测定叶绿素a和b的方法及其计算完整版
测定叶绿素a和b的方
法及其计算
Document serial number【NL89WT-NY98YT-NC8CB-NNUUT-NUT108】
实验二十五测定叶绿素a和b的方法及其计算
一目的要求：
熟悉在未经分离的叶绿体色素溶液中测定叶绿素a和b的方法及其计算。
二实验原理：
如果混合液中的两个组分，它们的光谱吸收峰虽然有明显的差异，但吸收曲线彼此有些重叠，在这种情况下要分别测定两个组分，可根据Lambert-Beer定律，通过代数方法，计算一种组分由于另一种组分存在时对光密度的影响，最后分别得到两种组分的含量。
如图z-4叶绿素a和b的吸收光谱曲线，叶绿素a的最大吸收峰在663nm，叶绿素b在645nm，吸收曲线彼此又有重叠。
图z-4 叶绿素a和b的吸收光谱曲线
横坐标为波长（nm），纵坐标为比吸收系数
根据Lambert-Beer定律，最大吸收光谱峰不同的两个组分的混合液，它们的浓度C与光密度OD之间有如下的关系：
OD1=Ca·ka1+Cb·kb1 （1）
OD2=Ca·ka2+Cb·kb2
（2）
式中：Ca为组分a的浓度，g/L。
Cb为组分b的浓度，g/L。
OD1为在波长λ1（即组分a的最大吸收峰波长）时，混合液的光密度OD值。
OD2为在波长λ2（即组分b的最大吸收峰波长）时，混合液的光密度OD值。
ka1为组分a的比吸收系数，即组分a当浓度为1g/L时，于波长λ1时的光密度OD值。
kb2为组分b的比吸收系数，即组分b当浓度为1g/L时，于波长λ2时的光密度OD值。
ka2为组分a（浓度为1g/L），于波长λ2时的光密度OD值。
kb1为组分b（浓度为1g/L），于波长λ1时的光密度OD值。
从文献中可以查到叶绿素a和b的80%丙酮溶液，当浓度为1g/L时，比吸收系数k值如下：
将表中数值代入上式（1）、（2），则得：
OD663=×Ca+×Cb
OD645=×Ca+×Cb
经过整理之后，即得到下式：
Ca= OD645
Cb= OD663
如果把Ca，Cb的浓度单位从原来的g/L改为mg/L，则上式可改写为下列形式：
Ca= OD645
（3）
Cb= OD663
（4）
CT= Ca+ Cb= OD663+ OD645
（5）
（5）式中CT为总叶绿素浓度，单位为mg/L。
利用上面（3）、（4）、（5）式，即可计算出叶绿素a和b及总叶绿素的浓度
（mg/L）。
[附注]一般大学教学实验室所用的分光度计多为721型，属低级类型，其单色光的半波宽要比中级类型的751型宽得多，而叶绿素a和b吸收峰的波长相差仅18nm（663-645nm），难以达到精确测定。此外有时还由于仪器本身的标称波长与实际波长不符，
测定的正确性就更差，不适用于测定。751型有时也由于波长不够准确，会带来一定误差。可用叶绿素对波长进行校正。
为校正仪器波长所需的叶绿素a和b的需要量很少，用纸层析法很快就能分离制得。取植物叶子约1g，用乙醚提取叶绿体色素，再用毛细管将色素溶液画在3mm厚滤纸上使成一直线，为使分离效果好，一般重复点样一次即可。然后于密闭容器中进行上行层析，溶剂为含有%丙酮的石油醚。层析结束，用剪刀小心地剪下蓝绿色的叶绿素a和黄绿色的叶绿素b，注意剪时尽量避开分层不清晰的色区。最后分别浸于80%丙酮中，洗下叶绿素a和b。
三实验器材与试剂：
1．实验仪器高级型分光光度计、离心机、台天平、剪刀、研钵、漏斗、移液管。
2．实验试剂丙酮、碳酸钙。
3．实验材料植物叶片。
四操作步骤：
1、色素的提取：取新鲜叶片，剪去粗大的叶脉并剪成碎块，称取放入研钵中加纯丙酮5ml，少许碳酸钙和石英砂，研磨成匀浆，将匀浆转入量筒中，并用适量80%丙酮洗涤研钵，用80%丙酮定容至10ml，吸取加入有10ml80%丙酮的量筒中，过滤，滤液备用。
2、测定光密度：取上述色素提取液4ml，转入比色杯中，以80%丙酮为对照，分别测定663nm、645nm处的光密度值。
3、按公式（3）、（4）、（5）分别计算色素提取液中叶绿素a、叶绿素b、及叶绿素a+b的浓度。再根据稀释倍数分别计算每g鲜重叶片中色素的含量。
【注意事项】
1.由于植物叶子中含有水分，故先用纯丙酮进行提取，以使色素提取液中丙酮的最终浓度近似80%。
2.由于叶绿素a、b的吸收峰很陡，仪器波长稍有偏差，就会使结果产生很大的误差，因此最好能用波长较正确的高级型分光光度计。
五作业：
1、试比较阴生植物和阳生植物的叶绿素ab的比值有无不同。
2、分光光度法和比色法有何异同
叶绿素a和b在红光区和蓝光区都有最大吸收峰，能否用蓝光区的最大吸收峰波长进行叶绿素a和b的定量分析，为什么
植物叶绿素测定方法
叶绿素含量的测定 一、原理 根据叶绿体色素提取液对可见光谱的吸收，利用分光光度计在某一特定波长测定其吸光度，即可用公式计算出提取液中各色素的含量。根据朗伯—比尔定律，某有色溶液的吸光度A与其中溶质浓度C和液层厚度L成正比，即A＝αCL式中：α比例常数。当溶液浓度以百分浓度为单位，液层厚度为1cm时，α为该物质的吸光系数。各种有色物质溶液在不同波长下的吸光系数可通过测定已知浓度的纯物质在不同波长下的吸光度而求得。如果溶液中有数种吸光物质，则此混合液在某一波长下的总吸光度等于各组分在相应波长下吸光度的总和。这就是吸光度的加和性。今欲测定叶绿体色素混合提取液中叶绿素a、b和类胡萝卜素的含量，只需测定该提取液在三个特定波长下的吸光度A，并根据叶绿素a、b 及类胡萝卜素在该波长下的吸光系数即可求出其浓度。在测定叶绿素a、b时为了排除类胡萝卜素的干扰，所用单色光的波长选择叶绿素在红光区的最大吸收峰。 二、材料、仪器设备及试剂 （一）材料：新鲜（或烘干）的植物叶片。 （二）仪器设备：1）分光光度计；2）电子顶载天平（感量0.01g）；3）研钵；4）棕色容量瓶； 5）小漏斗；6）定量滤纸；7）吸水纸； 8）擦境纸；9）滴管。 （三）试剂：1）95%乙醇（或80%丙酮）（v丙酮：v乙醇=2：1的95%水溶液）；2）石英砂；3）碳酸钙粉。暗中2h，0.5g，25ml 三、实验步骤 1）取新鲜植物叶片（或其它绿色组织）或干材料，擦净组织表面污物，剪碎（去掉中脉），混匀。 2）称取剪碎的新鲜样品 0.2g ，共3份，分别放入研钵中，加少量石英砂和碳酸钙粉及2～3ml 95%乙醇，研成均浆，再加乙醇10ml，继续研磨至组织变白。静置3～5m 3）取滤纸1张，置漏斗中，用乙醇湿润，沿玻棒把提取液倒入漏斗中，过滤到25ml棕色容量瓶中，用少量乙醇冲洗研钵、研棒及残渣数次，最后连同残渣一起倒入漏斗中。 4）用滴管吸取乙醇，将滤纸上的叶绿体色素全部洗入容量瓶中。直至滤纸和残渣中无绿色为止。最后用乙醇定容至25ml，摇匀。 5）把叶绿体色素提取液倒入光径1cm的比色杯内，以95%乙醇为空白，在波长663nm 和645nm下测定吸光度。在波长663nm、645nm下或652nm测定吸光度。 四、实验结果计算 叶绿素a的含量 = 12.7 ? OD 663 – 2.69 ? OD 645 叶绿素a的含量 = 22.9 ? OD 645 – 4.86 ? OD 663 叶绿素a、b的总含量 = 8.02 ? OD 663 + 20.20 ? OD 645
叶绿素的提取分离
华南师范大学实验报告 生姓名罗玉玲学号 20102501014 业生物科学年级、班级 10科四 程名称植物生理学实验实验项目植物生理学第一次实验 验类型□验证□设计□综合实验时间 2012 年 11 月 8 日 实验指导老师叶庆生、冷佳奕实验评分 绿体色素的提取、分离及理化性质的鉴定 1.实验目的 1.1学会叶绿体色素提取和分离的方法。 1.2了解叶绿体色素的荧光现象、皂化反应等理化性质。 2.实验原理 2.1叶绿体中含有绿色素（包括叶绿素a和叶绿素b）和黄色素（包括胡萝卜素和叶黄素）两大 类，这两类色素都不溶于水，而溶于有机溶剂，故可用乙醇或丙酮等有机溶剂提取。 2.2叶绿素是二羧酸酯，与强碱反应形成绿色的可溶性叶绿素盐，可与有机溶剂中的类胡萝卜素分 开；在酸性或加温条件下，叶绿素卟啉环中的Mg2+可依次被H+和Cu2+取代，形成褐色的去镁叶绿 素和绿色的铜代叶绿素；叶绿素受光激发，可发出红色荧光，反射光下可见红色荧光。 3.实验器材和试剂 3.1实验仪器与器具 研钵、漏斗、剪刀、、圆形滤纸、分光光度计、电子天平、量筒、移液管、滴管、试管、试 管架、酒精灯等 3.2实验试剂 丙酮、石英砂、碳酸钙、四氯化碳、无水氯化钠、乙醚等 3.3实验材料
勒杜鹃叶片 4.实验步骤 4.1叶绿素提取 取2g 勒杜鹃叶片 去掉主脉，剪碎 研磨 圆形滤纸过滤 收集提取液 4.2荧光现象观察 透射光下观察溶液颜色 叶绿素提取液 反色光下观察溶液颜色 4.3光对叶绿素的破坏作用 色素提取液少许等量分装于两试管 一支处于黑暗 、另一支于太阳光下 经2h 后观察两支试管的颜色 4.4铜代反应 取一支作为对照 各取色素提取液2ml 于两支试管中 取另一支 变褐色后 观察颜色的变化 4.5皂化反应 加入20mL 丙酮 少量乙酸铜粉末 滴加一滴稀盐酸 少量石英砂、碳酸钙 △
遮光后叶绿素含量升高和叶绿素a和b比值降低的原因
遮光后叶绿素含量升高和叶绿素a/b降低的原因 试题：如图，叶绿素的含量随着遮光比例的升高而升高，遮光后叶绿素a/b 降低，捕光能力上升。原因。 因为学生知道，光是叶绿素形成的必需条件，所以大部分学生都错误认为叶绿素含量随光照增强而增加。 从资料中可以看出，这些变化都是为了适应植物在遮光条件下的生长。 一、遮光后叶绿素含量为什么会升高 叶绿素含量受到光照、温度、矿质元素、逆境等外界因素及核基因、质基因等内在因素的共同影响，在外部因素中光对叶绿素的合成与分解起主导作用。植物体中叶绿素的合成和分解处于一个动态平衡中，叶片光照后，才能顺利地合成叶绿素，但形成叶绿素所要求光照强度相对较低，当然过弱也不利于叶绿素的生物合成，除680nm以上波长以外，可见光中各种波长的光照都能促使叶绿素形成，光过强反而会发生光氧化而受破坏。 植物中叶绿素和蛋白质结合为结合态叶绿素才能发挥作用，而自由态的叶绿素则会对细胞造成光氧化损伤。为了避免自由态叶绿素对细胞造成的光氧化损伤，植物必须快速降解这些物质。 在遮光条件下，集光色素蛋白在光合单位中的相对含量会增加，从而导致结合态叶绿素增加。与此同时，降低了叶绿素的降解和光氧化，所以遮光后叶绿素的含量会增加。 遮荫环境下，植物通过增加单位叶面积色素密度和叶绿素含量，有利于提高植株的捕光能力，吸收更多的光，提高光能利用率，是对弱光环境的一种适应。 二、遮光后叶绿素a/b降低 在不同生理条件下，叶绿素a和叶绿素b的合成、分解速度影响了叶绿素a/b的比值，但调节叶绿素a/b的比值主要通过“叶绿素循环”实现。叶绿素a 和叶绿素b的相互转化称为“叶绿素循环”。 在遮光条件下，叶绿素a向叶绿素b的转化加快，叶绿素a水解形成脱植基叶绿素a，脱植基叶绿素a再转化为脱植基叶绿素b，最后合成叶绿素b，从而降低了叶绿素a/b的比值。弱光下叶绿素b的相对含量增高是有其生理适应，有利于对弱光的利用。
叶绿素提取实验
实验二、叶绿体色素的提取、分离与性质分析 一、实验目的 ?掌握叶绿体色素的提取方法；掌握板层析法分离叶绿体色素的原理和步骤；掌握叶绿体色素的部分理化性质。 二、实验原理 （一）叶绿体色素： 1.叶绿素 叶绿素a：叶绿素b=3：1 2.类胡萝卜素 胡萝卜素：叶黄素=2：1 叶绿素：类胡萝卜素=3：1 （二）叶绿素的光学性质 叶绿素a在663nm有吸收峰；叶绿素b 在645nm有吸收峰。但在蓝光区也有一个吸收峰。 胡萝卜素和叶黄素的吸收峰是在蓝光区（440nm）。 三、叶绿素含量测定： 1．取新鲜叶片，擦净组织表面污物，剪碎（去掉中脉）混匀。 2．称取剪碎的新鲜样品1.0g ，放入研钵中，加少量石英砂及2－3ml （或80％丙酮）研成匀浆，继续研磨至组织变白，静置3－5分。 3．取滤纸1张，置漏斗中，用80％丙酮湿润，沿玻棒把提取液倒人漏斗中，过滤到25ml。 4．用滴管吸取80％丙酮，将滤纸上的叶绿体色素全部洗入容量瓶中。 直至滤纸和残渣中无绿色为止。最后用80％丙酮定容至25ml，摇匀。 5．把叶绿体色素提取液倒入比色杯内。以80％丙酮为空白，在波长663nm、645nm下测定吸光度。 6 计算：按下列公式： Ca(mg/L)=12.7OD663-2.69 OD645 Cb (mg/L) =22.9OD645-4.68 OD663 C总(mg/L) = Ca+ Cb分别计算叶绿素a、b的浓度。 四、光合色素鉴定（板层析） ?支持物：硅胶层析板 ?流动相：石油醚：丙酮：（v：v=65：35） ?步骤：1、取板划线 2、点样 3、配展开剂 4、展开 5、前沿到达2/3处时停止，取出凉干并观察各色素带计算Rf值 叶绿素a：蓝绿色；叶绿素b：黄绿色；胡萝卜素：桔黄色 叶黄素：黄色 六：叶绿素前驱物的荧光观察 七、作业 1、计算你的实验中植物叶片中叶绿素的含量。 ２．研磨提取叶绿素时，为何要加入CaCO3？ ３．画图说明叶绿体色素板层析结果，并解释原因。
不同环境条件下植物叶绿素a、b含量地比较
一、实验课题名称：不同环境条件下植物叶绿素a、b含量的比较 二、选题背景或文献综述： 《植物生理学实验指导》（第四版）、《植物生理学》（第六版）、上网查阅相关资料 阴生植物也称“阴性植物”，是在较弱的光照条件下生长良好的植物，但并不是阴生植物对光照强度的要求越弱越好，而是必须达到阴生植物的补偿点，植物才能正常生长，阳生植物也称“阳性植物”，光照强度对植物的生长发育及形态结构的形成有重要作用，在强光环境中生长发育健壮，在阴蔽和弱光条件下生长发育不良的植物称阳性植物，这类植物要求全日照，并且在水分、温度等条件适合的情况下，不存在光照过强的问题。 阳生植物和阴生植物的区别:关于光的饱和点和补偿点光是光合作用的能量来源，光照强度直接影响光合速率，在其它条件都适宜的情况下，在一定范围内，光合速率随光照强度提高而加快，当光照强度高到一定数值后，光照强度再提高而光合速率不再加快，这种现象叫光饱和现象。开始达到光饱和现象的光照强度称为光饱和点，在光饱和点以下，随着光照强度减弱，光合速率减慢，当减弱到一定光照强度时，光合作用吸收二氧化碳量与呼吸释放二氧化碳的量处于动态平衡，这时的光照强度称为光补偿点。此时植物制造有机物量和消耗有机物量相等，不同类型植物的光饱和点和
补偿点是不同的，阳性植物的光饱和点和补偿点一般都高于阴性植物。 结构和特性的区别:阴生植物的叶片的疏导组织比阳生植物稀疏，以叶绿体来说，阳生植物有较大的基粒，基粒片层数目多的多，叶绿素含量也高，阴生植物在较低的光照条件下充分的吸收光线，叶绿素a/叶绿素b的比值小，能够强烈的利用蓝紫光，阳性植物叶片小而厚，表面具蜡质或绒毛，叶脉密，单位面积内气孔多，叶绿素含量高，体内含盐分多，渗透压高，可以抗高温干旱，阳生植物的气孔一般在叶片下表皮分布的数量多于上表皮，这样可以避免阳光直晒而减少水分散失，阳生植物的呼吸速率高于阴生植物。 区分阳生植物与阴生植物，主要是根据植物对光照强度需要的不同，阳生植物要求充分直射日光才能生长或生长良好，阴生植物适宜于生长在荫蔽环境中，它们在完全日照下反而生长不良或不能生长，阳生植物和阴生植物之所以能适应不同光照，是与它们的生理特征和形态特征不同有关，以光饱和点来说，阳生植物的光饱合点是全光照（即全部太阳光照）的100％，而阴生植物是全光照的10％～50％。因为阴生植物叶片的输导组织比阳生植物的稀疏，当光照强度增大时，水分对叶片的供给不足，阴生植物便不再增加光合速率，以叶绿体来说，阴生植物与阳生植物相比，前者有较大的基粒，基粒片层数目多，叶绿素含量较高，能在较低光照强度下充分
叶绿素的不同提取法的提取效果比较
叶绿素的不同提取法的提取效果比较 中国农业仪器网更新时间：2010-9-28 15:34:23阅读23次 叶绿素的不同提取法的提取效果比较 叶片中叶绿素分子结构与人体内的血液分子相似，非常易溶入红细胞中，能抑制细菌、排出毒素，有“绿色血液”之称。同时叶绿素含量的测量能让我们了解植物缺氮的情况，叶绿素又是影响植物光合作用的重要因素，叶绿素的测量可以使用专业的测量仪器来进行快速的测量，比如使用便携式叶绿素测定仪来进行测量，同时叶绿素还可以使用常规的方法来进行，先对叶片进行提取在进行测量，不过在进行叶片提取的时候，提取方法不同还是会影响结果的。 叶绿素的提取方法有三种，分别为研磨法、浸提法、冷冻浸提法对于叶绿素a、b提取结果表现一致，以冷冻浸提法提取效果最好，其次为研磨法，再次为浸提法。 浸提法提取效果最差，一方面可能提取不完全，也可能在提取的过程中叶绿素有分解，相对冷冻浸提法，由于经过了冷冻过程破碎了细胞，提取完全而且提取过程快减少了叶绿素分解，效果最好。研磨法在研磨、过滤等操作的过程中有损失，而且提取时间过程长造成弱光下叶绿素的分解，效果不及冷冻浸提法。 叶绿素含量在提取过程中会造成一定的误差，而且测量的时间花费比较的久，同时在进行测量的时候必须将叶片采集下来之后才能进行测量，对植株造成一定的影响，也不方便在
室外进行操作，而使用手持叶绿素仪就可以避免以上的问题，操作快捷，方便在室外进行操作，同时有时无损伤的进行测量。 比较了不同有机溶剂直接浸提法和Arnon法从冷冻处理前后的玉米叶片中提取叶绿素的效率。结果表明:在室温(10℃)下浸提和冷冻处理后浸提,丙酮和乙醇(甲醇)的混合液比同类含水的提取液要好,其中丙酮∶乙醇为11∶提取液提取叶绿素快而完全,表现最好;丙酮∶乙醇∶水为4.54∶.51∶提取液最慢,丙酮∶甲醇∶水为 4.54∶.51∶提取液提取量最少;冷冻处理后叶绿素效率明显提高,其中丙酮∶乙醇为11∶提取液提取速度加快最明显。在玉米田间大量样本叶绿素测定时进行冷冻处理,既能提高叶绿素浸提的效率,又能适当储存,调节用工高峰,值得推广使用。 https://www.360docs.net/doc/492216117.html,/view/77e3dd2f2af90242a895e5f5.htmll
叶绿素测定方法
实验三十三叶绿素含量的测定(分光光度法) 根据朗伯-比尔（Lambert-Beer）定律，某有色溶液的吸光度A值与其中溶质浓度C以及光径L成正比，即A＝aCL（a为该物质的吸光系数）。各种有色物质溶液在不同波长下的吸光值可通过测定已知浓度的纯物质在不同波长下的吸光度而求得。如果溶液中有数种吸光物质，则此混合液在某一波长下的总吸光度等于各组分在相应波长下的吸光度的总和，这就是吸光度的加和性。今欲测定叶绿体色素提取液中叶绿素a、b含量，只需测定该提取液在2个特定波长下的吸光度度值，并根据叶绿素a与b在该波长下的吸光系数即可求出各自的浓度。在测定叶绿素a、b含量时，为了排除类胡萝卜素的干扰，所用单色光的波长应选择叶绿素在红光区的最大吸收峰。 已知叶绿素a、b的80％丙酮提取液在红光区的最大吸收峰分别为663nm和645nm，又知在波长663nm下，叶绿素a、b在该溶液中的比吸收系数分别为82.04和9.27，在波长645nm 下分别为16.75和45.60，可根据加和性原则列出以下关系式： A663=82.04Ca+9.27Cb (1) A645=16.75Ca+45.6Cb (2) 式中A663、A664分别为波长663nm和645nm处测定叶绿素溶液的吸光度值；Ca、Cb分别为叶绿素a、b的浓度(g/L)。 解联立方程(1)、(2)可得以下方程： Ca=0.0127A663-0.00269A645 (3) Cb=0.0229A645-0.00468A663 (4) 如把叶绿素含量单位由g/L改为mg/L，(3)、(4)式则可改写为： Ca(mg/L)=12.7A663-2.69A645 (5) Cb(mg/L)=22.9A645-4.68A663 (6) 叶绿素总量CT(mg/L)=Ca+Cb=20.2A645+8.02A663 (7) 叶绿素总量也可根据下式求导 A652=34.5×CT 由于652nm为叶绿素a与b在红光区吸收光谱曲线的交叉点(等吸收点)，两者有相同的比吸收系数（均为34.5），因此也可以在此波长下测定一次吸光度（A652）求出叶绿素总量：CT(g/L)=A652/34.5 CT(mg/L)=A652×1000/34.5 (8) 因此，可利用(5)、(6)式可分别计算叶绿素a与b含量，利用(7)式或(8)式可计算叶绿
玉米叶片叶绿素的提取和测定
玉米叶片叶绿素的提取和测定 摘要：利用80%的丙酮提取玉米叶片中的叶绿素，再利用分光光度计测定在663nm和645nm特征波峰下的光密度值，进一步算出玉米叶绿素的含量。 关键词：叶绿素；提取；含量测定 Abstract: corn leaf chlorophyll were extracted by 80% acetone, and then the optical density were measured at the wave length of 663 and 645 nm by spectrophotometer．According to the related formulation we can circulate the Chlorophyll content. Key words: Chlorophyll，Withdraws，Determination 绿色植物吸收阳光能量，同化二氧化碳和水，制造有机物质并释放氧气的过 程，称为光合作用。光合作用所产生的有机物质主要是糖类。 光合作用能把无机物变成有机物，能蓄积太阳能，还能保护环境。这一切都 离不开叶绿素体这个细胞器，而组成叶绿体的主要成分之一是叶绿素，叶绿素的 作用就是先吸收太阳光能[5] ，然后固定CO2并与H2O同化有机物质。 除了在光合作用中起作用之外，叶绿素对人体也有相当大的作用。比如：造 血作用（叶绿素中富含微量元素铁，是天然的造血原料）、提供维生素、维持酶 的活性、解毒作用（叶绿素是最好的天然解毒剂，能预防感染，防止炎症的扩散， 还有止痛功能）、抗病强身（叶绿素在改善体质，祛病强身方面也有很多作用。 如能增强机体的耐受力；还有抗衰老、抗癌、防止基因突变等功能）。 叶绿素是植物中特有的一种成分，其他生物体内不含有叶绿素。因此，其他 生物体如动物是无法自身合成足够的能量，供给自体消耗和利用，只能从大自然 中摄取，而植物就可以自供能量。 叶绿体中主要有叶绿素：叶绿素a和叶绿素b。它们不溶于水，但能溶于酒 精、丙酮和石油醚等有机溶剂。在颜色上叶绿素a（C55H72O5N4Mg）呈蓝绿色，而叶绿素b（C55H70O6N4Mg）呈黄绿色。 叶绿素是叶绿酸的酯。叶绿酸是双羧酸，其中的两个羧基分别与甲醇（CH3OH）和叶绿醇（phytol，C20H39OH）发生酯化反应，形成叶绿素[1]。 叶绿素分子含有4个吡咯环，它们和4个甲烯基（==CH—）连接成1个大环，叫做卟啉环。镁原子居于卟啉环的中央。另外有1个含羰基和羧基的副环（同素环V），羧基以酯键和甲醇结合。叶绿醇则以酯键与在第IV吡咯环侧链上的丙酸相结合。图１是叶绿素a的结构式。叶绿素分子是一个庞大的共轭系统[7]，吸
不同环境条件下植物叶绿素a、b含量的比较(分光光度法测定)
一、实验课题名称 不同环境条件下植物叶绿素a、b含量的比较（分光光度法测定） 二、文献综述 1.叶绿素a的生物合成过程 起始物是谷氨酸，之后为5-氨基酮戊酸，两分子的ALA缩合形成胆色素原(PBG),4分子PBG相互连结形成原中卟啉IX.原卟啉IX与Mg结合形成Mg-原卟啉原IX，光下E环的环化形成，D环的还原作用和叶绿醇尾部的连接完成了整个合成过程，合成过程中的许多步骤在图中已省略 2.影响叶绿素形成的条件 （1）光光是影响叶绿素形成的主要条件。从原叶绿素酸酯转变为叶绿酸酯需要光，而光过强，叶绿素又会受光氧化而破坏。黑暗中生长的幼苗呈黄白色，遮光或埋在土中的茎叶也呈黄白色。这种因缺乏某些条件而影响叶绿素形成，使叶子发黄的现象，称为黄化现象(etiolation)。 也有例外情况，例如藻类、苔藓、蕨类和松柏科植物在黑暗中可合成叶绿素，其数量当然不如在光下形成的多；柑橘种子的子叶及莲子的胚芽在无光照的条件下也能形成叶绿素，推测这些植物中存在可代替可见光促进叶绿素合成的生物物质。 (2)温度叶绿素的生物合成是一系列酶促反应，受温度影响。叶绿素形成的最低温度约2℃，最适温度约30℃,最高温度约40℃。秋天叶子变黄和早春寒潮过后秧苗变白，都与低温抑制叶绿素形成有关。高温下叶绿素分解大于合成，因而夏天绿叶蔬菜存放不到一天就变黄；相反，温度较低时，叶绿素解体慢，这也是低温保鲜的原因之一。 (3)营养元素叶绿素的形成必须有一定的营养元素。氮和镁是叶绿素的组成成分，铁、锰、铜、锌等则在叶绿素的生物合成过程中有催化功能或其它间接作用。因此，缺少这些元素时都会引起缺绿症(chlorosis)，其中尤以氮的影响最大，因而叶色的深浅可作为衡量植株体内氮素水平高低的标志。 (4)氧缺氧能引起Mg-原卟啉IX或Mg-原卟啉甲酯的积累，影响叶绿素的合成。 (5)水缺水不但影响叶绿素生物合成，而且还促使原有叶绿素加速分解，所以干旱时叶片呈黄褐色。 通过对室外旱池处理条件下的甘薯叶片叶绿素含量变化的研究，结果表明，水分胁迫下甘薯品种叶片中叶绿素a、b及总叶
叶绿素含量测定方法(精)
叶绿素含量测定方法---丙酮法 由于微藻的生长周期比较复杂，包括无性繁殖阶段和有性繁殖阶段，其在不同阶段的生理形态不同，有时藻细胞会聚集在一起，以片状或团状形式存在，在显微镜下难以确定其所包含的细胞数量。 藻细胞中叶绿素的含量（特别是叶绿素a的含量）通常随与细胞的生长呈较好的线性关系，因此可通过测定藻细胞中叶绿素含量变化来反映微藻的生长情况。叶绿素测定采用丙酮研磨提取法。 取适量藻液于10 mL离心管中在4000 rpm转速下离心10 min，弃去上清液，藻泥中加入适量的100 %的丙酮。采用丙酮提取法时在试管研磨器中冰浴研磨5 min，4000 rpm离心后，上清液转入10 mL容量瓶中。按上述方法对藻体沉淀进行萃取，直至藻体沉淀呈白色为止。定容后，采用722S型可见分光光度计分别测定645 nm和663 nm下萃取液的吸光值，叶绿素含量用以下公式进行计算（Amon,1949）： 叶绿素a含量用以下公式进行计算： Chlorophyll a (mg/L) = (12.7×A663 nm－2.69×A645 nm)×稀释倍数 叶绿素b含量用以下公式进行计算： Chlorophyll b (mg/L) = (22.9×A645 nm－4.64×A663 nm)×稀释倍数 叶绿素总含量用以下公式进行计算： Chlorophyll a＋b (mg/L) = (20.2×A645 nm＋8.02×A663 nm)×稀释倍数 由于丙酮的沸点较低，较高温度下挥发很快。此外，叶绿素稳定性较差，见光易分解，因此，本实验中叶绿素的提取和测定均在低温黑暗条件下进行，以减少提取过程中的损失。 叶绿素提取方法 提取液：本试验用DMSO/80%丙酮(l/2，v/v)提取的叶绿素，谭桂英周百成底栖绿藻叶绿素的二甲基亚砜提取和测定法* 海洋与湖沼 1987 18（3）295--300. 一、直接浸提法： 1、准确量取10ml藻液,加到15ml离心管中，放在台式离心机离心，3500r/min （根据不同的藻选择不同那个的离心转速）离心5min倒上清；留藻泥。随后在盛有藻泥的离心管中加入蒸馏水，与藻泥混匀后再次离心，目的是除去藻细胞表面的盐份，此清洗过程重复三次。 2、往藻泥中加二甲基亚砜3.33ml，65℃水浴9h，20h； 3、然后离心，将上清转移到10ml棕色瓶中， 4、添加6.67ml80%丙酮到离心管中，混匀，离心，再将上清转移到10ml棕色瓶中。 5、定容，待测。
从菠菜中提取叶绿素实验报告三篇.doc
从菠菜中提取叶绿素实验报告三篇 从菠菜中提取叶绿素实验报告一 【实验目的】 1、通过绿色植物色素的提取和分离，了解天然物质的分离提纯与方法。 2、通过薄层色谱分离操作，加深了解微量有机物色谱分离鉴定的原理。 【实验原理】 叶绿色存在两种结构相似的形式即叶绿素 a{C55H77O5N4Mg}和叶绿素b{ C55H70O6N4Mg }；胡萝卜素是具有长链结构的共轭多烯，有三种异构体；叶黄素C40H56O2是胡萝卜素的羟基衍生物。当提取时，从上到下颜色依次为：黄绿色，蓝绿色，黄色和橙色。 【实验仪器】 研钵，色谱柱，丙酮，乙醇，乙醚，中性氧化铝，菠菜叶，烧杯，漏斗，玻璃棒，滤纸，剪刀，脱脂棉，纱布。 【实验步骤】 1、称取30g洗净后用滤纸喜感的新鲜菠菜叶，用剪刀剪碎，放入研钵中研磨，研磨时放入少量碳酸钙，防止研磨过猛破坏叶绿素结构，研磨至烂。 2、将研磨碎的菠菜叶转入小烧杯中，加入30mL配好的乙
醇乙醚溶液，盖上表面皿，防止有机溶剂蒸发。按小组成员分别浸泡10,15,20,25,30,35,40,45,50,55分钟。 3、浸泡期间，填充色谱柱，在最下面垫入脱脂棉，再盖上一个小滤纸片，装入氧化铝至4/5处，再盖上一层滤纸片。 4、将烧杯中的菠菜叶连带着有机溶剂用纱布挤入漏斗中，转入分液漏斗，加入10mL水洗涤，除去水层（下层），再用10mL 水洗涤一次。 5、将分页漏斗中的溶液慢慢倒入色谱柱中，加几滴丙酮既可以看到颜色变化。 6、洗净仪器，收拾实验室，打扫卫生。 【实验记录】 虽然分层现象不是非常明显，但是还是可以看得见分层现象。 【结果与讨论】 1、做这个实验的时候，我觉得不应该用纱布挤干，因为个人感觉很多色素都被 纱布吸走了，导致后来的实验现象没有很明显，经过对比，没用纱布直接过滤的同学做出的现象比用纱布做的现象要明显 的多。 2、有机溶剂往往比较容易挥发，所以加入后要盖上表面皿。 3、此实验浸泡15分钟以后现象就可以很明显，因此以后
叶绿素的提取与分离
叶绿体色素的提取、分离 及理化性质的测定 班级：11级生科2班 组员：XXX XX 实验名称：叶绿体色素的提取、分离及理化性质的测定
实验原理：叶绿体色素又称光合色素，在高等植物中可分为叶绿素和类胡萝卜素两大类，前者包括叶绿素a（蓝绿色）和叶绿素b（黄绿色），后者包括胡萝卜素（橙色）和叶黄素（黄色），它与们类囊体膜上的蛋白质结合形成色素蛋白复合体，不溶于水，易溶于酯，因此可用丙酮、乙醇、石油醚等有机溶剂进行提取。 层析的基本原理：在分离过程中，由一种流动相（即一种液体或气体）带动着试样经过固定相（一种支持物，如纸）向外扩散，由于试样在两相中的溶解度不同和固定相对试样中不同成分的吸附程度有别，当用适当的溶剂推动时，混合物中各成分在两相间具有不同的分配系数，所以它们的移动速度不同，经过一定时间层析后，可使试样中的各种组分得到分离，在做纸层析时，由于纸对光合色素中各种色素分子的吸附程度不同，以及这些色素分子在溶剂四氯化碳（推进剂）中溶解度也有差异，以致溶剂带动色素分子向四周移动时，各种色素分子沿纸扩散的速度也就不同，使混合色素分离，出现不同颜色的环。将提取的叶绿素溶液置于光下，在透射光呈绿色，在反射光下呈樱桃红色，种这现象称为荧光现象。在反射光下叶绿素溶液之所以呈樱桃红色，是因为叶绿色分子吸收光能后处于激状发态，激发态的叶绿素分子很不稳定，当它回到基态时，将所获得的能量以辐射能的形式发射出红光量子。叶绿素的化学性质很
不稳定，容易受强光、高温等的破坏，特别是当叶绿素与蛋白质分离以后，破坏更快，而类胡萝卜素则较稳定。叶绿素中的镁可以被H＋所取代而成褐色的去镁叶绿素，后者遇铜后，其中的氢（H＋）又被铜（Cu2＋）取代，形成了铜代叶绿素，便由褐色转变成蓝绿色，铜代叶绿素很稳定，且比原来的绿色还要稳定些，在光下也不易被破坏。 材料与设备试剂： 1. 材料 新鲜的菠菜或小白菜等其他绿色植物叶片。 2. 设备 电子天平、研钵、烧杯、量筒、培养皿、刻度试管、试管夹、试管架、酒精灯、剪刀、圆形滤纸、小漏斗等。 3. 试剂 丙酮、四氯化碳、无水硫酸钠、6mol/L 盐酸、醋酸铜粉末、碳酸钙等。 方法与步骤： 一、1. 叶绿体色素的提取 2. 取菠菜或其他植物新鲜叶片5g，洗净，擦干，去掉主脉后剪碎，放入研钵中。
植物生理学实验-叶绿素a b测定
叶绿素a,b含量测定 ［实验目的］熟悉在未经分离的叶绿素溶液中测定叶绿素a和b的方法及其计算。 ［实验原理］在叶绿素a和b的吸收光谱曲线中，红波波长范围内，叶绿素a的最大吸收峰在663nm，叶绿素b的最大吸收峰在645nm。吸收曲线彼此又有重叠。 根据Lambert—Beer定律，最大吸收峰不同的两个组分的混合液，它们的浓度C与光密度OD之间有如下关系：OD1＝Ca·ka1+Cb·kb1 (1) OD2＝Ca·ka2+Cb·kb2 (2) Ca为组分a的浓度（g/L） Cb为组分b的浓度（g/L） OD1为在波长λ1（即组分a的最大吸收峰波长）时，混合液的光密度OD值。 OD2为在波长λ2（即组分b的最大吸收缝波长）时，混合液的光密度OD值。 ka1，kb1，ka2，kb2分别为组分a，b的比吸收系数，即组分a（b）的浓度为（1g/L）时，其在相应波长（λ1，λ2）时的光密度OD值。 叶绿素A和B的80%丙酮溶液，当浓度为1时，比吸收系数K值如下表： 将表中数值代入上式（1），（2）并整理的： Ca=0.0127OD663-0.00269OD645 Cb=0.0229OD645-0.00468OD663 若把Ca，Cb的浓度单位从原来的g/L改为mg/L，则上式可改写为下列形式： Ca=12.7OD663-2.69OD645 (3) Cb=22.9OD645-4.68OD663 (4) Ct=Ca+Cb=8.02OD663+20.21OD645 (5) Ct为叶绿素总浓度，单位为g/L。 利用（3），（4），（5）式即可计算出叶绿素A和B及总叶绿素的浓度（g/L）。 ［器材与试剂］ 1.实验仪器：高级型分光光度计，离心机，台天平，剪刀，研钵，漏斗，移液管 2.实验试剂：丙酮，碳酸钙 3.实验材料：植物叶片 ［实验步骤］ 1.色素的提取：取新鲜叶片，剪去粗大的叶脉并剪成碎块，称取0.5G放入研钵中加纯丙酮5ML，少许碳酸钙和石英砂，研磨成匀浆，再加80%丙酮5ML，将匀浆转入离心管，并用适量80%丙酮洗涤研钵，一并转入离心管，离心后弃沉淀，上清液用80%丙酮定容至20ML。 2.测定光密度：取上述色素提取液1ml，加80%丙酮4ml稀释和转入比色杯中，以80%丙酮为对照，分别测定663nm，645nm处的光密度值。 3.按公式分别计算色素提取液中叶绿素A，B及叶绿素总浓度。再根据稀释倍数分别计算每克鲜重叶片中色素的含量。 ［注意事项］ 1.由于植物子叶中含有水分，故先用纯丙酮进行提取，以色素提取液中丙酮的最终浓度近似80%。 2.由于叶绿素A，B的吸收峰很陡，仪器波长稍有偏差，就会使结果产生很大的误差，因此最好能用波长较正确的高级型分光光度计。 ［实验作业］ 1.试比较阴生植物和阳生植物的叶绿素A和叶绿素B的比值有无不同。 2.分光光度法和比色法有何不同？ 3.叶绿素A和叶绿素B在红光区和蓝光区都有最大吸收峰，能否用蓝光区的最大吸收峰波长进行叶绿素A和叶绿素B 的定量分析，为什么？
叶绿素测定方法
叶绿素测定方法 一、方法选择 1、分光光度计法>荧光光度法>SPAD速测法，浸提比色法>萃取比色法，常温浸提比色 测定>高温速浸提比色法，如果时间条件允许，建议选择常温浸提比色法。 2、药品的选择，常用有机浸提叶绿素的试剂由甲醇、乙醇、丙酮，乙醇对身体的伤害 最小，丙酮最厉害，如果通风条件不是太好，建议选择乙醇;有机试剂混合液提取具有 协同优势，乙醇与丙酮的混合液比甲醇与丙酮的混合液(甲醇乙醇混合很少)浸提的要 完全，而且稳定，乙醇、丙酮、水的浸提效果次之，差异不显著;综上，如果能买到丙 酮的话，乙醇、丙酮以1:3的比例混合液提取最好，其次是乙醇、丙酮、水以4.5:4.5:1 的比例混合液，如果不想用丙酮，可以用95%的乙醇代替，但是与混合液比，提取效率 不高。 3、称样量，0.2g样品，选用20ml浸提液浸提，0.5g样品，选用50ml浸提液浸提。二、实验原理 分光光度法测定叶绿素(包括a\b\类胡萝卜素\总量) 含量的原理是，以有机溶剂在常温暗室直接提取样品中的叶绿素，测定其吸光度，根据叶绿素(包括a\b\类胡萝卜素\总量)在特定波长的吸收，用公式计算其含量。
三、器材 棕色容量瓶、721型分光光度计(751型分光光度计更好，越精确越好) 四、步骤 1、将叶片洗净，选取中间部分，称0.200克左右，并剪成2mm左右碎条 2、将样品放入容量瓶中，加入浸提液，定容，放在暗处26h左右 3、比色，如果仅仅测定叶绿素A\B总量，测定波长在665nm、649nm、652nm 处吸光 度即可，如果还测定类胡萝卜素含量，再测定处波长在470nm处的吸光度即可。目 前，不同的浸提液提取方法都是在这些波长下测定的。 4、每个实验样品重复三次，空白两次重复即可(本实验中空白意义不大) 五、计算 Ca=13.95*A665-6.88*A649 Cb= 24.96* A649-7.32* A665 C类胡萝卜素= (1000*A470-2.05* Ca -114.8* Cb)/245 C总= A652*50/(34.5*m) Ca 为叶绿素a的浓度 M 为称样量
实验六叶绿素的提取、分离
叶绿素的提取、分离一、实验目的 1. 掌握从植物叶中提取叶绿素的方法。 2. 了解纸层层析的原理，掌握纸层析的一般操作和定性鉴定方法。 二、实验原理 1. 叶绿素提取原理：叶绿素等是脂溶性的有机分子，根据相似相溶的原理，叶绿体中含有叶绿体色素（叶绿素a和b、胡萝卜素及叶黄素）等色素分子溶于有机溶剂而不溶于有极性的水。故在研磨和收集叶绿色素时要用丙酮或乙醇等有机溶剂提取而不用水。 2. 色素分离的原理：纸层析是用滤纸作为载体的一种色层分析法，其原理主要是利用混合物中各组分在；流动相和固定相的分配比（溶解度）的不同而使之分离。滤纸上吸附的水为固定相（滤纸纤维常能吸20%左右的水），有机溶剂如乙醇等为流动相，色素提取液为层析试样。把试样点在滤纸的滤液细线位置上，当流动相溶剂在滤纸的毛细管的作用下，连续不断地沿着滤纸前进通过滤液细线时，试样中各组份便随着流动相溶剂向前移动，并在流动相和固定相溶剂之间连续一次有一次的分配。结果分配比比较大的物质移动速度较快，移动距离较远；分配比较小的物质移动较慢，移动距离较近，试样中各组分分别聚集在滤纸的不同的位置上，从而达到分离的目的。 毛细管点样薄层色谱展开 三、仪器和药品 剪纸形状 滤液基线
研钵、毛细管、漏斗、纱布、小烧杯、试管、培养皿等 95%酒精、丙酮、石油醚 碳酸钙，石英砂 四、实验步骤 （1）取菠菜或其他植物新鲜叶片20g左右，洗净，用滤纸擦干，去掉叶柄和中脉剪碎，放入研钵。 （2）研钵中加入少量碳酸钙和石英砂，加4-5ml 无水乙醇，研磨至糊状，再加10ml 无水乙醇充分混匀以提取叶片匀浆中的色素，15-20分钟后，过滤入50ml锥形瓶中加塞待用。 分离：（1）取圆形定性滤纸一张（直径15cm），将其剪成滤纸条（15cm×2cm），将其2cm一端剪去两侧，中间留一长约，宽约的窄条，并在滤纸剪口上方用铅笔画一条直线，作为画滤液细线的基准线（注意：滤液线必须距底边）。用毛细管吸取乙醇叶绿体色素提取液，沿纸条的滤液线涂，等风干后，再重复操作数2-3次。（用滤液涂圆点状类似） （2）在层析缸中加入适量（约2ml）的丙酮作为推动剂，将滤纸条带有色素的一端轻轻插入层析缸中，使滤纸条下端浸入推动剂中。迅速盖好层析缸盖，静置40-60min。此时，推动剂借毛细管引力顺滤纸条向上扩散，并把叶绿体色素向上推动，不久即可看到各种色素的条带。 （3）当推动剂前沿接近滤纸边缘时，取出滤纸，风干，即可看到分离的各种色素，从上到下为：胡萝卜素为橙黄色、叶黄素为鲜黄色、叶绿素a为蓝绿色，叶绿素b为黄绿色，用铅笔标出各种色素的位置和名称。 五、数据记录
测定叶绿素a和b的方法及其计算
实验二十五测定叶绿素a和b的方法及其 计算 一目的要求： 熟悉在未经分离的叶绿体色素溶液中测定叶绿素a和b 的方法及其计算。 二实验原理： 如果混合液中的两个组分，它们的光谱吸收峰虽然有明显的差异，但吸收曲线彼此有些重叠，在这种情况下要分别测定两个组分，可根据Lambert-Beer定律，通过代数方法，计算一种组分由于另一种组分存在时对光密度的影响，最后分别得到两种组分的含量。 如图z-4叶绿素a和b的吸收光谱曲线，叶绿素a的最大吸收峰在663nm，叶绿素b在645nm，吸收曲线彼此又有重叠。 图z-4 叶绿素a和b的吸收光谱曲线 横坐标为波长（nm），纵坐标为比吸收系数
根据Lambert-Beer定律，最大吸收光谱峰不同的两个组分的混合液，它们的浓度C与光密度OD之间有如下的关系： OD1=Ca·ka1+Cb·kb1 （1） OD2=Ca·ka2+Cb·kb2 （2） 式中：Ca为组分a的浓度，g/L。 Cb为组分b的浓度，g/L。 OD1为在波长λ1（即组分a的最大吸收峰波长）时，混合液的光密度OD值。 OD2为在波长λ2（即组分b的最大吸收峰波长）时，混合液的光密度OD值。 ka1为组分a的比吸收系数，即组分a当浓度为1g/L时，于波长λ1时的光密度OD值。 kb2为组分b的比吸收系数，即组分b当浓度为1g/L时，于波长λ2时的光密度OD值。 ka2为组分a（浓度为1g/L），于波长λ2时的光密度OD 值。 kb1为组分b（浓度为1g/L），于波长λ1时的光密度OD 值。 从文献中可以查到叶绿素a和b的80%丙酮溶液，当浓度为1g/L时，比吸收系数k值如下：
实验十二 菠菜叶中叶绿素的提取和分离(07-05-26).
实验十二 菠菜叶中叶绿素的提取和分离（07-05-26） 一 实验目的 1．掌握从菠菜叶中提取叶绿素的方法； 2．了解薄层层析的原理，掌握薄层层析的一般操作和定性鉴定方法 二 实验原理 1．叶绿素提取 高等植物体内的叶绿体色素有叶绿素和类胡萝卜素两类，主要包括叶绿素a (C 55H 72O 5N 4Mg)、叶绿素b(C 55H 70O 6N 4Mg)、β—胡萝卜素(C 40H 56)和叶黄素(C 40H 56O 2)等4种。叶绿素a 和叶绿素b 为吡咯衍生物与金属镁的配合物，胡萝卜素是一种橙色天然色素，属于四萜类，为一长链共轭多烯，有α、β、γ三种异构体，其中，β异构体含量最多。叶黄素为一种黄色色素，与叶绿素同存在于植物体中，是胡萝卜素的羟基衍生物，较易溶于乙醇，在乙醚中溶解度较小。根据它们的化学特性，可将它们从植物叶片中提取出来，并通过萃取、沉淀和色谱方法将它们分离开来。 R R=H ； 叶黄素 R= OH 2．薄层色谱 薄层层析是快速分离和定性分析微量物质的一种极为重要的实验技术，具有设备简单、操作方便而快速的特点。它是将固定相支持物均匀地铺在玻片上制成薄层板，将样品溶液点加在起点处，置于层析容器中用合适的溶剂展开而达到分离的目的。用此法分离时几乎不受温度的影响，可采用腐蚀性显色剂，而且可在高温下显色，特别适用于挥发性小或在较高温度下易发生反应的物质，同时也常用来跟踪有机反应或监测有机反应完成的程度。 薄层层析按分离机制不同可分为吸附层析、分配层析、离子交换层析等，最常用的为吸附薄层层析，在此主要讨论。吸附层析中样品在薄层板上经过连续、反复的被吸附刑吸附及展开剂解吸附过程，由于不同的物质被吸附剂吸附的能力及被展开剂解吸附的能力不同，放在薄层上以不同速度移动而得以分离。通常用比移值(Rf)表示物质移动的相对距离： 的距离 展开剂前沿至原点中心点中心的距离色斑最高浓度中心至原 f R
测定叶绿素a和b的方法及其计算完整版
测定叶绿素a和b的方 法及其计算 Document serial number【NL89WT-NY98YT-NC8CB-NNUUT-NUT108】
实验二十五测定叶绿素a和b的方法及其计算 一目的要求： 熟悉在未经分离的叶绿体色素溶液中测定叶绿素a和b的方法及其计算。 二实验原理： 如果混合液中的两个组分，它们的光谱吸收峰虽然有明显的差异，但吸收曲线彼此有些重叠，在这种情况下要分别测定两个组分，可根据Lambert-Beer定律，通过代数方法，计算一种组分由于另一种组分存在时对光密度的影响，最后分别得到两种组分的含量。 如图z-4叶绿素a和b的吸收光谱曲线，叶绿素a的最大吸收峰在663nm，叶绿素b在645nm，吸收曲线彼此又有重叠。 图z-4 叶绿素a和b的吸收光谱曲线 横坐标为波长（nm），纵坐标为比吸收系数 根据Lambert-Beer定律，最大吸收光谱峰不同的两个组分的混合液，它们的浓度C与光密度OD之间有如下的关系： OD1=Ca·ka1+Cb·kb1 （1） OD2=Ca·ka2+Cb·kb2 （2） 式中：Ca为组分a的浓度，g/L。 Cb为组分b的浓度，g/L。 OD1为在波长λ1（即组分a的最大吸收峰波长）时，混合液的光密度OD值。 OD2为在波长λ2（即组分b的最大吸收峰波长）时，混合液的光密度OD值。
ka1为组分a的比吸收系数，即组分a当浓度为1g/L时，于波长λ1时的光密度OD值。 kb2为组分b的比吸收系数，即组分b当浓度为1g/L时，于波长λ2时的光密度OD值。 ka2为组分a（浓度为1g/L），于波长λ2时的光密度OD值。 kb1为组分b（浓度为1g/L），于波长λ1时的光密度OD值。 从文献中可以查到叶绿素a和b的80%丙酮溶液，当浓度为1g/L时，比吸收系数k值如下： 将表中数值代入上式（1）、（2），则得： OD663=×Ca+×Cb OD645=×Ca+×Cb 经过整理之后，即得到下式： Ca= OD645 Cb= OD663 如果把Ca，Cb的浓度单位从原来的g/L改为mg/L，则上式可改写为下列形式： Ca= OD645 （3） Cb= OD663 （4） CT= Ca+ Cb= OD663+ OD645 （5） （5）式中CT为总叶绿素浓度，单位为mg/L。 利用上面（3）、（4）、（5）式，即可计算出叶绿素a和b及总叶绿素的浓度 （mg/L）。 [附注]一般大学教学实验室所用的分光度计多为721型，属低级类型，其单色光的半波宽要比中级类型的751型宽得多，而叶绿素a和b吸收峰的波长相差仅18nm（663-645nm），难以达到精确测定。此外有时还由于仪器本身的标称波长与实际波长不符，
实验三十三叶绿素含量的测定(分光光度法)(精)
实验三十三叶绿素含量的测定(分光光度法 仪器、材料与试剂实验步骤思考题电子课件 根据朗伯-比尔（Lambert-Beer）定律，某有色溶液的吸光度A值与其中溶质浓度 C以及光径L成正比，即A＝aCL（a为该物质的吸光系数）。各种有色物质溶液在不同波长下的吸光值可通过测定已知浓度的纯物质在不同波长下的吸光度而求得。如果溶液中有数种吸光物质，则此混合液在某一波长下的总吸光度等于各组分在相应波长下的吸光度的总和，这就是吸光度的加和性。今欲测定叶绿体色素提取液中叶绿素a、b含量，只需测定该提取液在2 个特定波长下的吸光度度值，并根据叶绿素a与b在该波长下的吸光系数即可求出各自的浓度。在测定叶绿素a、b 含量时，为了排除类胡萝卜素的干扰，所用单色光的波长应选择叶绿素在红光区的最大吸收峰。 已知叶绿素a、b的80 ％丙酮提取液在红光区的最大吸收峰分别为663nm 和 645nm，又知在波长663nm下，叶绿素a、b在该溶液中的比吸收系数分别为82.04 和9.27，在波长645nm下分别为16.75和45.60，可根据加和性原则列出以下关系式： A663=82.04Ca +9.27Cb………………(1 A645=16.75Ca+45.6Cb………………(2 式中A663、A664分别为波长663nm和645nm处测定叶绿素溶液的吸光度值；Ca、Cb分别为叶绿素a、b的浓度(g/L。 解联立方程(1、(2可得以下方程： Ca=0.0127A663-0.00269A645…………(3 Cb=0.0229A645-0.00468A663…………(4 如把叶绿素含量单位由g/L改为mg/L，(3、(4式则可改写为： Ca(mg/L=12.7A663-2.69A645…………(5 Cb(mg/L=22.9A645-4.68A663…………(6 叶绿素总量CT(mg/L=Ca+Cb=20.2A645+8.02A663……(7 叶绿素总量也可根据下式求导 A652=34.5×CT