍｉｌａｒ ｉｎ ｔｈｅ
ａｎｄ
ａｄｊａｃｅｎｔ
ａｒｅａｓ，ｗｈｉｃｈ
ｉｓ
ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｆｏｒ ａｎａｌｙｚｉｎｇ
ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ，ｅｐｉｄｅｍｉｃｓ ａｎｄ ｏｕｔｂｒｅａｋｓ ｏｆ
ｂｒｕｃｅｌｌｏｓｉｓ．Ｇｅｎｏｔｙｐｅｓ ｓｈｏｗ ｖａｒｉａｔｉｏｎ ｍａｉｎｌｙ ａｔ ｔｈｅ ｐａｎｅｌ ２Ｂ ｌｏｃｉ（Ｂｒｕｃｅ０４，Ｂｒｕｃｅ ｌ ６ ａｎｄ Ｂｒｕｃｅ３０）；ｔｈｅｓｅ ｔｈｒｅｅ ｌｏｃｉ
Ｅ．＿‘Ｅｆ＾＿－Ｅ ＿‘ｆ
送检
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４
地点
Ｓ．；Ｉ．３ ３ ！－ｘ：４
１．３
表１
２０１２、２０１３年山西省布鲁菌菌株分离地区
２．２
ＭＬＶＡ分型结果：４７株菌的ＭＩⅣＡ结果经测
序分析，ｐａｎｅｌ １分型结果：４７株菌均为４２型（１．５． ３一１３—２．２—３．２），东地中海型。ｐａｎｅｌ ２分型结果：４７株 菌可分为３５个基因型，基因型相似度达到８５％以 上，总的来说可分为Ａ和Ｂ两个群．Ａ群共３３株可 分为２２个基因型，占７０．２％：Ｂ群共１４株可分为 １３个基因型，占２９．８％。按分离时间，Ａ群中２０１２ 年为１１株，占３３．３％，２０１３年为２２株，占６６．７％；Ｂ 群中２０１２年为７株，２０１３年为７株，各占５０．Ｏ％。 见图１。 ３讨论 山西省位于中国的中部地区，相邻的内蒙古自 治区、河北省等都属于布病的高发区．近年来随着 畜牧业的不断发展，家畜自由贸易、交换和流动得