植物细胞工程研究应用与展望

植物细胞工程研究应用与展望

王玉洁

能源与环境学院热动10-2班1062126234

内蒙古科技大学

【摘要】本文介绍了植物细胞工程基础研究的发展现状,总结了胚胎培养、加倍单倍体技术、原生质体培养与体细胞杂交、体细胞无性系变异、快繁技术、植物来源生物产品生产技术应展望了植物细胞工程的发展方向。

【关键字】植物细胞工程；基础研究；技术应用；展望

【前言】植物细胞工程是以植物细胞为单位,按照人们的预先设计,有目的,有计划地对植物细胞进行加工、改造,使其遗传和生物学特性发生改变,从而对植物体进行创造设计的技术。每个细胞都具有一套极其精密、复杂和高效的功能体系及一套完整的遗传体系。

【正文】植物细胞工程是以植物细胞全能性为理论基础,以植物组织与细胞培养为技术支持,在细胞和亚细胞水平对植物进行遗传操作,实现植物改良和利用,或获得植物来源的生物产品的科学技术。植物细胞工程具有科学和技术双重特征,经过多年的探索和发展,已成为当代生物科学中一个重要学科和现代生物技术的重要组成部分。

1、植物细胞工程基础研究

植物细胞工程是建立在现代生物科学和工程技术基础上的科学技术。它的发展有赖于植物学、植物生理学、遗传学、分子生物学、植物营养学、环境工程学等学科的发展与进步,可为生物科学的基础研究提供重要的技术手段[1]。植物发育生物学是现代植物科学的重要研究内容。离体培养的器官发生和体细胞胚发生及其调控已成为研究植物形态建成的良好实验体系,极大地丰富了植物发育生物学的内容,加速了其发展。植物薄层细胞培养已成为研究离体条件下植株再生、生理生化、遗传转化的技术[2~4]。利用离体培养技术研究花器官发育,已在多种植物上实现了试管开花和结实[5~6]。原生

质体培养为单细胞研究提供了良好的实验技术体系,已应用于植物细胞分裂、基因表达、核质关系、细胞壁生物学、植物激素的作用机理、物质跨膜运输等研究领域。利用离体突变技术,已分离和鉴定了许多与植物发育有关的基因,为揭示植物遗传与发育调控的分子机理奠定了基础。利用花培加倍单倍体技术获得纯系的方法,为有性繁殖植物遗传分离群体的构建提供了有效途径,进而可为遗传图谱的构建、基因定位提供稳定的基础材料,促进了植物遗传学的发展。同时植物组织培养技术也为植物矿质营养、有机营养代谢,植物病理学等研究提供技术手段。建立植物高效再生体系是植物细胞工程研究的重要领域。研究表明,植物再生能力表现出基因型依赖性,同时受到外植体生理状况、培养条件(培养基、培养环境)的影响。植物激素诱导的信号传递在细胞分裂、极性确定、器官分化、胚状体的发育等离体培养过程中起重要作用。在植物离体形态建成中,生长素与细胞分裂素的比例是重要因素,其他激素可以直接或间接影响形态建成。尽管植物激素一直是植物离体培养研究的热点,但其作用还受到营养条件(培养基)、环境条件(光照、温度、湿度、气体)等的影响。目前植物离体培养研究以细胞水平上的居多,分子水平上的研究相对较少。近年来随着现代分子生物学技术的发展,已分离和鉴定出一批与植物花器官、茎、叶和根器官发育有关的基因[7]。植物离体培养中器官分化和胚状体的发育是基因差异表达的结果,重新确立基因程序化表达是多种因素共同作用的结果。植物离体培养的细胞学和分子生物学方面的证据对揭示植物离体培养的分子机理有重要作用,但目前获得的证据是不完整的,还不能够描绘出基因程序化表达的蓝图。植物离体培养分子机理研究的深入,不仅可以丰富植物分子发育生物学的内容,还可为植物器官发生和体细胞胚发生调控及植物组织培养技术改进提供依据。

2、植物细胞工程技术及其应用

2·1胚胎培养技术及其应用植物胚胎培养是胚、胚珠、子房和胚乳的离体培养技术,其应用领域包括胚胎的发育机理、克服杂交不亲合性和胚拯救、克服珠心胚的干扰、打破种子休眠,缩短育种周期,获得体细胞胚和人工种子,建立植物高效再生体系等,并在农作物、园艺作物、林木和药用植物上广泛

应用[8~11]。胚乳培养的主要目的是获得具有利用价值的三倍体植株。目前有40多种植物的胚乳培养达到了不同程度的细胞分化和器官分化,不少植物已得到再生植株。我国在马铃薯、小麦、水稻、苹果、桃、猕猴桃等10多种植物上得到了胚乳再生植株[12]。胚乳培养还可作为研究淀粉等营养物质合成和代谢的实验体系。通过胚乳培养产生的一些非整倍体,可以作为遗传分析的材料。但相对于其他植物器官、组织和细胞的培养,胚乳培养相对较难,故应用并不普遍。植物离体受精可以通过离体柱头授粉、离体子房授粉、离体胚珠授粉、离体精细胞和卵细胞融合等方法实现。该技术可以克服植物授粉不亲和的问题,同时也可以进行胚胎、种子和果实发育机理等基础研究。人工分离的精细胞和卵细胞融合后进行合子胚培养,已在玉米等植物上获得成功[13]。植物离体受精技术是植物细胞工程中的重要实验技术,为研究植物胚胎发育机理提供了新的实验系统,为开发新的植物转基因途径提供了可能[14]。

2·2加倍单倍体技术及其应用加倍单倍体技术是指利用植物组织培养技术培养单倍体植物材料(花药、花粉、未受精的子房和胚珠)获得单倍体植物,然后通过自然或人工加倍的方法获得双倍体植株的技术,其中以花药和花粉培养应用最为广泛。利用加倍单倍体技术进行花药和花粉培养,已在250多种植物上获得成功,中国、加拿大、澳大利亚、欧盟等在花培育种中取得了突出的研究成果。我国在花药培养和单倍体育种方面总体上处于世界前列,由朱自清等研制的N6培养基广泛应用于禾本科植物的花药和花粉培养,已成为国内外花培的通用培养基[12]。利用花培技术,我国在水稻、小麦、油菜、大麦、甜椒等作物上培养了许多新品种,中花系列水稻品种、京花系列小麦、华油一号油菜等一大批育成品种的推广,取得了较好的社会效益和经济效益。利用花培技术获得染色体代换系、附加系,已应用于小麦、大麦以及一些茄科植物的遗传改良,大大提高了远缘杂交育种的效率。雌核发育是植物存在的自然现象,在离体条件下可以通过培养未受精的子房和胚珠产生单倍体植株,也可以在活体条件下通过授以不同种类的花粉或通过物理方法处理(如辐照处理)的花粉,诱导雌核发育,目前已在小麦、水稻、玉米、甜菜、向日葵、马铃薯、西葫芦、洋葱、黄瓜、非洲菊、百合、小黑杨、三叶橡胶、

烟草、矮牵牛等10多种植物上获得成功。离体条件下诱导孤雌生殖获得加倍单倍体的技术发展时间不长,现已开始应用于作物的改良、构建遗传分析和转基因的受体材料。

2·3原生质体培养和体细胞杂交原生质体培养和体细胞杂交是植物细胞工程的核心技术之一,为克服植物远缘杂交不亲和性,创造新的种质资源,实现植物遗传转化和进行细胞学的基础研究提供了重要的技术支撑。自1971年Takebe等首次报道获得烟草叶肉原生质体再生植株以来,原生质体培养和体细胞杂交技术一直是植物细胞工程的重要研究领域,在分离原生质体的材料选择、培养基与培养环境控制、体细胞杂交技术等方面进行了大量研究,建立了原生质体培养和体细胞杂交的技术程序。目前获得的原生质体再生植株包括粮食作物、蔬菜、果树、花卉、林木、药用植物以及真菌和海藻等。原生质体培养一直以农作物和经济作物为主,但近年来开始从一年生向多年生,从草本向木本,从高等植物向低等植物发展。我国在原生质体培养、体细胞杂交、体细胞杂种评价和利用等方面开展了大量研究,首次获得的原生质体植株种类的数量处于世界前列,在原生质体培养体系的建立和完善、体细胞杂种鉴定、新种质的创制等方面取得了一批先进适用的成果[12]。原生质体培养技术在植物细胞生理和遗传学、基因组学、蛋白质组学研究中也有应用。利用体细胞融合技术可以克服有性杂交不亲和性,创造新的物种或类型,实现植物种间、属间,以至科间的体细胞杂交,如番茄+马铃薯、甘薯栽培种+野生种、甘蓝+白菜、拟南芥+甘蓝型油菜、酸橙+甜橙,红橘+枳壳的杂种培育等。利用细胞融合技术,还获得了一些特异的新种质,如细胞质雄性不育水稻、细胞质雄性不育烟草等。尽管目前已在多种植物上建立了体细胞杂交和遗传操作的技术程序,但还有相当多的植物在原生质体培养上存在技术困难,仍需进一步加强多学科的交叉研究以及技术集成和创新。

2·4植物体细胞无性系变异与植物改良体细胞无性系变异是植物体细胞在植物组织培养过程中产生的变异。利用体细胞无性系技术可以选育植物优良的品种(品系),获得育种的中间材料或作为复合育种的一个中间环节,还可以利用突变体材料做遗传分析和生理生化等基础研究。体细胞无性系变异

通常是单一或少数性状的变异,因此特别适合综合性状良好,但个别性状需要改良的品种。自20世纪80年代以来,国内外对体细胞无性系进行了大量研究,成为继花培技术之后又一实用化的细胞工程育种技术。目前体细胞无性系变异已广泛应用于植物抗病育种、抗除草剂育种、品质育种、抗非生物逆境(耐盐、耐旱、耐寒)育种,获得了一批农作物、园艺作物、林木新品种。利用人工诱变创造体细胞无性系变异,已成为植物细胞工程育种的重要技术。人工诱变方法包括物理诱变(γ射线、X射线、中子、电子束、离子束、激光、紫外线、空间环境)、化学诱变(甲基磺酸乙酯、秋水仙素、叠氮化钠、平阳霉素、5-BU、EB等)和生物诱变(转座子插入突变、跳跃基因等)。利用诱变技术对植物的种子、组织、器官等进行处理,能够增加体细胞无性系变异,获得有益性状突变,结合离体诱变筛选技术,能够提高选择和育种的效率。国内外利用人工诱变结合组织培养技术,获得了一大批植物新品种和新材料,其中以离体辐射诱变取得的成果最为突出,开创了空间环境诱变的新领域。

2·5植物快繁技术及其应用植物快繁技术应用于高附加值经济植物、珍稀濒危植物、转基因植物、育种原种以及植物脱毒苗的快繁,是植物细胞工程中应用最为广泛的技术,取得了显著的经济效益。利用超低温保存种质法结合快繁技术可以实现植物种质资源的中长期保存和利用。植物快繁技术在发达国家和发展中国家均有商业化应用,FAO将植物快繁技术作为成本效益高效型技术向发展中国家推广。通过茎尖培养或利用组织培养技术结合物理、化学方法获得无毒苗,已成为植物细胞工程技术的重要方面。我国开展植物快繁研究较早,20世纪70年代中期开始规模化植物快繁脱毒研究和应用,植物种类包括果树、蔬菜、花卉、林木、药用植物等,其中以脱毒马铃薯、兰花、甘蔗、香蕉、葡萄、草莓、苹果、柑橘、杨树等规模较大。光自养微繁技术是在无糖培养基和人工控制的环境中,外植体利用CO2进行光合作用,以完全自养的方式进行生长繁殖。该技术能够大幅度降低快繁中的污染率,促进植株的生长发育,显著提高再生苗的移栽成活率,适合自动化和工厂化生产。自20世纪80年代末以来,国内外对光自养微繁技术进行了大量研究,确立了技术经济的可行性,并逐步在生产中推广应用。植物快繁生物反应器

的出现,为植物快繁技术带来了根本性变革,成为快繁技术发展的新方向。植物快繁生物反应器具有生产规模大、便于自动化控制、显著降低玻璃化苗的比例、降低成本和污染及节约人力资源等特点,目前已在木薯、马铃薯、咖啡、橡胶、菠萝、甘蔗、香蕉、苹果、梨等植物上获得成功。利用生物反应器生产大量的繁殖体和制作人工种子,可实现人工种子生产的规模化,为植物快繁、杂种优势利用和种业发展带来革命性的变化。植物种质资源是生物多样性保护和植物遗传育种的物质基础。目前已至少在40多个属的植物中研究了种质超低温保存的方法,确定了超低温保存种质的遗传稳定性和技术有效性。超低温保存后再生的植株,经过形态学、生理生化、染色体数目和结构、DNA的稳定性等方面的分析,认为出现体细胞无性系变异的频率与常规快繁方法相似。超低温保存种质具有节省人力、物力和时间的优点,是中长期保存种质资源方法的有益补充,但在现有技术条件下不可能取代目前常用的种质资源保存方式。

2·6植物细胞工程与植物来源生物产品的生产利用植物细胞工程技术生产植物来源的生物产品,是植物细胞工程的一个重要领域,应用范围包括生产天然药物(人参皂苷、地高辛、紫杉醇、长春碱、紫草宁等)、食品添加剂(花青素、胡萝卜素、甜菊苷等)、生物农药(鱼藤碱、印楝素、除虫菊酯等)和酶制剂(SOD酶、木瓜蛋白酶)等。利用细胞悬浮培养、固定化细胞培养和毛状根培养技术设计生物反应器,可以实现植物来源生物产品的规模化生产。建立在植物细胞培养技术基础上的植物来源生物产品的生产,经过多年的研究与开发,已发展成为比较成熟的技术,其技术体系包括筛选高产细胞系、选用合适的培养基(基本培养基、生长调节物质、饲喂前体、诱导子等)、优化培养环境、发展固定化培养技术、改进产品的分离和提取技术。发根农杆菌能在无激素的条件下诱导植物产生毛状根并快速生长,已应用于次生代谢产物的生产。目前毛状根生物反应器已在紫草、人参、金鸡纳、甘草、烟草等植物中得到应用,其中韩国已实现人参的不定根和毛状根的工厂化生产。植物细胞生物反应器由于技术、工艺和成本等原因,目前仅有少数产品(人参皂苷、紫草宁、紫红素、紫衫醇等)在韩国、日本、德国等国家实现了

商业化应用。随着技术的进一步完善和生产成本的降低,该技术在植物来源生物产品的生产方面将有广阔的发展前景。

3、植物细胞工程展望

3·1加强植物细胞工程基础研究植物细胞工程的发展有赖于基础科学的进步与发展。应用现代分子生物学理论和技术研究植物细胞全能性表达、细胞脱分化、器官发生和形态建成相关基因的功能和表达调控,将揭示植物再生的分子基础,有利于实现植物再生的人工调控。同时,加强植物代谢工程的基础研究,加快植物细胞工程与植物基因工程的整合,结合分子标记辅助育种技术,将大大推进转基因植物、植物生物反应器的研究和应用。

3·2完善植物细胞工程技术体系植物细胞工程技术体系是植物组织培养技术的集成和优化。培养和选育高效型的优良细胞株系,建立植物高频率再生体系,优化突变体筛选、无糖培养和快繁技术,开发适合规模生产的低成本培养基,优化植物细胞生物反应器的设计和工艺,加强计算机技术和自动化控制技术在植物细胞工程中的应用,形成一套集成创新的技术体系,将推动植物细胞工程技术向高效、可控和多样化的方向发展。

3·3开拓新的研究和应用领域植物细胞工程技术是现代生物技术中发展比较成熟的技术,是植物改良的有效途径和方法。随着现代农业的不断拓展,植物细胞工程技术应不断开拓新的应用领域,如推动植物细胞工程技术与空间技术的结合,发展空间细胞融合技术,加强海洋生物技术的应用,利用植物细胞工程技术培育海藻新品种,生产海洋来源的植物功能产品,开拓植物细胞工程在环境保护中的应用等。

3·4加快植物细胞工程技术的应用植物细胞工程技术的应用,催生了一大批先进实用的研究成果和技术,培育了一批优良品种。在大力推广常规脱毒和快繁技术的同时,加快发展植物快繁生物反应器和光自养微繁技术,将为种苗业带来新的变革。生产微型营养器官的人工种子可能成为最先规模化应用的人工种子技术,以体细胞胚为繁殖体的人工种子技术需要进一步研究和完善。应用植物细胞培养技术生产植物来源的生物产品,尽管目前仅在少数

植物上实现了商业化生产,但随着植物细胞工程生物反应器技术的完善,其应用领域将进一步扩大。

3·5重视植物细胞工程质量管理植物细胞工程技术呈现发展规模化、管理规范化和操作自动化的趋势。目前国外一些国家在组织培养实验室、种苗快繁的质量管理以及植物来源生物产品的生产和质量管理中实行良好实验室规范(GLP)、良好生产规范(GMP)和危害分析和关键控制点(HACCP)系统,我国一些植物快繁企业也开展了GMP论证。植物细胞工程技术在产生巨大的社会经济效益的同时,必然对其技术产品的质量管理提出更高的要求。植物细胞工程的研究与应用,推动了现代生物技术的发展。作为一个相对独立的学科和技术体系,植物细胞工程为高效、优质、可持续的现代农业做出了重大贡献。植物细胞工程的发展,有赖于生命科学技术和工程技术的进步,同时也促进了现代生命科学技术的进步和发展。重视植物细胞工程的基础研究,加强学科交叉融合,突出技术集成创新,将为植物细胞工程的发展提供更为广阔的空间,为现代农业和生命科学技术的发展做出更大的贡献。

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