日立l-8900氨基酸自动分析仪.ppt
日立氨基酸分析仪操作事项
日立氨基酸分析仪操作步骤 (1)日立氨基酸分析仪简介 (3)日立氨基酸分析仪操作注意事项 (4)日立氨基酸分析仪操作步骤1、开机：计算机开机及仪器开机。
2、创建新项目：打开软件→“项目”→“创建新项目”→填名称和路径，两个“□”打钩，点“启用程序”→“确定”→将D盘Method文件夹的6个方法复制到F盘Method文件夹。
3、泵的排气：“仪器”→“启动”和/或“离线启动”→关掉弹出窗口→点左下角“控制”→“仪器状态”→“Connet”→待左上角灰色框显示“Idle”，点“OPTION”→点Pump 1的“Purge”→ B1：B2：B3：B4 = 25：25：25：25 →“Start”→手动打开泵1开关（逆时针旋转90°）→“确定”→点Pump 2的“Purge”→R1：R2：R3 = 34：33：33 →“Start”→手动打开泵2开关→“确定”→待泵2的废液管液体无气泡，点Pump 2的“Purge”→拧紧泵2开关→点Pump 1的“Purge”→B5：B6 = 50：50 →“Start”→“确定”→待泵1的废液管液体无气泡，点Pump 1的“Purge”→拧紧泵1开关。
4、进样器的排气：“L 8900”→“Autosample”→“Sampler Wash”→“OK”→重复排气，直到进样器无气泡。
5、创建序列：“帮助”→“仪器向导”→“创建序列”→选方法“PH 4.6×60-2622”→“打开”→“下一步”→“样品”命名，加后缀→“数据文件”命名，选“样品ID”，加后缀“日期与时间”→填样品数（样品数= n+3，n为样品个数）→重复次数“1”→“下一步”→输入第一个样品瓶的编号→进样量“20”μL →“下一步”→“下一步”→“完成”→更改第一针方法为“PH 4.6×60-2622（Stand-by）”→更改第二针方法为“PH 4.6×60-2622（RG）”→更改样品瓶序号，与样品盘中一一对应→“文件”—“保存”—“序列”→命名文件夹→点“序列运行”。
L8900 AA analyzer 样品前处理简要步骤
日立L-8900全自动氨基酸分析仪样品前处理步骤（内部用）一、饲料样本中水解蛋白中氨基酸含量测定步骤（参考GB/T 18246-2000）1. 样品制备取具代表性的饲料样品，用四分法缩减分取25g 左右，粉碎并过。
.25m m孔径(60目)筛，充分混匀后装入磨口瓶中备用。
对于粗脂肪含量大于、等于5%的样品，需将脱脂后的样品风干、混匀，装入密闭容器中备用。
而对粗脂肪小于5%的样品，则可直接秤用未脱脂样品。
2. 氨基酸水解液制备（酸水解）称取含蛋白7.5 -25 mg的试样(约50~100 mg,准确至1 mg) 于20 mL水解管，加10.00 mL 酸解剂（6 mol/L HCl)，置液氮或干冰(丙酮)中冷冻。
然后，抽真空至7 Pa(-<5X1 0-'mm汞柱)后封口或充氮气封口。
将水解管放在110℃恒温干燥箱中，水解22~24 h。
冷却，混匀，开管，用水定容至50~100mL（保证上机液中总氨基酸浓度在50-250 nmol/mL），过滤，用移液管吸取1.0 mL 于真空干燥箱60℃蒸干，必要时，加少许水，重复蒸干1-2次（或50℃氮吹仪吹干，加少量水重复吹干2次）。
加入2 mL 0.02 mol/L HCl溶液，充分溶解，0.22 um滤膜过滤，上机。
二、血浆中游离氨基酸测定1. 样品制备采集约5 mL抗凝全血，4000 × rpm离心，获得血浆，检测前-20℃保存。
2. 分离游离氨基酸取血浆1.0 mL，加入1.0 mL 8%磺基水杨酸（8g磺基水杨酸溶于92mL的超纯水），4℃冰箱过夜，14000 × rpm 离心10 min，上清液过0.22 um滤膜，取约1 mL上机测定。
日立l-8900氨基酸自动分析仪.ppt
含有碱性氨基和酸性羧基的有机化合物
氨基连在α-碳上的为α-氨基酸
组成蛋白质的氨基酸均为α-氨基酸
组成蛋白质的 20 种氨基酸除甘氨酸外，都有一个不对称碳原子，即α-碳原子。
α-碳原子有四个不同取代基：羧基、氨基、氢原子和 R 基团，不同氨基酸的 R 基团不同。 每种氨基酸有 D -构型和 L -构型，天然蛋白质中的氨基酸都是 L- 构型。 广泛存在于食品、药品、水产品、饲料和体液（血液、尿样）
2.保留时间、峰面积、重现性好，检出限可达3pmol。
3.不存在液相方法生成二级衍生物的问题。 4.峰形显高斯分布，体系稳定快（半小时即可）
氨基酸分析仪按其分离和检测方法的不同可分为两大类型， 第一类是基于阳离子交换柱分离、柱后茚三酮衍生光度法 测定的经典方法（IEC）。第二类是所有基于反向色谱分离、 柱前衍生、荧光或紫外检测的高效液相色谱法（HPLC）以
的缓冲液依次将氨基酸按吸附力的不同洗脱下来。
3.分离后的氨基酸与茚三酮试剂在高温反应器中进行衍生反应， 生成可以被分光光度计检测的有色物质，然后在检测器中被检
测出来。
日立L-8900氨基酸分析仪流程图
分析实例：啤酒酵母
实例分析：猪排
实例分析：正常血清
实例分析：苯丙酮尿症血清
实例分析：苹果汁
种氨基酸吸附能力的不同进行分离纯化。
二 氨基酸分析仪发展及生产厂家
氨基酸分析仪进入国内市场已有近三十年的历史，它是专用于 测定蛋白质水解液（水解氨基酸）及生理体液中（游离氨基酸） 混合氨基酸含量的一种专用仪器，现已广泛应用于各行各业。 它与其他分析仪器区别在于只能检测氨基酸，不能作为他用，
具有专一性。
蛋白质氨基酸分析测试
蛋白质氨基酸分析测试一、实验课程：组成蛋白质的氨基酸的定量分析二、实验项目：三、主要仪器设备日立L-8900高速氨基酸分析仪1 实验目的用于检测样品中蛋白水解氨基酸、游离氨基酸的种类及含量，广泛应用于食品、纺织等领域检测。
2 仪器用具和材料L-8900高速氨基酸分析仪、氮吹仪、真空泵、水解瓶等。
3 基本知识用水解的方法将蛋白质的肽链打开，形成单一的氨基酸进行分析。
所有的氨基酸在低PH值的条件下都带有正电荷，在阳离子交换树脂上均被吸附，但吸附的程度不同，碱性氨基酸结合力最强、其次为芳香族氨基酸、中性氨基酸、酸性氨基酸结合力最弱。
按照氨基酸分析仪设定的洗脱程序，用不同离子强度、PH值的缓冲液依次将氨基酸按吸附力的不同洗脱下来，被洗脱下来的氨基酸与茚三酮反应液在加热的条件下反应（135度），生成可在分光光度计中检测到的蓝紫色物质外标法定量。
4 实验步骤：1水解样品（1）药液0.02 N HCI稀释3倍以上（根据氨基酸的浓度）作样品。
（2）蛋白质固体a 6N-HCI，110℃水解样品24小时。
b 减压干燥，除去HCI。
c 0.02NHCI容量, 0.22um的滤膜过滤（最终浓度以200ug/ml为宜）。
2打开工作站主画面，点击control——instrument status键进入3 单击connect联机，大约两分钟后初始化完成。
4点击File——Sequence，建立样品表。
5依次输入未知样品顺序、样品号、数据路径、文件名称、样品个数、重复次数。
6 点击下一步，输入样品瓶号、标准瓶号、进样体积、样品间隔数。
7点击下一步，标准品号、路径、文件名、标准品个数、重复次数。
8点击完成，生成的样品表。
9点击File-Method-Open，调用方的。
10点击单一运行(Single Run)，及序列运行(Sequence Run)。
11采样结束后进行数据处理。
全自动氨基酸分析如何推测样品浓度
5.6 如何推测样品浓度本设备使用的各氨基酸样品的最适宜浓度范围为0.4至10 nmol/20 μL。
因此，在添加样品之前，必须对样品的浓度加以推测。
(1) 当在水解之前已知样品容量时这时，需先确定蛋白质或缩氨酸的重量。
假定平均分子量为120，那么，每次样品中20种氨基酸的净含量大约为5μg/20 μL。
于是，需制备5份这样的样品。
(2) 当样品浓度未知时这时，按下文所述与标准样品进行对比非常方便。
(a) 取两个试管，一个加入0.1 mL认为浓度适宜的样品，另一个加入0.1 mL的标准样品。
(b) 向两试管内均加入1 mL茚三酮试剂和1 mL缓冲溶液（PH-1）。
(c) 在100 ︒C的相同温度下对两个试管加热3分钟。
(d) 将颜色变化同标准样品进行比较，即测定570 nm波长时的吸光率。
(e) 为了推测近似浓度，需对比标准样品与稀释溶液的总容量e并估测二者之间的倍数关系，从而判断未知样品的容量。
例如，如果未知样品稀释至1/4时的浓度与标准样品的浓度相同，则未知样品的浓度为标准样品浓度的4倍，那么，未知样品的添加容量为1/4即可。
如果未知样品的浓度较低，在按此方式处理时，增加相应容量的即可。
在采用这种对比方法对多种氨基酸进行具体推测时，需仔细计算浓度。
(3) 样品浓度过高时(包括杂物的浓度过高的情况)(a) 自动进样器的进样针上粘附着高浓度样品时，将会促进进样口的磨损，而可能引发漏液。
为了防止漏液，对高浓度样品进行分析时，请更改自动进样器的清洗条件。
(b) 请参照方法的创建（L-8900高速氨基酸分析仪（OpenLAB系统）2.7.1「仪器条件的设定」），将进样针的清洗时间设定为1 s～5 s。
5.75.7 样品的预处理在加载到分析仪之前，必须根据具体的检测目标处理样品。
处理方法大体有两种。
一种方法是测定游离氨基酸，包括氨基酸及其化合物（以下称生理性液体分析）；另一种方法是测定蛋白质水解获得的氨基酸本身（以下称蛋白质水解分析）。
L-8900氨基酸分析仪培训内容
❖ 四、氨基酸分析仪与HPLC法的比较 ❖ （一）OPA法（邻苯二甲醛） ❖ （二）PITC法 ❖ （三）D-CL法 ❖ （四）2-4—二硝基氟苯法
❖ 五、样品的制备（样品预处理）
❖ （一）蛋白质的水解方法
日立氨基酸分析仪
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培训课程安排
第一项内容
❖ 一、日立氨基酸分析仪简介
❖ （一）氨基酸分析仪
Байду номын сангаас
❖ （二）氨基酸分析仪构成、流程图
❖ （三）特点
❖
什么叫氨基酸分析仪？
❖ 二、氨基酸
❖ （一）氨基酸的定义
❖ （二）氨基酸的分类
❖ （三）氨基酸的化学性质
❖
什么叫氨基酸？
❖ 三、氨基酸分析仪基本分析原理（洗 脱过程）
❖
1、酸水解法
❖
2、碱水解法
❖
3、酶水解法
❖
4、样品的前处理（详细）
❖
5、盐酸水解注意事项
❖ （二）游离氨基酸样品的制备
❖ （三）生理体液样品的前处理
❖ 六、影响氨基酸分析的各种因素
❖ （一）样品中氨基酸浓度的影响
❖ （二）缓冲液PH值、钠离子浓度
❖
的影响
❖ （三）柱温的影响
❖ （四）氨的影响 ❖ （五）氧存在的影响 ❖ （六）光源的影响（钨灯） ❖ 七、应用 ❖ （一）医学上的应用 ❖ （二）饲料上的应用
❖ 1、质量控制 ❖ 2、真伪鉴别 ❖ （三）农用、食品、饮料及其它
第二项内容
❖ 一、试剂国产化交流 ❖ 二、试剂国产化注意事项 ❖ 三、仪器软件的操作讲解 ❖ 四、仪器的维护保养 ❖ 五、答疑（与用户现场交流）
日立-8900全自动氨基酸分析仪简单操作规程
日立L-8900全自动氨基酸分析仪简易操作规程一、联机1、打开电脑。
2、打开主机电源。
3、双击桌面的图标，进入1-1画面，双击图标，进入程序。
1-14、在菜单栏中依次点击和，出现1-2画面，单击联机。
大约两分钟，初始化完毕。
中Uninitialized变成Idle，图1-2变成了图1-3，各个组件可以进行控制了。
初始化完毕后，分离柱的温度逐渐上升。
分离柱的温度会升到50℃。
1-21-3二、手动各组件控制操作1、泵1和泵 2点击，出现2-1的画面。
设置泵1，流量0.ml/min，B1 100%。
点击打开泵1。
泵打开后，泵的背景颜色由灰色变为黄色。
2-1点击，出现2-2的画面，设置泵2，流量0.1ml/分钟，R3 100%。
点击打开泵2。
泵打开后，泵的背景颜色由灰色变为黄色。
2-22、自动进样器点击，出现2-3的画面，设置Sampler Wash不少于3次。
2-32-43、反应柱柱温箱点击，出现2-5画面，设置柱温135℃，设置ON，打开柱温箱。
柱温箱打开后，背景颜色由灰色变为黄色。
2-52-6三、编辑方法1、依次点击、、出现3-1-1的画面。
3-1-12、选中，点击。
再依次点击、，出现3-1-2的画面。
3-1-23、在设置中选中各个柱，其余参数默认。
4、将方法另存为L8900分析方法，文件名及路径均可自选。
注意一定不要覆盖原来的方法，一定得另存。
注意将梯度设为3-3-1所示，其余参数默认。
3-3-12、保存方法。
四、编辑Sequence1、依次点击、、，出现4-1画面。
选中，其余参数默认。
4-12、点击，出现4-2画面，根据需要填写各个参数。
4-23、点击，出现4-3画面，根据需要填写各个参数。
4-34、点击，出现4-4画面，根据需要填写各个参数。
4-45、点击，出现4-5画面。
4-56、通过复制、编辑，最终将Sequence编辑如图4-6所示。
注意此时第一行是再生程序（RG），进样体积为0，Run Type是Unknown，第二行是标准样品，三行起是未知样。
氨基酸分析仪
氨基酸分析仪洗脱过程
1.氨基酸在PH2.2的条件下都带正电荷，在阳离子交换树脂上均 被吸附,但结合强度各不相同。
2.随着缓冲液在离子交换柱上流动，氨基酸不断地吸附、解吸附。 由于氨基酸性质的差异（酸碱性、极性、分子大小）,吸附强度 有差异。 3.不同氨基酸与离子交换树脂的亲和力不同：碱性氨基酸> 芳香 族氨基酸>中性氨基酸>酸性氨基酸及羟基氨基酸。 4.提高流动相PH值，氨基酸正电荷减少，吸附力减弱，最后从离 子交换柱上洗脱下来。洗脱顺序是酸性和带羟基氨基酸、中性氨 基酸、碱性氨基酸。 5.氨基酸标准液中各种氨基酸在氨基酸自动分析仪上被洗脱的顺 序一定;标准液各种氨基酸的浓度一定，洗脱峰的面积一定;由此 可计算出样品中各种氨基酸的含量。
L-8900 AAA的流程图
L-8900 AAA的性能指标
以蛋白水解液标准分析方法为例： 净分析时间：30分钟 检出限：3 pmol(信噪比=2，天门冬氨酸） 保留时间重现性：CV 0.3% （精氨酸） 峰面积重现性：CV 1.0% (甘氨酸、组氨酸）
氨基酸分析仪最大的特点：
1 灵敏、快速、提供数据准确可靠：分辨 率高、操作简单，分析周期短（水解30分 钟、体液110分钟）。 2 保留时间、峰面积、重现性好，检出限 可达3pmol。 3 不存在液相方法生成二级衍生物的问题。 4 峰形显高斯分布，体系稳定快（半小时 即可）。
日立L-8900全自动氨基酸分析仪
日立氨基酸分析仪的历史
KLA-5
四十多年的历史，拥有2000多用户
835 L-8800 L-8900
Sold KLA in 1962 L-8500
L-8900 AAA的内部结构
L-8900 AAA的组成
组件名称 缓冲液 色谱柱 泵 自动进样器 柱温箱 反应单元 检测单元 控制系统 参数 6种（试剂与清洗液） 4.6mm id x 60mm， 阳离子树脂填充（标配) 0.001-0.999ml/min, 0-20MPa, 2 1500µl; 200vial (200 cooler) ; 0.1-100µl 20-85℃（1℃）, 电子加热/制冷的温控装置。 50℃ --140℃,电子加热的温控系统 可见分光光度计（570，440nm） EZChrom Elite 分析软件 CPU: 32bits OS, Windows xp
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精氨酸 Arg （R）10.76 天冬氨酸 Asp（D） 2.98 谷氨酸 Glu （E） 3.22 甘氨酸 Gly （G） 5.97 亮氨酸 Leu （L） 5.98 蛋氨酸 Met （M）5.75 脯氨酸 Pro （P）6.30 苏氨酸 Thr （T）6.53 酪氨酸 Tyr （Y）5.65 异亮氨酸 Ile （I）6.02
日立 L-8900 氨基酸自动分析仪
内容
氨基酸相关内容介绍 氨基酸分析仪发展及生产厂家 氨基酸分析仪原理及相应部件 样品的制备 应用 常见故障的分析与处理 保养
一 氨基酸相关内容介绍
氨基酸（amino acid）：含有氨基和羧基的一类有机化合物的通 称。是生物功能大分子蛋白质的基本组成单位，是构成动物营养 所需蛋白质的基本物质。
离子交换树脂
专用氨基酸分析仪的色谱柱主要是以磺酸型强酸性阳离子交换 树脂为柱填料。强酸型阳离子交换树脂，它是由苯乙烯和二乙 烯苯聚合而成的。该树脂是由苯乙烯和二乙烯基本聚合后磺化 而成，球状树脂的粒度一般在5-10μm之间，交联度多为8%12%。
交联度大，树脂的网状结构紧密，孔隙度小，对外界离子进入 树脂有阻碍作用，较大的离子根本不能进入树脂内部，这样就 可以提高树脂对离子的选择性。交联度大的适合用于分子量较 小的氨基酸分离；交联度小，树脂结构疏松，孔隙度大，适合 用于蛋白质、肽类的分离。
氨基酸的化学性质
氨基酸分子中都具有氨基和羧基，因此它们都能产生氨基与 羧基的一般反应，如脂化、甲基化、乙酰化以及酸碱的中和 作用等。有些氨基酸由于存在其它基团而产生特殊反应，如 半胱氨酸的巯基（-SH）
茚三酮反应
茚三酮溶液与氨基酸共热，生成氨。氨与茚三酮和还原性茚三酮 反应，生成紫色化合物。该化合物颜色的深浅与氨基酸的含量成 正比，可通过测定570nm处的光密度，测定氨基酸的含量。
4.提高流动相pH值，氨基酸正电荷减少，吸附力减弱，最后从离子交换柱 上洗脱下来，洗脱顺序是酸性和带羟基氨基酸、中性氨基酸、碱性氨基酸。
5.氨基酸标准溶液中各种氨基酸在氨基酸自动分析仪上被洗脱的顺序一定， 标准液各种氨基酸的浓度一定，洗脱峰的面积一定，由此可计算出样品中 各种氨基酸的含量。
通常细分为两种系统：蛋白水解分析系统（钠盐系统）和游离氨基酸 分析系统（锂盐系统），利用不同浓度和pH值的柠檬酸钠或柠檬酸 锂进行梯度洗脱。其中钠盐系统一次最多分析约25种氨基酸，速度较 快，基线平直度好；锂盐系统一次最多分析约50种氨基酸，速度较慢， 基线一般不如钠盐系统好。
含有碱性氨基和酸性羧基的有机化合物 氨基连在α-碳上的为α-氨基酸 组成蛋白质的氨基酸均为α-氨基酸
组成蛋白质的 20 种氨基酸除甘氨酸外，都有一个不对称碳原子，即α-碳原子。 α-碳原子有四个不同取代基：羧基、氨基、氢原子和 R 基团，不同氨基酸的 R 基团不同。 每种氨基酸有 D -构型和 L -构型，天然蛋白质中的氨基酸都是 L- 构型。 广泛存在于食品、药品、水产品、饲料和体液（血液、尿样）
氨基酸在溶液中受溶液 pH 的影响存在着下列平衡
等电点（pI）：在某一 pH 的溶液中，氨基酸解离成阳离子和阴 离子的趋势或程度相等，成为兼性离子，呈电中性，此时溶液 的pH成为该氨基酸的等电点。
不同氨基酸等电点
丙氨酸 Ala （A）6.02 天冬酰胺 Asn （N）5.41 半胱酰酸 Cys （C）5.02 谷氨酰胺 Gln （O）5.65 组氨酸 His （H）7.58 赖氨酸 Lys （K）9.74 苯丙氨酸 Phe （F）5.48 丝氨酸 Ser（S）5.68 958年 stein 与moore 两人先后独立发明离子交换分离、茚三 酮柱后衍生氨基酸自动分析仪。基于阳离子交换柱分离、柱后 茚三酮衍生、光度法测定的离子交换色谱法（IEC）， 1972年 stein 与moore 两人同获诺贝尔奖。 IEC是当今国际标准和国 家标准以及仲裁和涉外的方法 。
氨基酸的分离分析
特殊沉淀法 离子交换法 萃取法 毛细电渗析
离子交换法分离分析氨基酸的原理
根据氨基酸是两性电解质这一特性，以及目的氨基酸与 杂质氨基酸 pK、pI 值的差异，利用离子交换树脂对各 种氨基酸吸附能力的不同进行分离纯化。
二 氨基酸分析仪发展及生产厂家
氨基酸分析仪进入国内市场已有近三十年的历史，它是专用于 测定蛋白质水解液（水解氨基酸）及生理体液中（游离氨基酸） 混合氨基酸含量的一种专用仪器，现已广泛应用于各行各业。 它与其他分析仪器区别在于只能检测氨基酸，不能作为他用， 具有专一性。
氨基酸分析仪洗脱过程
1. 氨基酸在pH 2.2的条件下都带正电荷，在阳离子交换树脂上均被吸附， 但结合强度各不相同。
2. 随着缓冲液在离子交换柱上流动，氨基酸不断的被吸附、解吸附。由于 氨基酸性质的差异（酸碱性、极性、分子大小），吸附强度有差异。
3. 不同氨基酸与离子交换树脂的亲和力不同：碱性氨基酸＞芳香族氨基酸 ＞中性氨基酸＞酸性氨基酸及羟基氨基酸。
氨基酸分析仪生产厂家及常见型号
日立氨基酸分析仪发展历史
三 氨基酸分析仪原理及相应部件
氨基酸分析仪基本分析原理：
各种蛋白质是由20种氨基酸首尾相连，并以一定的顺序组成肽链。用 水解的方法将肽链打开，形成单一的氨基酸进行分析。所有的氨基酸 在低pH值的条件下都带有正电荷，在阳离子交换树脂上均被吸附，但 吸附的程度不同，碱性氨基酸结合力最强、其次为芳香族氨基酸、中 性氨基酸、酸性氨基酸结合力最弱。按照氨基酸分析仪设定的洗脱程 序，用不同离子强度、pH值的缓冲液依次将氨基酸按吸附力的不同洗 脱下来（先酸性氨基酸再中性氨基酸最后碱性氨基酸），被洗脱下来 的氨基酸与茚三酮反应液在加热的条件下反应（135度），生成可在分 光光度计中570nm和440nm检测到的蓝紫色物质（仲氨生成浅黄色物 质440nm检测），外标法定量。