HIV蛋白质优势B细胞抗原表位的筛选、重组表达与抗原性鉴定
HIV跨膜蛋白gp41和gp36原核表达及抗原性研究_袁作为
文章编号:1000-5404(2010)21-2281-05论著H I V 跨膜蛋白g p 41和g p 36原核表达及抗原性研究袁作为1,帅光泽2,张 君1,胡接力1,郑 建1 (400016重庆,重庆医科大学感染性疾病分子生物学教育部重点实验室1;610106成都,成都大学校医院内科2) [摘要] 目的 构建H I V 跨膜蛋白g p 41和g p 36原核表达载体,诱导表达H I V 抗原,为H I V 快速诊断和蛋白疫苗研究提供材料基础。
方法 用P C R 方法对H I V -1包膜蛋白g p 41和H I V -2包膜蛋白g p 36基因序列进行全长、截短扩增,分别或以融合表达方式克隆入原核表达载体p Q E 30、p E T 32a (+)及p G S T -M O L U C ,重组质粒经异丙基硫代半乳糖苷(i s o p r o -p y l -β-D -t h i o g a l a c t o p y r a n o s i d e ,I P T G )诱导表达,并经N i -N A T 或谷胱甘肽-S e p h a r o s e -4B 层析柱亲和纯化H I V 跨膜糖蛋白抗原,对获得的纯化抗原进行We s t e r nb l o t 检测,利用H I V 抗原制备E L I S A 检测试剂盒,并分析H I V 临床样本。
结果 成功构建了H I V 包膜蛋白的原核表达载体,利用亲和层析纯化得到了纯度较高的H I V 包膜蛋白;We s t e r n b l o t 分析结果证实表达纯化的H I V 跨膜蛋白g p 41(a a .538～718)、g p 36(a a .533～764)以及g p 41-g p 36均能和H I V 阳性血清反应;E L I S A 试剂盒检测临床样本显示,特异性达95%以上,灵敏度达100%。
结论 获得了有生物学活性的H I V 截短包膜蛋白,并可用于H I V 快速检测试剂盒的研发。
我国HIV-1流行株gp41抗原表位筛选与串联表达
我国HIV-1流行株gp41抗原表位筛选与串联表达冯福民;李敬云;鲍作义;刘思扬;李林;庄道民【期刊名称】《中华微生物学和免疫学杂志》【年(卷),期】2005(025)002【摘要】目的探讨HIV-1 gp41抗原表位串联表达蛋白用于HIV抗体检测的可行性. 方法用HIV-1 gp41蛋白亲和层析柱制备HIV-1感染者血清中的多克隆抗体,用噬菌体展示随机十二肽库进行生物淘洗,反向吸附非特异性噬菌体.经ELISA鉴定阳性克隆,DNA测序,确定优势表位.将优势表位与文献报道的另一个优势表位串联,克隆入pQE30载体进行蛋白表达. 结果成功筛选到位于HIV-1 gp41蛋白上的优势抗原表位(YGPKDAETTAIW),串联表位(YGPKDAETTAIW-GGGS-SCSAKFTCTTQI)在pQE30载体中实现可溶性表达.重组蛋白具有良好的抗原性,能与不同的HIV-1抗体阳性血清呈特异反应. 结论 HIV-1 gp41抗原表位串联表达设计是可行的,串联表位重组蛋白可用于HIV-1抗体检测,但检测灵敏性低于常规方法.【总页数】4页(P124-127)【作者】冯福民;李敬云;鲍作义;刘思扬;李林;庄道民【作者单位】063000,唐山,华北煤炭医学院预防医学系;100071,北京,军事医学科学院微生物流行病研究所全军艾滋病检测中心;100071,北京,军事医学科学院微生物流行病研究所全军艾滋病检测中心;100071,北京,军事医学科学院微生物流行病研究所全军艾滋病检测中心;100071,北京,军事医学科学院微生物流行病研究所全军艾滋病检测中心;100071,北京,军事医学科学院微生物流行病研究所全军艾滋病检测中心【正文语种】中文【中图分类】R3【相关文献】1.HIV-1跨膜蛋白gp41重组抗原的表达及其免疫反应性2.HIV-1包膜蛋白gp41优势抗原的构建及可溶性表达3.模拟HIV-1 gp41 CHR表位短肽的筛选及研究4.HIV-1 GP41第二优势表位簇在大肠杆菌中的高效表达5.用M13噬菌体PⅢ蛋白Ⅰ-Ⅱ结构域表达HIV-1 gp41抗原表位因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
艾滋病的病检测技术有哪些
艾滋病的病检测技术有哪些艾滋病的检测技术有哪些艾滋病，一个令人闻之色变的名词。
它是一种严重威胁人类健康的传染病，由人类免疫缺陷病毒（HIV）引起。
及时准确的检测对于艾滋病的诊断、治疗和预防至关重要。
那么，目前都有哪些艾滋病的检测技术呢？首先，我们来了解一下酶联免疫吸附试验（ELISA）。
这是一种常见的血清学检测方法。
它的原理是利用酶标记的抗体与待检测样品中的 HIV 抗原或抗体发生特异性结合，然后通过检测酶的活性来判断结果。
ELISA 检测方法具有较高的敏感性和特异性，能够大规模筛查艾滋病病毒感染。
接着是免疫印迹试验（Western Blot，WB）。
它被认为是艾滋病检测的“金标准”。
在这个检测中，通过电泳将 HIV 蛋白分离，然后将其转移到膜上，再与患者的血清进行反应。
如果血清中存在 HIV 抗体，就会在膜上形成特定的条带。
WB 检测能够准确地确认 HIV 抗体的存在，但操作相对复杂，成本也较高。
快速检测试剂也是常用的检测手段之一。
这种检测方法操作简便、快捷，通常在 15 到 30 分钟内就能得出结果。
常见的有胶体金法和免疫层析法。
快速检测试剂适用于现场检测和初步筛查，比如在一些不具备复杂检测条件的基层医疗机构或紧急情况下使用。
核酸检测技术在艾滋病的诊断中也发挥着重要作用。
核酸检测主要是检测 HIV 的 RNA 或 DNA。
这种检测方法能够在感染后的早期就检测出病毒，大大缩短了检测的“窗口期”。
对于急性期感染、晚期艾滋病患者、婴儿感染诊断以及监测治疗效果等方面具有重要意义。
病毒培养法是一种直接检测病毒的方法，但由于其操作难度大、成本高、对实验条件要求苛刻，一般不作为常规的检测手段。
不过，在一些特殊的研究和疑难病例的诊断中，病毒培养法仍有其不可替代的作用。
除了以上这些实验室检测技术，还有一些基于唾液、尿液等样本的检测方法正在不断发展和完善。
唾液检测相对方便，患者的接受度较高。
尿液检测则具有无创、易于采集的优点。
艾滋病病毒结构蛋白与IFNα-2b表达产物的细胞免疫
或 Ｄ Ｅ 培养增殖 ， Ｍ Ｍ） 维持液为含 ５ ％小牛血清的
Ｍ ＥＭ 。
清 抗 体 Ａ ４０值 。 以 生 理 盐 水 组 为 阴 性 对 照 、 ９ Ｈ Ｖ一１ 克隆抗 体 为 阳性 对照 ， Ｉ 单 观察 重组 痘 苗病
毒 ｐ １ｅ ｖ ＩＮ ｔ ｂ及 ｐ３ ｇｇ ＩＮ ￣ ｂ组 与 Ｊ６ ｎ／ Ｆ ｏ一２ Ｊ８ ａ／ Ｆ ｃ一２ 对 照组之 间的变化 关 系。
较强 的细胞免疫 。重组痘苗病毒体外 与 Ｈ Ｖ一１ａ Ｉ ｇｇ阳性血清发生特异性反应 ， 具有免疫原性和免疫反应性。 关键 词 重组痘苗病毒 免疫原性 细胞 免疫
外膜 蛋 白 ｅｖ与核 心 蛋 白 ｇｇ均是 艾 滋 病 毒 ｎ ａ
公 司和 华 美 生 物 工 程 公 司 。ＨＩ 一１抗 体 购 自 Ｖ Ｓｇ 公 司 。碱性磷 酸 酶标记 的羊 抗 鼠 ＩＧ、 ＣＰ ｉ ｍａ ｇ Ｂ Ｉ 和 Ｎ Ｔ等均 为华美 公 司产 品 。 Ｂ
Ｈ 阴性 蚀 斑 ， 冻融 ３次 ， Ａ一 再 如此 反 复 纯 化 ３～４ 代， 备用 。 １ ４ ４ 动 物 实 验 将 重 组 痘 苗 病 毒 ｐ１ ｅ ｖ ．． Ｊ６ ｎ／ ＩＮ ￣ ２ Ｆ ｃ一 ｂ和 ｐ３ ｇｇ ＩＮ ￣ ２ Ｊ８ ａ／Ｆ ｃ一 ｂ按 １×１ １ ０ ＭＯ 分
１ ２质 粒 与 菌 株 克 隆 载 体 为 ｐ Ｖ ８ 含 有 ． Ｂ ８９（
ＩＮ ￣ ２ 基因片段） 中间载体 ｐ Ｃ ９ 表达载体 Ｆ ｃ一 ｂ ， Ｕ １， 质 粒 为 ｐ Ｆ １ 、 Ｓ Ｊ ８ 简称 ｐ １ ， Ｊ８ ， ｏｉ Ｓ Ｊ６ ｐ Ｆ３ （ Ｊ６ ｐ３ ） Ｅ Ｃ ｌ
《 部医》 沈 队药 阳
膂
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２ ２１ ・
重组优势t、b细胞表位的猪圆环病毒2型cap蛋白的原核表达及免疫原性研究
epitopes on the immunogenicity of Cap protein. The T and B cells epitopes in PCV2 Rep and Cap proteins identified in our
previous research were used to construct the recombinant plasmids together this shortened Cap gene (pET-rB-Cap, pET-rT-Cap
龄～6 周龄的 BALB/c 雌鼠随机分为 7 组，分别免疫不同的重组蛋白或者全病毒灭活疫苗，并对其产生的免疫原
性进行检测。结果显示，各实验组小鼠的血清抗体水平均显著高于 PBS 组( <0.01)，其中 rT-B-Cap 组小鼠抗体水
平显著高于 PCV2 全病毒灭活疫苗组和 rCap 组( <0.01)。综上所述，PCV2 Cap 蛋白同时串联 T、B 优势抗原表位
(College of Veterinary Medicine, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China)
Abstract: The purpose of this study was to explore the effect of porcine circovirus type 2 (PCV2) dominant T and B cell
experimental groups than that in PBS control group ( <0.01). Meanwhile, the antibody levels was significantly higher in rT-B-Cap
蛋白表达鉴定
蛋白表达鉴定
蛋白表达鉴定是生物学研究中的重要环节，主要用于检测蛋白质在细胞或组织中的表达水平。
常用的蛋白表达鉴定方法包括免疫组化法（IHC）、免疫印迹法（WB）以及质谱分析等。
1.免疫组化法（IHC）：这是一种在组织或细胞水平上检测蛋白表达的方法。
它利
用已知的特异性抗体或抗原能特异性结合的特点，通过化学反应使标记抗体的显色剂显色，从而对组织细胞内的抗原（主要为蛋白质）进行定性、定位及相对定量研究。
2.免疫印迹法（WB）：又称蛋白质印迹，主要利用SDS-PAGE技术将蛋白质按
分子量的大小进行分离，然后用电转移的方法将蛋白转移到固相膜上，再利用特定的抗体进行检测。
这种方法可以确定蛋白质的分子量、组成和纯度。
3.质谱分析：质谱技术可用于蛋白质组学的定量研究，是实现蛋白表达水平检测
的重要手段。
除了以上方法，近年来兴起的CITE-seq技术也可以用于蛋白表达鉴定。
这种技术可以一次性获得单个细胞的mRNA和蛋白的表达量，从而提高了细胞亚群分类的精度，并有助于识别罕见的细胞亚群。
总的来说，蛋白表达鉴定是一个复杂而精细的过程，需要多种方法的结合使用，以确保结果的准确性和可靠性。
在实际研究中，应根据具体的实验需求和条件选择合适的方法进行蛋白表达鉴定。
几种HIV抗体免疫检测技术
几种HIV抗体免疫检测技术艾滋病全称：获得性免疫缺陷综合征，英文简写：HIV，是一种危害性极严重的传染病，是因为受到HIV病毒感染所导致的疾病，HIV病毒是一种以攻击人体免疫系统的病毒。
目前我国的艾滋病患病率一直呈现出上升的趋势，面对这种情况就需要采取相应的措施以控制艾滋病患病率上升的趋势，此刻便对我国现目前的几种HIV抗体免疫检测技术方法进行科普，通过几种HIV抗体免疫检测技术使得医院能够尽早的发现HIV病感染者，对其进行相应的治疗和健康教育，避免HIV病毒的传染传播。
一、ELISA和WB检测技术ELISA：此种检测技术，主要是以病毒抗原包被反应板，运用间接法原理检测HIV抗体，其中这种检测技术拥有四代试剂：第一代ELISA试剂：抗原是HIV全病毒裂解物，特点是能够有效地检测出HIV，存在一定的假阳性率。
第二代ELISA试剂：抗原在细菌或者是真菌当中表达的人工重组HIV抗原或化学合成的HIV 抗原多肽，特点是单一性的抗原取代了多样性的混合抗原，其特异性要比第一代ELISA试剂好。
第三代ELISA试剂：合成的HIV抗原多肽（有些用了重组抗原），特点是应用了双抗原夹心法原理来检测HIV抗体，能够同时检测HIV-1 IgG、IgM、IgA 抗体，并且其敏感性与特异性都要比第一代ELISA试剂和第二代ELISA试剂还好。
第四代ELISA试剂：第四代ELISA试剂主要是在第三代的基础上针对P24抗原和HIV-1抗原一起包被固相载体，特点是能够同时检测 HIV-1 IgG、IgM、IgA 抗体和P24 抗原。
WB检测技术：WB检测技术是属于体外检测和鉴定HIV抗体的方法，主要是用于确证ELISA 检测阳性的个体。
其原理是以病毒抗原、重组抗原或合成肽，在SDA-PAGE电泳后转至硝酸纤维素膜上，随后再与血清或血浆中的HIV的抗体结合，最后通过显色反应来确定条带的存在。
二、HIV抗体快速检测技术关于HIV抗体快速检测技术是建立在ELISA和WB的检测基础上发展的，其主要的特点是能够在较短的时间内通过相对简单的操作就能够及时并且较准确地得到检测结果。
b细胞识别的抗原表位
b细胞识别的抗原表位引言b细胞是免疫系统中的一类重要细胞，它们具有在身体抗病毒和细菌等外源性抗原入侵时起到关键作用的能力。
b细胞通过识别抗原表位来激活并产生抗体，从而对抗疾病的发生和发展起到重要的保护作用。
本文将探讨b细胞识别的抗原表位的相关概念、机制以及其在免疫应答中的作用。
抗原表位的概念抗原表位是指能被免疫系统中的抗体、t细胞受体等识别并与之结合的抗原分子上的特定区域。
它们通常是由抗原分子上的氨基酸残基组成的，可以是线性的或者是三维空间结构上的特定区域。
b细胞主要通过识别抗原分子上的线性表位进行抗原识别。
b细胞识别抗原表位的机制b细胞通过其表面上的b细胞受体（bcr）来识别抗原表位。
bcr是由可变区和恒定区组成的跨膜受体，其可变区可以与抗原表位结合。
b细胞的bcr通过其可变区的抗原结合位点识别抗原表位上的特定氨基酸序列，从而激活b细胞并导致抗体的产生。
b细胞受体的可变区由多个基因片段的重组形成，这种基因重组的机制称为vdj重组。
在发育过程中，b细胞通过vdj重组产生多样的bcr，每个b细胞都具有不同的抗原识别特性。
当病原体入侵机体时，具有与抗原表位匹配的b细胞可以与其结合，并启动相应的免疫应答。
b细胞识别抗原表位的影响因素b细胞的抗原识别能力受到多个因素的影响，包括抗原表位的结构、抗原的浓度、代表识别能力的b细胞受体的亲和力等。
抗原表位的结构抗原表位的结构决定了它与b细胞受体的结合能力。
一般来说，线性表位更容易被b细胞识别，而三维空间结构上的表位则需要b细胞受体的可变区进行更精确的结合。
抗原的浓度抗原的浓度也会影响b细胞的抗原识别。
高浓度的抗原可以更容易地与b细胞受体结合，从而激活b细胞。
而低浓度的抗原则需要更高亲和力的b细胞受体进行识别。
b细胞受体的亲和力b细胞受体的亲和力是指其与抗原表位结合的力度。
亲和力较高的b细胞受体对抗原的识别更为敏感，可以较快地被激活并产生抗体。
而亲和力较低的b细胞受体则需要更高浓度的抗原来实现识别。
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对众多的传染性疾病、 过敏性疾病及自身免疫性疾病而言， 其病人血清中的特异抗体 是引起免疫保护和免疫病理损伤的主要因素， 从而成为能够反映病原体的致病性质和宿 主的免疫状况的重要 “信息库” ； 原病原体上的相应抗原表位也成为研制特异诊断试剂和 疫苗的靶标。目前常用的分析蛋白质抗原表位的方法均需要有高纯度的抗原、 或编码抗 原的基因序列， 这使得对那些复杂或未知病原体的表位分析工作无法进行。 新近发展的噬菌体递呈随机肽库 （4 ） 技术， 已被广 D 5 EF 2 G H 5 5 6 F 3 K4 E L 2 F E H 2 1 J 5 J / 4 IJ 4 I 泛用于蛋白质分子间相互作用研究， 包括抗原—抗体系统。以随机肽库的高度多样性、 敏 感而独特的筛选方法和抗原—抗体反应的特异性作为理论基础， 随机肽库相关技术可能 成为诠释病人血清抗体 “信息库” 的一种途径。基于此， 我们设计了一种新的表位分析方 法， 成功地从艾滋病病人血清中筛选出了位于 + 构型特异 , -/ = ! 处膜蛋白的高亲和力、 4 的 . 细胞抗原表位， 并利用大肠杆菌的硫氧还蛋白作为骨架， 以 “内融合” 的形式表达了 单个抗原表位， 经7 纯化的重组蛋白具有良好的抗原性。 8 , 9 : 鉴定，
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! 材料和方法
! M ! 主要试剂 @ O 噬菌体递呈随机十二肽库试剂盒 （N ） 购 D M ;M ’ ! ( N D 5 E; 2 G H 5 E L 2 F E8 2 1 J 5 J 2 L / 4 IN 4 I?
作者简介： 杜勇 （ ， 男， 江苏邳县人， 军事医学科学院微生物流行病研究所副研究员， 博士， 主要从事病毒 ! " # $ %） 的分子生物学研究 收稿日期： ， 修回日期： ! " " & ’ ! ( ’ ( ! ! " " " ’ ) $ ’ ! *
# 结果
# $ ! . ( / 病人血清特异( 1 抗体滴度测定 0 为保证淘洗和吸附过程的特异性， 首先用双抗原夹心法检测了所制备的 C （ F） 和 D E （G） 血清抗体， 结果显示， 高稀释度的 C （F） 抗体仍可以和 C 即使 C D E D E D E 抗原发生反应， 总抗体浓度稀释至! ／ ， 其! （ ） ， 说明总抗体中存在着高滴度 ) + " # ( ! & " * N O #还远高于临界值 ! 的抗 C 这确保了淘洗的敏感性； （G） 抗体和 C 这保证 D E 抗体， C D E D E 抗原之间无明显反应， 了吸附过程中， 不至于吸附掉目的噬菌体克隆。 # # 阳性噬菌体克隆的筛选 用C （ F） （ G） 共检测 O D E D >和 C D E D > 检测第三轮淘洗—吸附后的噬菌体克隆， P * * 个样品， 其中与 C （ F） 而与 C （ G） 阳性率为! D E D > 结合、 D E D > 不结合的有" #个， # ( N 3 * * （ ／ ） （图! ） 。 " # O P # 2 阳性噬菌体递呈肽的氨基酸序列特征 对? 其编码氨基酸的密码子 + D 0 = 检测阳性的! $个噬菌体克隆进行 < H = 序列测定， 均为 H （H’>7 H L 5=7 547 5Y； L’> ， 这和构建随机肽库所用的寡核苷 7 54） 酸序列特征一致， 说明所测序列确为随 机肽库的递呈 片 段。这 ! $ 个 序 列 中， 出现 了 完 全 相 同 的 序 列。 推 导 上 述 即为阳性噬 < H = 序列所编码的氨基酸， 菌体 递 呈 肽 的 氨 基 酸 序 列 （图 "） 。! $ 个阳性递呈肽可分为五组， 分析这五组 可以发现每组序列都有间 图! 阳性噬菌体与 C （ F） ／ （ G） D E C D E D > 的免疫反应 氨基酸序列， *