说明免疫组织化学技术检测组织和细胞内蛋白质抗原的关键技术
免疫组化原理、步骤及要注意的事项
免疫组化原理、步骤及要注意的事项免疫组化一，免疫组织化学简介免疫组织化学又称免疫细胞化学，是指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应炕原进行定性、定位、定量测定的一项新技术。
它把免疫反应的特异性、组织化学的可见性巧妙地结合起来，借助显微镜(包括荧光显微镜、电子显微镜)的显像和放大作用，在细胞、亚细胞水平检测各种抗原物质(如蛋白质、多肽、酶、激素、病原体以及受体等)。
二，免疫组化技术的基本原理免疫组化技术是一种综合定性、定位和定量；形态、机能和代谢密切结合为一体的研究和检测技术。
在原位检测出病原的同时，还能观察到组织病变与该病原的关系，确认受染细胞类型，从而有助于了解疾病的发病机理和病理过程。
免疫酶组化技术是通过共价键将酶连接在抗体上，制成酶标抗体，再借酶对底物的特异催化作用，生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，于普通显微镜或电镜下进行细胞表面及细胞内各种抗原成分的定位，根据酶标记的部位可将其分为直接法（一步法）、间接法（二步法）、桥联法（多步法）等，用于标记的抗体可以是用免疫动物制备的多克隆抗体或特异性单克隆抗体，最好是特异性强的高效价的单克隆抗体。
直接法是将酶直接标记在第一抗体上，间接法是将酶标记在第二抗体上，检测组织细胞内的特定抗原物质。
目前通常选用免疫酶组化间接染色法。
三，免疫组化步骤1，切片，烤片60℃，1h；2，脱蜡及复水二甲苯10min，100％乙醇5min，95％乙醇5min，90％乙醇5min，85％乙醇5min，80％乙醇5min，75％乙醇5min，60％乙醇5min，50％乙醇5min，30％乙醇5min，自来水1min，双氧水1min；3，1份30％H2O2加10份蒸馏水，室温10min，蒸馏水洗3次，每次3min；4，微波修复将切片浸入0.01M枸橼酸缓冲液，微波中最大火力（98℃-100℃）加热至沸腾，冷却（约5-10min），反复两次；5，将切片自然冷却至室温，PBS洗涤3次，每次5min；6，封闭，5％BSA，室温20min，甩去多余液体；7，滴加一抗，37℃，1h，或者4℃过夜；8，PBS洗涤3次，每次3min；9，滴加二抗，37℃，15-30min；10，PBS洗涤3次，每次3min；11，滴加SABC，37℃， 30min；12，PBS洗涤3次，每次5min；13，1ml蒸馏水中分别滴加显色剂，混匀；14，DAB显色剂配置好后，滴加于切片，室温，镜下检测反应时间（约5min）；15，自来水冲洗干净，过蒸馏水；16，苏木素复染2min，自来水冲洗；17，脱水30％乙醇3min，50％乙醇3min，70％乙醇3min，80％乙醇3min，90％乙醇3min，95％乙醇3min，100％乙醇3min，二甲苯20min；18，树胶封片，镜检。
免疫组化各步原理
一、免疫组化技术免疫组织化学（Immunohistochemistry"HC）技术是用标记的特异性抗体（或抗原）对组织内抗原（或抗体）的分布进行组织和细胞原位检测技术。
目前，这种技术在临床病理诊断和形态学研究中已得到广泛应用。
Slide 3:（一）、免疫组化常用染色方法和步骤（石蜡切片）SP法（链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连接法）:SP法（链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连接法）原理采用生物素标记的第二抗体与链霉菌抗生物素蛋白连接的过氧化物酶及底物色素混合液来测定细胞和组织中的抗原。
主要步骤:主要步骤1、石蜡切片脱蜡（与常规HE切片脱蜡相同）：石蜡切片置60 ℃ 烤箱烤片15小时以上一从烤箱中拿出立即放入二甲苯I中5~10 min一二甲苯II 5~10min 一无水乙醇5min 一95%乙醇5min 一80%乙醇5min 一70%乙醇5min 一自来水洗Slide 6:2、3%H2O2阻断20min （以消除内源性过氧化物酶的活性，降低背景）；PBS 洗3次，每次5min。
3、抗原修复；PBS洗3次，每次5min。
4、滴加5~10% 正常山羊血清封闭，37℃, 10min （消除背景非特异性着色）Slide 7:5、吸干组织周围多余的血清，不洗，滴加第一抗体，37℃,孵育60min或孵育30min 再4℃冰箱过夜；PBS洗3次，每次5min。
6、擦干组织周围PBS, 滴加生物素标记的第二抗体，37c 孵育20min, PBS洗3次，每次5min。
Slide 8:7、擦干组织周围PBS,滴加链霉菌抗生物素-过氧化物酶溶液37c 孵育20min。
8、PBS洗3次，每次5min, D.W洗2次，DAB显色（DAB必须现用现配），镜下控制显色程度，自来水冲洗，苏木素复染胞核，烤干，中性树胶封片。
染色步骤:染色步骤石蜡切片脱蜡到水；3%H2O2阻断10min （以消除内源性过氧化物酶的活性，降低背景）；蒸馏水洗2次，PBS洗3次，每次5min。
免疫组织化学检验技术的材料
免疫组织化学检验技术的材料随着现代医学的发展，免疫组织化学检验技术在临床诊断和研究中扮演着越来越重要的角色。
免疫组织化学检验技术是一种利用抗体特异性与抗原结合的原理，通过特定染色方法对组织或细胞中的蛋白质进行定位和检测的技术手段。
它不仅可以用于诊断各种疾病的组织病理学分子印记，也可以用于肿瘤分子生物学研究和实验室医学检测。
本文将介绍免疫组织化学检验技术的原理、方法和应用。
一、原理免疫组织化学检验技术的原理是基于抗体特异性结合抗原的特性。
在免疫组织化学检验中，首先需要利用免疫组织化学染色方法标记抗体或抗原，然后利用生物学、生物化学、免疫学、组织学和显微镜学的综合知识来检测这种标记。
常用的标记物有辣根过氧化酶，碱性磷酸酶，辣根过氧化氢酶等。
通过染色显色法观察并分析组织或细胞中的蛋白质分布情况，从而获得与抗体相关的信息。
二、方法免疫组织化学检验技术的方法包括抗原修饰、抗体标记、染色显色和结果分析等步骤。
抗原修饰是将组织或细胞中的抗原提取、定位和识别；抗体标记则是利用特异性抗体对抗原进行识别和结合，通过标记物的作用将这种结合关系可视化；染色显色是指通过添加适当的染料或显色物质，使抗原-抗体结合产生的信号可视化；结果分析则是根据显色结果，观察、统计、记录和分析样品中抗原的分布情况。
通过这些方法，可以对细胞和组织中的蛋白质进行高效、准确地定位和检测。
三、应用免疫组织化学检验技术在临床和科研领域有着广泛的应用。
在临床诊断中，免疫组织化学检验技术可以帮助医生诊断肿瘤、感染、自身免疫性疾病等疾病，并且可以评估患者的预后和治疗反应。
在基础科研领域，该技术可以用于研究细胞信号传导、蛋白质相互作用、细胞分化等生物过程，也可以用于发现新的生物标志物，探索疾病的分子机制。
免疫组织化学检验技术在药物研究、医学影像学和病理科学等领域也有重要应用。
总结免疫组织化学检验技术作为一种重要的分子生物学技术，在临床诊断和基础研究中起着不可替代的作用。
免疫组织化学技术
免疫组织化学技术第一篇：免疫组织化学技术基础免疫组织化学技术是一种利用免疫学原理对细胞或组织进行化学定位的技术。
该技术可以用于鉴定细胞或组织中某种特定抗原的存在及分布情况，从而为病理诊断、学术研究和药物研发等提供有力的支持。
一、免疫组织化学技术的原理免疫组织化学技术的原理是利用抗体与其靶分子间的特异性结合反应，来实现对目标物的检测和定位。
抗体可以识别并结合到人体或动物体内的大部分蛋白质，包括生物芯片检测、ELISA检测、Western blotting等技术所用的基质和抗原。
在免疫组织化学技术中，针对某种抗原的特异性抗体先与组织样本中的特异性抗原发生特异性结合，然后通过检测抗体所标识的色素或荧光物等发射的信号，加以可视化。
例如，用特异性抗体和明胶酶-抗明胶酶复合物在组织样本上进行化学染色，从而定位并可视化样本中的抗原。
二、免疫组织化学技术的步骤1. 样本制备：第一步是样本的制备，包括切片、固定和脱水等处理。
固定组织样本是为了保持其形态和结构，因此往往使用福尔马林等固定剂进行固定。
在制片时，细胞或组织切割成相对较薄的切片，一般为5-10 μm。
切割后，通常漂洗去除固定剂，然后脱水，通常采用乙醇浓度逐渐递增的方法进行。
最后，将切片放置于有机媒介中，如去石蜡等。
2. 抗原修复：切片离体后，抗原结构可能会发生改变，因此需要进行抗原修复。
抗原修复可以通过热处理、酶解或酸解等方式进行。
热处理方法包括水浴、压力釜等；酶解包括蛋白酶和肝素酶等；而酸解则是利用酸将组织溶解并解离抗原。
3. 抗体标记：抗体标记是免疫组织化学技术的核心步骤。
选择具体的抗体，可以选择单克隆或多克隆抗体等。
接着，抗体常被标记为一种检测信号(如与酶或荧光物质结合)。
免疫荧光技术通常是通过荧光标记的二抗或荧光标记的可溶解复合物来可视化。
荧光地染色颜色有多种不同的方式，如荧光素-醌染料、荧光素-异硫氰酸染料等，可以根据不同的研究目的选择不同的荧光染色方法。
免疫组织化学技术的原理及方法
❖单克隆抗体：针对某一抗原决定簇， 由单株淋巴细胞（克隆）所产生的 抗体
多克隆抗体与单多克隆抗体及其产生
多克隆抗体的产生
❖ 以纯化的抗原免疫动物而获得，实际上是针对多个抗原决定 簇的多个抗体组成，检测范围广。在病理诊断 中，有利划归 肿瘤的基本类型。
酶标亲和素
在AB复合物中，酶是标记 在生物素上，而后与亲和素 合成复合物。在标记的亲和 素-生物素方法中是将辣根 过氧化酶直接标记在亲和素 上，辣根过氧化酶与亲和素 间有极强的结合力，因此 LSAB法比ABC法更敏感
多聚物载体
1、 核心是一种柔韧的多聚物，它能结合一抗和酶分 子，起到载体的作用
2、 一步法多聚物载体试剂是多聚物结合特异性一抗 和辣根过氧化酶，二步法多聚物载体试剂是一种能 与二抗相联结的由HRP标记的多聚物
显示系统
辣根过氧化酶的免疫组化染色的反应过程: HRP + H2O2 →HRP·H2O2 →有色分子终末产
物+ HRP DAB（电子供体） HRP：酶 H2O2：底物 HRP·H2O2：酶·底物复合物
显示系统
免疫过氧化酶染色的多种方法中，其主要的不同点 在于显色系统的差异： ❖ 间接酶标法：利用标记于桥联抗体的酶 ❖ PAP法： 利用PAP复合物 ❖ ABC法： 利用AB复合物 ❖ LSAB法: 利用直接标记于亲和素的酶 ❖ EPOS一步法及EnVision二步法：多聚物载体
标记抗体
1、在抗体上用化学方法联接某种标记物，目的是使抗原抗体 的结合能用肉眼观察到
2、标记物种类：荧光素：异硫氰酸荧光素或罗丹明 酶：辣根过氧化酶，碱性磷酸酶 金属离子：胶体金颗粒
3、标记的方法：化学性结合将降低抗体效价及标记物的活性， 从而使染色敏感性降低
免疫组织化学染色技术
病毒载量评估
染色技术可以定量检测组织中病毒的数量，有助于评估病毒复制 活跃程度和治疗效果。
鉴别诊断
染色技术可以与其他感染性病变进行鉴别诊断，有助于确定病因 和治疗方案。
自身免疫性疾病诊断
自身抗体检测
通过染色技术可以检测组织中自身抗体的存在， 有助于诊断自身免疫性疾病。
炎症反应评估
染色技术可以反映组织炎症反应的程度和范围， 有助于判断病情进展和治疗效果。
鉴别诊断
染色技术可以与其他非自身免疫性疾病进行鉴别 诊断，有助于确定病因和治疗方案。
药物靶点筛选
药物作用机制研究
染色技术可以用于研究药物的作用机制和靶点，有助于发现新的治 疗方法和药物。
药物筛选
染色技术可以用于筛选具有潜在治疗作用的候选药物，有助于降低 药物研发成本和时间。
床常用指标。
病毒检测案例
总结词
免疫组织化学染色技术可用于病毒的快速检测和鉴定， 具有高灵敏度和特异性。
详细描述
在病毒检测中，该技术常用于检测病毒抗原或抗体，以 确定病毒的存在和感染程度。例如，在COVID-19诊断 中，通过免疫组织化学染色技术检测病毒抗原，有助于 快速确诊和防控疫情。
自身免疫性疾病诊断案例
未来展望
随着蛋白质组学、基因组学等领域的快速发展，免疫组织 化学染色技术将继续发挥重要作用，并有望在临床诊断、 药物研发等领域取得更多突破。
02
免疫组织化学染色技术的基本步 骤
样本准备
样本类型
组织样本、细胞样本等，要求新鲜、无菌、无杂质。
样本处理
清洗、切割、固定等，确保样本的稳定性和染色效果。
海南大学生物工程学院2021年《细胞生物学》考试试卷(259)
海南大学生物工程学院2021年《细胞生物学》课程试卷（含答案）__________学年第___学期考试类型：（闭卷）考试考试时间：90 分钟年级专业_____________学号_____________ 姓名_____________1、判断题（35分，每题5分）1. 含有遗传信息的线粒体和叶绿体，可以在体外培养持续生存。
（）答案：错误解析：从细胞分离出的任何结构中，都不能在体外培养持续增长生存，不能作为生命活动的基本单位而存在。
2. 所有病毒仅由核酸与蛋白质两种物质组成。
（）答案：错误解析：不少病原还含有一定量的脂质物质、麦芽糖复合物与聚胺类化合物。
3. 在原核细胞中，由DNA转录mRNA和由mRNA翻译蛋白质是同时并几乎在同一部位进行。
（）解析：真核与原核细胞的一个显著差是：真核细胞核内转录，细胞质内翻译，具有严格的阶段性与区域性，而原核的转录与翻译同时、同地进行。
4. N连接的糖基化通常比O连接的糖基化修饰所产生的糖链的最终长度要长。
（）答案：正确解析：N连接的糖基化产生的糖链相接至少有5个糖残基，而O连接的糖基化产生的糖链一般为1～4个残基（AB0血型抗原的糖基侧链除外）。
5. 在生物膜中，每个类脂分子都带有一条糖链，而且都分布在非胞质面。
（）答案：错误解析：在生物膜中，并非每个类脂大分子都带有一条类脂糖链。
6. 细菌DNA的复制受细胞分裂周期的限制，只能在S期进行。
（）答案：错误解析：细菌DNA的复制不受细胞分裂周期的限制，可以连续进行，真核细胞DNA只能在S进行复制。
7. G0细胞是永远失去了分裂能力的细胞。
（）解析：G0细胞是暂时处于休眠期的细胞，在回受到适当的刺激后会回重返细胞周期进行分裂繁殖。
2、名词解释（40分，每题5分）1. 转胞吞作用（transcytosis）答案：转胞吞作用是一种特殊的内吞作用，受体和配体在内吞中并未作复合物任何处理，只是经细胞内转运到相反的同方向，然后通过镰形作用，将内吞物释放到细胞外，这种内吞主要发生在极性细胞中，如抗体转运到血液和奶汁就是这种运输。
免疫组织化学检验技术的材料
免疫组织化学检验技术的材料免疫组织化学检验技术是一种广泛应用于生物学、医学研究和临床诊断的技术。
它通过利用抗原-抗体的特异性结合反应，检测组织或细胞中的蛋白质、基因表达等。
以下是免疫组织化学检验技术所需的材料：1.样本收集在进行免疫组织化学检验前，需要收集样本，如组织切片、细胞涂片或石蜡切片等。
样本的收集和处理是至关重要的步骤，直接影响实验结果。
2.样本处理样本处理包括固定、脱水、包埋、切片等步骤。
这些步骤旨在保持样本的完整性，并去除其中的干扰物质，以便后续的抗原-抗体结合反应。
3.抗体选择抗体是免疫组织化学技术的关键组成部分。
根据实验目的和待检测的蛋白质类型，选择特异性抗体。
抗体的选择应基于实验设计、实验目的、目标蛋白质的性质等因素。
4.免疫反应免疫反应是将特异性抗体与目标抗原结合的过程。
该过程需要在适当的温度和pH条件下进行，以保持抗原-抗体的特异性结合。
5.信号转导信号转导是将免疫反应的特异性结合转化为可检测信号的过程。
这通常涉及使用酶或其他标记物对免疫反应产物进行染色或标记，以便在显微镜下观察。
6.检测仪器检测仪器是用于检测免疫反应产物的设备，如显微镜、荧光显微镜、图像分析系统等。
这些设备能够提供高分辨率图像，帮助研究人员观察和分析抗原-抗体的结合情况。
7.数据分析数据分析是对免疫组织化学实验结果进行定量和定性分析的过程。
这包括对图像数据的处理和分析，以及对实验结果的统计和解释。
数据分析旨在从实验数据中提取有意义的信息，以支持研究结论。
8.结果解释结果解释是对数据分析结果进行解读和解释的过程。
根据数据分析结果，研究者可以得出有关样本中目标蛋白质的存在、分布和表达水平的结论。
这些结论可以用于支持研究假设或提供病理学诊断的依据。
总结起来，免疫组织化学检验技术的材料包括样本收集、样本处理、抗体选择、免疫反应、信号转导、检测仪器、数据分析和结果解释等方面。
这些步骤相互关联，共同构成了一项完整的免疫组织化学实验。
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说明免疫组织化学技术检测组织和细胞内蛋白质抗原
的关键技术
免疫组织化学技术是一种基于免疫学原理的实验技术，适用于检测组织和细胞内蛋白质抗原。
其关键技术包括以下几个方面：
1. 抗原表位的选择：选择合适的抗原表位对于正确识别目标抗原至关重要，通常需要根据已知的抗原序列设计合适的抗原表位。
2. 抗原修复处理：组织标本或细胞病理部分常常因为常规处理方式而导致抗原失活、免疫组织化学染色效果受阻，因此，要使用抗原修复处理方法，如热解或酶解等，来恢复抗原的免疫原性。
3. 抗原特异性抗体的使用：使用特异性抗体与目标抗原发生特异性结合，通常用于检测和定位特定的抗原。
4. 免疫组化染色：将标本与特异性抗体反应后，通过适当的染色方法，如荧光染色、酶染色或放射性标记等方法，来进行成像和信号检测。
5. 图像分析和数据处理：通过数字化成像技术和计算机软件处理技术，对免疫组织化学染色的图像数据进行定量分析和计算，以实现更精确的数据表达和研究结果。