目的基因导入受体细胞
蛋白编码基因及其调控序列，CI基因表达的阻
遏蛋白可以抑制Tcr基因的表达。当外源DNA片 段插入CI基因的Hin dⅢ或BglⅠ位点上时，CI 基因失活。Tcr基因因阻碍解除而得以表达，故 阳性重组子为Tcr表型。
质粒本身因为Tcr基因受阻碍为Tcs表型，当转化
细菌涂布在Tc平板上时，只有含有外源DNA插入
lac Z’是β-半乳糖苷酶基因部分缺失的DNA片段， 含lac Z’的重组载体转化lac Z’互补型菌株，可 转译β-半乳糖苷酶，在含有X-gal（5-溴-4-氯3-吲哚-β-D-半乳糖苷）和IPTG（异丙基-β-硫 代半乳糖苷）的培养基上使转化子成为蓝色菌落， 而lac Z’互补型菌株本身为白色菌落。当lac Z’ 区插入外源基因后，再转化lac Z’互补型菌株， 由于不能翻译β-半乳糖苷酶，转化子即使在含有 X－gal和IPTG的培养基上也只能长成白色菌落。 这样可以区分含外源基因和不含外源基因的转化 子。 此方法主要用于原核生物。
片段的阳性重组子的转化菌才能生长成菌落。
（4）显色互补筛选法
lacZ 基因上缺失操纵基因区段的突变体与带有完整 的近操纵基因区段的β-半乳糖苷酶阴性突变体之 间实现互补，这种互补现象称为α-互补。 具有完整乳糖操纵子的菌体能转译β-半乳糖苷酶 (Z)、IPTG和X-gal时，产生兰色沉淀物，使菌落 成为蓝色。如果在载体DNA上组入β-半乳糖苷酶 基因（lacZ)部分缺失的片段(lacZ’)．则重组DNA 分子转化lacZ’互补型菌落，会在含有X-gal和 IPTG的培养基中得到的转化子是蓝色菌落。
含有重组DNA分子的克隆子被称为重组子，如果 重组子中含有外源目的基因则又称为阳性克隆 子或期望重组子 。 经过各种方法将外源DNA分子导入受体细胞后， 获得所需阳性克隆子的过程称为克隆子的筛选。
一、遗传表型直接筛选法
（一）根据载体选择标记初步筛选转化子
在构建基因工程载体系统时，通常在载体DNA分子 中组装了一种或两种选择标记基因，在受体细胞 内进行表达，呈现出特殊的表型或遗传学特性， 作为筛选转化子的依据。
第三节 重组子的筛选
在重组DNA分子的转化、转染或转导过 程中，一般仅有少数受体细胞成为克隆子。 必须采用合适的方法从大量的细胞背景中筛 选出期待的克隆子。
概念
克隆子 转化子 重组子
将摄取外源DNA分子并能使该分子在其中稳定维 持的受体细胞统称为克隆子。 把采用各种转化方法或转导方法获得的克隆子 叫做转化子（导入外源DNA分子后能稳定存在的 受体细胞称为转化子 ），现在这两者有通用的 趋向。
α 互 补 的 检 测
以显色剂x-gal作为选择物时:
DNA对照组不应出现任何菌落；
感受态细胞对照组长出的菌落应全是蓝色 的； 感受态细胞有效性对照组长出的菌落中应 有白色的。 其中一项不符，就有可能挑出假的转化子菌 落。
（5）利用报告基因筛选植物转化细胞
报告基因：系指其编码产物能够被快速地测定，常 用来判断外源基因是否已经成功地导入寄主细胞 （器官或组织）并检测其表达活性的一类特殊用 途的基因。 在植物转基因研究中，在有选择压力的情况下，可 利用报告基因在受体细胞内的表达，从大量非转 化克隆中选择出转化细胞；同时，报告基因可以 和某些目的基因构成嵌合基因，从报告基因的表 达了解目的基因的表达情况及推测基因调控序列。 常用的报告基因有抗生素抗性基因以及编码某些 酶类或其他持殊产物的基因等。
选择培养基是：
根据宿主细胞类型配置的培养基，对 于细菌受体细胞而言，通常用LB培养基， 在LB培养基中加入适量的某种选择物，即 为选择培养基。
选择物：
是由载体DNA分子上携带的选择标记基 因所决定。
（一）根据载体选择标记初步筛选转化子
（1）抗药性筛选
（2）插入失活筛选法 （3）插入表达筛选法 （4）显色互补筛选法 （5）利用报告基因筛选植物转化细胞 （6）利用遗传选择标记筛选哺乳动物转 基因细胞
双
（3）插入表达筛选法
利用外源目的基因插入特定载体后能激活 筛选标记基因的表达，由此进行转化子的 筛选。 有些载体在设计时，在筛选标记基因前面 连接上一段负调控序列，当插入失活该负 调控序列时，其下游的筛选标记基因才能 表达。
例如pTR262质粒载体，它由pBR322衍生而来，其
Tcr基因的上游含有一段λ噬菌体DNA的CI阻遏
特征
作为报告基因，在遗传选择和筛选检测 方面必须具有以下几个条件： (1)已被克隆和全序列已测定；
(2)表达产物在受体细胞中本不存在，即 无背景，在被转染的细胞中无相似的内源 性表达产物；
(3)其表达产物能进行定量测定。
①新霉素磷酸转移酶基因（nptⅡ）抗新霉素、卡那 霉素、庆大霉素和G418等抗生素，成为筛选动植 物转化子的选择标记基因。
（1）抗药性筛选
抗药性筛选
若外源DNA插在BamH Ⅰ位
点上，培养基应含Ap；
若外源DNA插在PstⅠ位点
上，培养基应含Tc； 利用含一种选择药物的 选择培养基无法区分重组子 和非重组子，只能区分转化
子和非转化子。
正向选择方式
（ 2） 插 入 失 活 筛 选 法
双 双 双
双抗药性筛选
②潮霉素磷酸转移酶基因（hpt）赋予转化子能抗潮 霉素，作为选择标记基因主要用于筛选动植物转 化子。潮霉素是致癌物质，操作时应慎重。
③氯霉素乙酰转移酶基因（cat）也被用于筛选动植 物转化子的标记基因。
④β-葡萄糖酸酶基因（gus）
gus的基因产物β-葡萄糖酸酶（GUS）能够催化4-甲 基伞形花酮-β-D-葡萄糖苷酸，产生荧光物质4甲基形花酮，以此筛选含gus基因的转化子。
一般的做法是:
将转化处理后的受体细胞接种在含
适量选择药物的培养基上，在最适生长温
度条件下培养一定时间，根据菌落生长情
况挑选出转化子。
常用的选择标记 基因主要是：
抗性基因； 表达产物可以 发光或使反应底 物显色的基因
相应的选择条件是： 可以被抗性基因产 物分解的抗生素；
可以使基因产物发 光的光线，或者是可 以使基因产物显色的 试剂。
由于植物细胞GUS本底非常低，因此广泛地应用于筛 选植物转化子。
基因工程基本操作过程(目的基因与运载体结合)
2） 在酶切位点之前要有一个较强的启动子，使 插入的目的基因可在该启动子的指导下高效表达。
3）选择的载体必须在连接后对基因转录和翻译过 程中的编码区读框不改变。
当载体和外源DNA用同样的限制性内切酶切割时，所形成的 DNA末端就能够彼此相匹配，可以被T4连接酶共价地连接起 来，形成重组体分子。 但是,当靶片段的末端与载体不匹配时， 必须转换其中一个或两个片段的末端形式以便使之连接。这种 末端的转换通常用以下三种方式转换：
载体DNA和目的基因DNA的连接,按DNA片 段末端性质不同，可有下述不同的连接方法：
① 粘性末端连接法 ② 平端连接法 ③ 同聚物加尾连接法 ④ 人工接头连接法
1. 同一限制酶切位点连接:
由同一限制性核酸内切酶切割的不同DNA片段具有完 全相同的末端。只要酶切割产生单链突出的粘性末端 和酶切位点附近的DNA序列不影响连接 .在连接酶的 作用下即可形成重组DNA分子.
人工接头（DNA寡核苷酸连杆）是人工合成 的具有一个或数个特定 限制性内切酶识别和 切割序列的双股平端DNA 短序列。 由平端加 上新的酶切位点，再用限制酶切除产 生粘性 末端，而进行粘端连接。
优点：是进行DNA重组的一种既有效又实用的手 段，兼具有同聚物加尾法和粘性末端连接法的优 点，而且它可以根据实验的不同要求，设计出具 有不同限制酶位点的人工接头。若在体外连接反 应中增加人工接头的浓度，还会大大提高平末端 DNA片段间的连接效率。
不会自身环化，转化率高，转化后的细菌克隆大 多数携带有目的基因的重组质粒。
一些内切酶如HaeⅢ和HpaⅠ切割产生DNA的 片段没有粘性末端，而是平末端。 具有平末端的 酶切载体只能与平末端的目的基因连接。 T4DNA 连接酶可催化相同或不相同的限制性内切酶切割 的平端间的连接。 平端连接比粘性末端连接要困 难的多，其连接效率很低，约有粘性末端连接的 1%。
基因工程的基本操作程序+第2课时+示范教案
第2节基因工程的基本操作程序（第2课时）◆教学目标1．列举将目的基因导入植物细胞、动物细胞和微生物细胞的方法。
2．列举检测与鉴定目的基因在受体细胞中是否稳定维持和表达其遗传特性的方法。
3．能够用流程图的形式概括出基因工程的操作程序。
4．针对人类生产或生活中的某一需求，能运用基因工程技术尝试设计并获得某一转基因产品的方案。
◆教学重难点【教学重点】1．将目的基因导入受体细胞的方法。
2．目的基因的监测与鉴定。
【教学难点】农杆菌转化法。
◆教学过程【新课引入】教师展示资料：研究人员将一种海鱼的抗冻蛋白基因afp整合到土壤农杆菌的Ti质粒上，然后用它侵染番茄细胞，获得了抗冻的番茄品种。
【学生活动】阅读上述资料，思考抗冻番茄培育过程中的目的基因和运载体分别是什么？（抗冻蛋白基因afp，Ti质粒）如何构建基因表达载体？（学生复习上一节课的内容）重组Ti质粒侵染番茄细胞属于基因工程中的哪一步操作？（将目的基因导入受体细胞）如何检测才能证明转基因抗冻番茄转化成功呢？【过渡】先来认识什么是转化呢？【新知讲解】一、将目的基因导入受体细胞转化：目的基因进入受体细胞内，并在受体细胞内维持稳定和表达的过程。
【教师活动】引导学生思考，根据生物学知识，受体细胞可能有哪些种类？提示：（1）植物细胞——体细胞或受精卵（植物容易诱导全能性表达）（2）动物细胞——受精卵（全能性最高）（3）微生物细胞——大肠杆菌（使用最广泛）（一）将目的基因导入植物细胞【教师活动】教师结合植物花的结构讲授花粉管通道法，并向学生阐述，“花粉管通道法”是我国科学家独创的一种方法，增强学生的民族自信心。
1．花粉管通道法方法一：用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中。
方法二：在植物授粉后的一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借花粉管通道进入胚囊。
2．农杆菌转化法【学生活动】学生自主阅读教材81页资料卡中“农杆菌转化法”的内容，思考为什么选择农杆菌？它具有的怎样的优势？“农杆菌转化法”操作流程是怎样的？提示：可侵染植物细胞；具有T-DNA。
动物基因工程—目的基因导入受体细胞
目的基因导入受体细胞
二、基因导入方法
（1）显微注射法 利用显微注射仪，通过机械方法把外源DNA直接注入细胞质或细胞核的基因转化
方法。 一般是微管吸取供体DNA溶液，在显微镜下准确地插入受体细胞核中，并将
DNA注入进去。此法常用于转基因动物的基因转移。
将外源基因用微玻璃管在显微镜下注射入受精卵细胞核中
目的基因导入受体细胞
一、受体细胞（receptor cell）
作为基因工程的宿主细胞必须具备的条件： 便于重组DNA分子导入；能使重组DNA分子稳定 存在；便于便于重组体的筛选；遗传稳定性高，易于扩 大培养；安全性高，无致病性，不会对外界环境造成生 物污染；利于外源基因蛋白产物高效表达。
目的基因导入受体细胞
入的外源基因进行遗传分析。
目的基因导入受体细胞
一、受体细胞（receptor cell）
原核生物受体细胞缺点
原核生物细胞不具备真核生物的蛋白质折叠复性系统，即使真核生物基 因能得到表达，得到的多是无特异性空间结构的多肽链。
原核生物细胞缺乏真核生物的蛋白质加工系统，而许多真核生物蛋白质 的生物活性正是依赖于其侧链的糖基化或磷酸化等修饰作用。
二、基因导入方法
（4）基因枪法
又称微弹轰击法，是利用高速运行的金属颗粒（微弹，1um）轰击细胞时能进入细胞内的 现象，将包裹在金属颗粒（钨或金颗粒）表面的外源DNA分子随之带入细胞进行表达的基 因转化方法。
基本做法：先将外源DNA溶液与钨或金颗粒（直径0.5-um）共同保温，使DNA吸附于金 属颗粒表面，然后放电加速金属颗粒，使之以400m/s的速度直接喷射受体细胞，外源 DNA随金属颗粒进入细胞内部。
具有趋化性的农杆菌移向这类植物受伤细胞，并将其Ti质粒上的T-DNA转移至细 胞内部。根据这一性质，将待转移的目的基因组入Ti质粒载体，通过农杆菌介导进入 植物细胞，与染色体DNA整合，得以稳定维持或表达。
人教版高中生物选修3检测目的基因导入受体细胞目的基因的检测与鉴定
第2课时将目的基因导入受体细胞目的基因的检测与鉴定一、选择题题型一目的基因导入受体细胞1．受体细胞不同，将目的基因导入受体细胞的方法也不相同，下列受体细胞与导入方法匹配错误的是()选项受体细胞导入方法A 棉花细胞花粉管通道法B 大肠杆菌农杆菌转化法C 羊受精卵显微注射技术D 小麦细胞基因枪法答案 B解析花粉管通道法是一种十分简便、经济的方法，我国的转基因抗虫棉就是用此种方法获得的，A正确；将目的基因导入微生物细胞，常采用感受态细胞法(Ca2＋处理法)，这种方法能使大肠杆菌细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，B错误；显微注射技术是将目的基因导入动物细胞(如羊受精卵)的最常用、最有效的方法，C正确；双子叶植物和裸子植物常用农杆菌转化法导入目的基因，单子叶植物(如小麦)可用基因枪法导入目的基因，D正确。
2．农杆菌转化法转移目的基因进入受体细胞后，目的基因插入的位置是() A．Ti质粒上B．受体细胞染色体的DNA上C．T-DNAD．农杆菌的拟核答案 B解析在农杆菌转化法中利用农杆菌的T-DNA将目的基因整合到受体细胞染色体的DNA上。
3．目前将目的基因导入动物细胞最常用、最有效的方法是()A．显微注射法B．农杆菌转化法C．基因枪法D．花粉管通道法答案 A解析显微注射法是迄今为止将目的基因导入动物细胞中采用最多、最有效的一种方法。
4．在基因工程技术中，需要用氯化钙处理的环节是()A．目的基因的提取和导入B．目的基因与载体结合C．将目的基因导入受体细胞D．目的基因的表达答案 C解析如果载体是质粒，受体细胞是细菌，一般是将细菌用氯化钙处理，使其成为感受态细胞，使含有目的基因的重组DNA分子更容易进入受体细胞，目的基因导入受体细胞后，就可以随着受体细胞的复制而复制。
5．基因工程中科学家常采用细菌、酵母菌等微生物作为受体细胞的主要原因是()A．结构简单，操作方便B．繁殖速度快C．遗传物质含量少，易操作D．性状稳定，变异少答案 B解析微生物一般具有以下几个特点：①个体微小，结构简单；②繁殖快，在实验室培养条件下细菌几十分钟至几小时可以繁殖一代；③代谢类型多，活性强；④易变异，相对于高等生物而言，较容易发生变异。
高中生物专题1基因工程1.2第2课时将目的基因导入受体细胞和目的基因的检测与鉴定教案高二生物教案
第2课时 将目的基因导入受体细胞和目的基因的检测与鉴定[学习目标] 1.熟悉目的基因导入受体细胞的方法。
2.了解农杆菌转化法。
3.画出DNA 分子杂交示意图。
4.目的基因的检测方法的比较。
知识点一 将目的基因导入受体细胞知识梳理1.转化的含义：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内□01维持稳定和表达的过程。
2．将目的基因导入植物细胞(1)□01农杆菌转化法：将目的基因导入□02双子叶植物和裸子植物最常用的方法 ①农杆菌特点：当植物体受到损伤时，伤口处的细胞会分泌大量的□03酚类化合物，吸引农杆菌移向这些细胞，这时农杆菌中的□04Ti 质料上的T －DNA(可转移的DNA)可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞染色体的□05DNA 上。
②受体细胞：植物□06体细胞或受精卵。
③操作过程：将目的基因插入到□07Ti 质粒的TDNA 上―→转入□08农杆菌―→导入□09植物细胞―→目的基因整合到□10受体细胞染色体的DNA 上―→目的基因表达。
(2)基因枪法：适用于□11单子叶植物，成本较高。
是利用压缩气体产生的动力，将包裹在金属颗粒表面的□12表达载体DNA 打入受体细胞中，使目的基因与其整合并□13表达的方法。
(3)花粉管通道法：我国科学家独创的方法花粉管通道法，就是在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前，剪去□14柱头；然后，滴加□15DNA(含目的基因)，使目的基因借助□16花粉管通道进入受体细胞。
该方法十分简单经济。
我国的转基因抗虫棉就是用此种方法获得的。
3．将目的基因导入动物细胞(1)方法：□01显微注射技术，采用最多、最有效的方法。
(2)受体细胞：动物的□02受精卵。
(3)操作过程：将含有□03目的基因的表达载体提纯―→取卵(□04受精卵)―→□05显微注射―→受精卵经胚胎早期培养后，□06移植到雌性动物的□07输卵管或子宫内―→获得□08新性状的动物。
4．将目的基因导入微生物细胞(1)方法01Ca2＋处理细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态(这种细①用□胞称为□02感受态细胞)。
人教版 选择性必修三 将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定 教案
二将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定一、将目的基因导入受体细胞1．转化：是指目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。
2．将目的基因导入植物细胞的方法3．将目的基因导入动物受精卵的方法：利用显微注射将目的基因注入动物的受精卵中。
4．将目的基因导入微生物细胞的方法：常用原核生物作为受体细胞，其中以大肠杆菌应用最为广泛。
先用Ca2＋处理大肠杆菌细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，再将重组的基因表达载体导入大肠杆菌细胞中。
[提醒]微生物(大肠杆菌、酵母菌等)具有繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少等优点。
二、目的基因的检测与鉴定[提醒]PCR不仅可用于获取和扩增目的基因，还能用于检测受体细胞中是否含有目的基因或受体细胞中的目的基因是否转录出mRNA。
(1)将目的基因导入植物细胞一般采用农杆菌转化法。
()(2)为培育抗除草剂的作物新品种，导入抗除草剂基因时只能以受精卵为受体。
()(3)常用卵细胞作为培育转基因动物的受体细胞。
()(4)转基因抗虫棉植株抗虫效果的鉴定必须通过分子检测。
()(5)抗虫基因即使成功地插入植物细胞染色体上也未必能正常表达。
()(6)检测目的基因是否插入受体细胞的DNA中，可用抗原—抗体杂交技术。
()答案：(1)√(2)×(3)×(4)×(5)√(6)×知识点一将目的基因导入受体细胞1．农杆菌转化法中的两次拼接和两次导入第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的T-DNA上；第二次拼接(非人工操作)是指插入目的基因的T-DNA被拼接到受体细胞的染色体DNA上。
第一次导入是将含目的基因的Ti质粒转入农杆菌；第二次导入(非人工操作)是指将含目的基因的T-DNA导入受体细胞。
2．受体细胞的选择(1)对于植物来说，受体细胞可以是受精卵或体细胞，因为植物细胞具有全能性。
(2)对于动物来说，受体细胞一般是受精卵，因为受精卵的全能性高，而高度分化的动物体细胞的全能性受到抑制。
高中生物选修 基因工程 目的基因的导入、检测与鉴定
第8课时目的基因的导入、检测与鉴定[学习目标] 1.理解目的基因导入受体细胞的方法。
2.掌握检测与鉴定目的基因的方法。
[核心素养] 1.科学思维：结合生产实际，举例说出基因工程的基本程序。
2.社会责任：针对生产生活中的某一需求，尝试提出基因工程构想，完成初步设计。
一、将目的基因导入受体细胞1.转化的含义目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。
2.转化的方法(1)导入植物细胞①农杆菌转化法：将目的基因导入双子叶植物和裸子植物时最常用的方法。
a.土壤农杆菌的特点：植物体受到损伤时，伤口处的细胞会分泌大量的酚类化合物，吸引农杆菌侵染，其Ti质粒上的T-DNA(可转移的DNA)可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞的染色体的DNA上。
b.方法步骤：目的基因插入Ti质粒的T-DNA上→转入农杆菌→导入植物细胞→目的基因插入植物细胞中的染色体DNA上→目的基因表达。
②基因枪法：将目的基因导入单子叶植物常用的方法。
表达载体DNA包裹在微小的金粉粒子或钨粉粒子表面→用基因枪高速射入受体细胞或组织中→目的基因表达。
③花粉管通道法：在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前，剪去柱头，滴加DNA(含目的基因)，使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞。
(2)导入动物细胞①方法：显微注射技术。
②常用受体细胞：受精卵。
③步骤：目的基因表达载体提纯→取卵(受精卵)→显微注射→胚胎早期培养→移植到雌性动物的输卵管或子宫内→获得具有新性状的转基因动物。
(3)导入微生物细胞①原核生物的特点：繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少等。
②常用的方法a.用Ca2＋处理细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态(这种细胞称为感受态细胞)。
b.感受态细胞和重组表达载体DNA分子在缓冲液中混合，在一定的温度下促进感受态细胞吸收DNA分子。
1.将胰岛素基因的表达载体导入大肠杆菌，从大肠杆菌中获得的“胰岛素”未能达到期待的生物活性，导致这种差异的原因可能是什么？提示大肠杆菌是原核生物，无内质网、高尔基体等细胞器，大肠杆菌中基因表达获得的蛋白质未经加工。
5-目的基因的重组导入
转化 加入 1mLSOC 培养液
10-100L转化液涂 含抗菌素的平板
（3） 平板 培养细菌
10-100L转 化液
涂于含抗 菌素的平 板
37℃过夜
4.转化率和影响转化率的因素
每gDNA转化成功的细菌克隆数 总受体细胞所获的转化成功的细菌数
（1）重组质粒
①环形质粒数 环形重组质粒 质粒自我连接 线性载体或DNA片段进入细菌会被降解。
收DNA复合物，球状细胞复原并分裂增殖。在选择性培 养基平板上可挑选所需的转化子。简单，但转化效率不
高（106-108/gDNA）。
10ng载 体DNA 100L感 受态菌 10-100L转化 液涂含抗菌素 的平板
吸附DNA On ice混 合，静置 10分钟
摄入DNA 42º C 1.5分钟
二乙氨乙基葡聚糖能促进哺乳动物细胞摄入外 源DNA。
1
葡聚糖 DEAE
预处理
细胞
摄入
外源DNA
2
外源DNA
混合
细胞
吸附到细胞表面后被细胞吞入，部分DNA可 以进入到细胞核里。 DEAE对细胞有毒!
本章思考题（3）
1、重组DNA分子在导入受体前如何保证插入的正确？ 2、受体的选择有什么要求？ 3、导入大肠杆菌受体的方法有哪些？ 4、导入植物细胞的方法有哪些？ 5、导入动物细胞的方法有哪些？ 6、简述各种重组DNA导入法的优缺点。
但移码突变！
4. 防止载体自身环化连接 （1）提高插入片段的用量
（2）用碱性磷酸酶处理载体
5’
3’ 插入片段
载体
载体和外源DNA插入片段的连接结果
受体细胞：
原核生物细胞
真核生物细胞 酵母菌细胞
目的基因导入受体细胞及重组子的筛选
活化菌种，扩大培养，使其 处于对数生长后期 （OD600=0.4）
3-4 ml菌液冰水浴中10 分钟，4 ℃离心集菌
转 入 37 ℃ 水 浴 上5 min， 加入 1 ml不含选择性 药 物 的 LB 培 养 基
转入42 ℃水浴 上 2 min ， 使 感受态细胞吸 收重组DNA。
0.2 ml新制备好 的感受细胞中加 入缓冲液溶解的 重 组 DNA ， 置 于冰水浴中1 h 以上，期间轻摇 几次
第三节 重组子的筛选
在重组DNA分子的转化、转染或转导过程中，并非所有的受 体细胞都能被导入重组DNA分子，一般仅有少数重组DNA分子能 进入受体细胞。再者，在这些被转化的受体细胞中，除部分含 有我们期待的DNA分子外，另外一些还可能是由于载体自身或 一个载体与多个外源DNA片段形成的非期待重组DNA分子导入所 致。因此，需要采取必要的方法将重组子从大量的受体细胞中 筛选出来。 ■转化子：导入外源DNA分子后能稳定存在的受体细胞称为转 化子。 ■重组子：含有重组DNA分子的转化子称为重组子。
受体细胞在遗传密码的应用上无明显的偏倚性。 具有较好的转译后加工机制，便于真核目的基因的高效表达。 在理论研究和生产实践上有较高的应用价值。
3.各种类型受体细胞的优缺点
（1）原核细胞 ■优点 大 部 分 原 核 细 胞 没 有 纤 维 素 组 成 的 坚 硬 细 胞 壁 ， 便 于 外 源 DNA的进入。 没有核膜，染色体DNA没有固定结合的蛋白质，这为外源DNA 与裸露的染色体DNA重组减少了麻烦。 基因组简单，不含线粒体和叶绿体基因组，便于对引入的外 源基因进行遗传分析。 原核生物多数为单细胞生物，容易获得一致性的的实验材料， 并且培养简单，繁殖迅速，实验周期短，重复实验快。
专题1 1.2.2 目的基因的导入、检测与鉴定
1．2.2目的基因的导入、检测与鉴定[学习目标] 1.理解目的基因导入受体细胞的方法。
2.掌握检测与鉴定目的基因的方法。
方式一通过前面的学习，我们了解了基因工程中目的基因的获取和基因表达载体的构建。
在目的基因与载体连接成重组DNA分子以后，下面的重要工作主要是将其导入受体细胞进行扩增和筛选，获得大量的重组DNA分子，这就是外源基因的无性繁殖，即克隆(cloning)。
方式二目的基因导入受体细胞后，是否可以稳定维持和表达其遗传特性，只有通过检测与鉴定才能知道。
这是基因工程的第四步工作。
在完成将目的基因导入受体细胞这一步骤后，在全部的受体细胞中，真正能够摄入重组DNA分子的受体细胞是很少的。
因此，必须通过一定的手段对受体细胞中是否导入了目的基因进行检测。
检测的方法有很多种，例如，大肠杆菌的某种质粒具有青霉素抗性基因，当这种质粒与外源DNA组合在一起形成重组质粒，并被转入受体细胞后，就可以根据受体细胞是否具有青霉素抗性来判断受体细胞是否获得了目的基因。
重组DNA分子进入受体细胞后，受体细胞必须表现出特定的性状，才能说明目的基因完成了表达过程。
一、将目的基因导入受体细胞1．转化的含义目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。
2．转化的方法(1)导入植物细胞①农杆菌转化法：将目的基因导入双子叶植物和裸子植物时最常用方法。
a．土壤农杆菌的特点：植物体受到损伤时，伤口处的细胞会分泌大量的酚类化合物，吸引农杆菌侵染，其Ti质粒上的T-DNA(可转移的DNA)可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞的染色体的DNA上。
b．方法步骤：目的基因插入Ti质粒的T-DNA上→转入农杆菌→导入植物细胞→目的基因插入植物细胞中的染色体DNA上→目的基因表达。
②基因枪法：将目的基因导入单子叶植物常用的方法。
目的基因包裹在微小的金粉粒子或钨粉粒子表面→用基因枪高速射入受体细胞或组织中→目的基因表达。
③花粉管通道法在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前，剪去柱头，滴加目的基因，使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞。