(完整版)在基因工程中把表达载体导入受体细胞的几种方法的比较
基因工程、克隆技术
控制药品合成的相应基因
①体外基因治疗 ②体内基因治疗
5.两种基因治疗途径及其特点
途径
方法
特点
体外基因 不 治疗 同 点
体内基因 治疗
从患者体内获得某种、 细胞扩增→输入体内(实 例中第一个)
状。
蛋白质功能
蛋白质
氨基酸
脱氧核苷酸
听课心得
审题关键：“工具酶”、“植物细胞”、“原理”、“染 色体上”、“预期”
命题来源：基因工程和蛋白质工程。
思路分析：(1)转基因植物的培育过程中，基因工程的工具酶是限 制制性核酸内切酶的DNA连接酶，目的基因只有含有启动子，才 能被RNA聚合酶识别并与之结合进行转录。(2)接受目的基因的受 体细胞若 植物体细胞，可采用植物组织培养技术获得转基因植物 。(3)通过对比转基因植物是否普通的非转基因植物的出油率高。 (4)蛋白质工程设计流程是：预期蛋白质的功能→设计预期的蛋白 质结构→推测出应有的氨基酸序列→找到相应的脱氧核苷酸序列。
获取目的基因→构建表达载体→导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定
区别
实质
定向改造或生产人类所需的蛋白质
定向改造生物的遗传特性，以获得人类所需的生物类型或生物产品
结果
生产自然界没有的蛋白质
生产自然界中已有的蛋白质
联系
蛋白质工程是在基因工程的基础上，延伸出来的第二代基因工程，因为对现有蛋白质的改造或制造新的蛋白质，必须通过基因修饰或基因合成实现
动物细胞
显微注射法 受精卵
微生物细胞
Ca2＋处理法 原核细胞
转化过程
目的基因插入Ti 质粒的T-DNA上 →农杆菌→导入 植物细胞→整合 到受体细胞的染 色体DNA→表达
基因工程载体转入受体细胞的方法
基因工程载体转入受体细胞的方法以下是 6 条关于基因工程载体转入受体细胞的方法：
1. 电击法呀，就好像给细胞来一场“电击狂欢”！比如说，把载体和受体细胞放在一起，然后通上电，“啪”的一下，载体就有可能钻进细胞啦！就像我们玩游戏打通关键关卡一样刺激，这难道不神奇吗？
2. 化学法呢，简直是给细胞施了个“魔法”！可以用一些特殊的化学物质，让载体和细胞亲密接触，然后“嗖”地一下就进去了！这不就像是变魔术，把东西变没又变出来一样有趣吗？
3. 显微注射法哦，这可是个精细活儿！就像医生给病人打针一样，用细细的针把载体直接注射到细胞里面去。
哇，这得多小心多厉害呀，简直是高手操作！
4. 病毒介导法呀，病毒就像是个“快递员”！让经过改造的病毒带着载体去找到受体细胞，把载体送进去，这多有意思呀！你想想，病毒也能被我们利用起来呢！
5. 基因枪法呢，听着就很霸气吧！就好像用枪把载体“射”进细胞里，“砰”的一声，载体就到位啦！这难道不是超酷的吗？
6. 脂质体介导法，就如同给载体坐了个“舒适小轿子”去细胞里！脂质体包裹着载体，然后和细胞融合，载体就这样进入啦！哎呀，多巧妙的办法呀！
我觉得这些方法都好神奇，各有各的巧妙之处，科学家们真的太厉害了，能想出这么多办法来让基因工程载体转入受体细胞！。
《基因工程的基本操作程序》 知识清单
《基因工程的基本操作程序》知识清单基因工程，这个听起来高大上的词汇，其实与我们的生活息息相关。
从转基因食品到基因治疗，基因工程正在逐渐改变着我们的世界。
那么，基因工程到底是怎么实现的呢？这就不得不提到它的基本操作程序。
一、目的基因的获取要进行基因工程，首先得有我们想要的那个基因，也就是目的基因。
获取目的基因的方法主要有以下几种：1、从基因文库中获取基因文库就像是一个基因的大仓库，里面存放着各种各样的基因。
我们可以根据目的基因的有关信息，比如它的核苷酸序列、功能等，在基因文库中进行筛选和查找。
2、利用 PCR 技术扩增目的基因如果我们已经知道了目的基因的核苷酸序列，就可以通过 PCR（聚合酶链式反应）技术来大量扩增它。
PCR 就像是一个复制机器，能够让目的基因在短时间内迅速增加。
3、人工合成法如果目的基因的核苷酸序列比较短，而且又已知其序列，我们还可以通过化学方法直接人工合成。
二、基因表达载体的构建有了目的基因，接下来就要把它装到一个“车子”里，这个“车子”就是基因表达载体。
基因表达载体的构建是基因工程的核心步骤。
一个好的基因表达载体至少要包含以下几个部分：1、启动子启动子就像是基因表达的“开关”，它能够启动基因的转录。
2、终止子终止子则是基因表达的“刹车”，告诉RNA 聚合酶在哪里停止转录。
3、目的基因这是我们最想要的“乘客”。
4、标记基因标记基因的作用是方便我们筛选和鉴定含有目的基因的细胞。
构建基因表达载体时，需要用同一种限制酶分别切割目的基因和载体，然后再用DNA 连接酶把它们连接起来，形成一个重组DNA 分子。
三、将目的基因导入受体细胞把构建好的基因表达载体导入到受体细胞中，这是基因工程的关键一步。
不同的受体细胞，导入的方法也不一样。
1、导入植物细胞常用的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法。
农杆菌转化法是利用农杆菌能够感染植物细胞的特点，将目的基因整合到植物细胞的染色体 DNA 上。
3.2.3 将目的基因导入受体细胞-高二生物(人教版2019选择性必修3)
第三步：将目的基因导入受体细胞
（三）将目的基因导入微生物细胞
1.受体细胞：常用原核生物作为受体细胞 2.常用菌：大肠杆菌 3.优点：繁殖快，多为单细胞，遗传物质相对较少 4.转化方法 Ca2＋处理法
增加细胞壁通透性
将重组表达载体
Ca2+处理大
感受态
DNA分子溶于缓 在一定温 感受态细胞
肠杆菌
细胞
冲液中与感受态 度下促进 吸收DNA
再进行筛选、鉴定。 受体细胞：受精卵
随转化方法的突破，用农杆菌侵染水稻 、玉米等单子叶植物 也取得成功。
第三步：将目的基因导入受体细胞
（一）将目的基因导入植物细胞——基因枪法 1.定义：基因枪法又称微弹轰击法，是利用压缩气体产生的动力， 将包裹在金属颗粒表面的表达载体DNA打入受体细胞中，使目 的基因与其整合并表达的方法。常用的金属颗粒有钨粉粒子和 金粉粒子，粒子的直径一般在0.6～4μm。 2.适用对象： 单子叶植物
基因枪法意图
第三步：将目的基因导入受体细胞
（二）将目的基因导入动物细胞 1.常用方法： 显微注射法 2.导入对象： 受精卵 ①体积大，易操作②营养物质丰富③全能性高 3.转化方法 将含有目的基因的表达载体提纯
显微注射
受精卵
胚胎早期培养
胚胎移植
获得具有新性状的生物
第三步：将目的基因导入受体细胞
（二）将目的基因导入动物细胞
使用cDNA作为目的基因或使用酵母菌等真核生物作为受体细胞。
3.若可以获得该蛋白，但是蛋白质无活性，原因可能是？ 原核生物缺少高尔基体和内质网等细胞器，无法对真核生物的蛋
白质进行正确的加工。 4.以上情况如何解决？
人工体外再加工或使用酵母菌等真核生物作为受体细胞。
14 第十四讲(1) 目的基因导入受体细胞
植物转基因方法有三类：
⑴载体介导的转化方法； 概念：将目的DNA插入到农杆菌的Ti质粒或病毒 的DNA上，随着载体质粒DNA的转移而转移。 农杆菌介导法 ⑵DNA直接转化法； 通过物理或化学的方法 ⑶种质系统法； 花粉管通道法、胚囊子房注射法
1 农杆菌介导的Ti质粒载体转化法
的比率表示。 首先通过菌液的OD值测定或细菌计数，计算 用于制备感受态细胞的受体菌总数。然后计算转 化子与受体菌的比率。 例子：4ml菌液有2×108个菌体 得到103个转化子 转化率： 103/(2×108)=5×10-6 含义：每个受体菌细胞被转化的概率5×10-6 。 或者说，要得到一个转化子，需要 2×105个受体菌细胞。
3 影响转化率的因素
⑵受体细胞 受体细胞必须与载体相配 ⑶转化方法 不同的转化方法转化效率也有一定的差异。 一般来说，电击法转化效率 比较高，其次是 Ca2+诱导法，再次是接合法。在同一种转化方 法中，不同的技术参数其转化效率也有一定的 差异。
思考题 ：
农杆菌介导的Ti质粒转化法操作步骤
④筛选培养 将外植体转移至筛选培养基上继续培养，筛 选出被转化的细胞，经再分化培养成再生植株。
2 针对不同的外植体以及不同的转化目的而建 立多种转化方法
⑴叶盘转化法
⑵整体植株接种转化法 ⑶原生质体共培养转化法
⑷悬浮细胞共培养转化法
⑴ 叶盘转化法 无菌叶盘 接种 愈伤再生植株
选择
注意：A、要求叶子脱分化后能再 分化形成植株； B、应用的局限性。
特点：获得的转化植株来自同一个转化的细胞
⑷悬浮细胞共培养转化法 此方法类似于原生质体共培养转化法，主要 差别是首先建立悬浮细胞系。
3 植物病毒介导的感染 目前，利用植物病毒载体转化植物细胞大致 有以下两种战略： ⑴植物细胞原生质体感染； ⑵植物组织感染 例：植物双生病毒，成熟的病毒呈双颗粒 状，每一颗粒中有一条不同的DNA单链。只有 A和B同处一个植物细胞中，才形成具有感染力 的病毒。
分子生物学-基因导入(Gene transfer)
Ⅵ.Confocal laser scanning
Microscopy
Confocal laser-scanning microscopy combined with sophisticated image processing techniques allow the biologist to explore the threedimensional infra-structure of the cell(van Meer et al.,1987;White et al.,1987;Wijnaendtsvan Resandt et al.,1985).
水稻矮缩病毒细胞间运动蛋白和绿色荧光蛋白的 融合蛋白在烟草表皮细胞中的表达
A
B
C
D
50 mm
E
F
G
H
20 mm
用水稻矮缩病毒细胞间运动蛋白特异
DD
抗体的Байду номын сангаас体金标记技术进一步证明了
运动蛋白定位于胞间连丝及细胞质
A: 健康水稻胞间连丝的标记结果; B-C: 感染RDV水稻胞间连丝的标记结果l; D:感染RDV水稻细胞质的标记结果.
V.基因导入（Gene transfer）
1.基因瞬间表达(Transient expression)与稳定表达 (Stable expression)
瞬间表达:外源基因不整合在靶细胞的基因组中，而是以游
离的形式存在于靶细胞中。所以，外源基因不能随着靶细胞基 因组的复制而复制。
稳定表达:外源基因以某种形式整合在靶细胞的基因组中，
(3).Baculovirous is a very large DNA（genome of about 150kb） that infects insect cells
将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定课件-高二生物人教版选择性必修3
动物细胞
显微注射法 受精卵
微生物细胞
Ca2＋处理法 原核细胞
转化过程
目的基因插入Ti质 粒的TDNA上→导入 植物细胞→整合到 受体细胞的染色体 DNA中→表达
目的基因表达载体提 纯→取卵（受精卵） →显微注射→受精卵 发育→获得具有新性 状的动物
Ca2＋处理细胞→能吸收 周围环境中DNA分子的生 理状态细胞→重组的基 因表达载体导入细胞中
转入农杆菌 , 导入植物细胞 ,
目的基因插入植物细胞的染色体DNA 上
目的基因在植物细胞中
维持稳定和表达
。
两次拼接、两次导入?
组织培养技术
(一)将目的基因导入植物细胞
①两次拼接 第一次拼接：目的基因拼接到Ti质粒的T-DNA上； 第二次拼接(非人工操作)：被插入目的基因的T-DNA拼接到受体细胞 染色体的DNA上。
胰岛素 mRNA
胰岛素 cDNA
胰岛素 加工
胰岛素原
胰腺
提取 筛选
逆转录
质粒
重组 质粒
导入
mRNA
大肠杆菌
大肠杆菌合成的胰岛素有没有生物活性? 没有
（胰岛素是分泌蛋白，原核生物没有内质网、高尔基体对蛋白质进一步加工。）
【小结】目的基因导入受体细胞方法比较
种类 项目 常用方法
受体细胞
植物细胞
花粉管通道法 农杆菌转化法 体细胞或受精卵
电泳操作
目的基因
mRNA作为模板 cDNA作为模板
2.检测目的基因是否转录出了mRNA B.分子杂交技术 用上述探针和转基因生物的mRNA杂交,若出现杂交带，表明
目的基因转录出了mRNA。
RNA分子杂交流程图
3.检测目的基因是否翻译成蛋白质 (1)方法: 抗原-抗体杂交技术 (2)原理: 抗原抗体的特异性结合 (3)过程: 提取转基因植物的蛋白质+相应抗体 → 是否出现杂交带
化学法将外源基因导入细胞的技术方法
化学法将外源基因导入细胞的技术方法外源基因导入细胞的化学法主要有三种，如磷酸钙共转染法、DEAE-介导转染法和脂质体介导转染法等，其中脂质体介导转染法的转染效果较高，用法简便，而且不少厂家可提供脂质体转染的试剂等，目前被多数试验室所采纳。
（一）脂质体介导的转染【原理】脂质体（liposoms）是一种人造膜，制备包装DNA的脂质体，普通是用逆相蒸发（reverse phase evapolation )技术，因此可生产大型的、包装着高效DNA的单层膜脂质体载体。
脂质体介导转染技术的原理是细胞膜表面为负电荷，而脂质体颗粒带正电荷，可通过电荷间的引力将DNA,mRNA或单股RNA 等导入细胞内。
其实，用脂质体将DNA导入细胞的机制并不是很清晰，普通认为，DNA上带负电的磷酸基团与脂质体上的正电荷结合，然后脂质体上剩余的正电荷与细胞膜上的唾液酸残基的负电荷结合，通过两者的融合将DNA导入细胞。
另一种可能的机制是DNA与脂质体结合之后通过细胞的内吞作用进入细胞，然后一部分DNA通过不明机制释放进细胞质。
脂质体载体有许多优点。
例如制备程序比较容易，可以通过多聚碳酸酯滤膜消毒灭菌，用它包装的DNA在4℃可长久保存不失活性，以及毒性低，包装容量大，可庇护DNA免受核酸酶的降解作用等。
【材料】 1．待转染细胞贴壁单层细胞或悬浮培养细胞； 2．试剂DMEM-SF 无血清无抗生素培养基），DMEM彻低培养液（含15％），，质粒DNA，脂质体转染试剂（lipofectamine) ,1xPBS ( pH 7.4)。
3．器材35 mm 培养皿、试管、EP箱、移液器、Tip头、离心机、涡流混旋器、超净工作台、C02孵箱等。
【办法】 1．贴壁细胞 (1)质粒的预备：用于转染的质粒量普通较大，所需的纯度也较高，而且质粒的构型最好是共价闭环的。
所以推举采纳的质粒DNA需大量制备，而且在操作过程中要轻快。
提取的质粒需举行纯化，如用密度梯度离心法、沉淀法等。