基因工程-6章 重组DNA导入受体细胞

二、选择受体细胞的基本原则
①便于重组DNA分子的导入。 ②便于重组体的筛选。
③遗传稳定性高，易于进行扩大培养或易于进行高密 度发酵而不影响外源基因的表达效率。对动物细胞 而言，所选用的受体细胞具有对培养的适应性强， 可以进行贴壁或悬浮培养，可以在无血清培养基中 进行培养。
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④受体细胞内内源蛋白水解酶基因缺失或蛋白酶 含量低，利于外源蛋白表达产物在细胞内积累， 可促进外源基因高效分泌表达。 ⑤安全性高，无致病性，不会对外界环境造成生 物污染。一般选用致病缺陷型的细胞或营养缺 陷型细胞作为受体细胞。
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6、微注射技术

微注射技术：一般是用微吸管吸取供体DNA溶液， 在高倍倒置显微镜下准确地插入受体细胞核中， 并将DNA注射进去。常用于转基因动物研究。
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7、脂质体导入法

脂质体也称人工细胞膜，是由脂质双分子层组成 的，磷脂分子在水中可自动生成闭合的双层膜, 从而形成一种囊状物被称为脂质体。 脂质体导入法:将DNA或RNA包囊于脂质体内，然 后进行脂质体与细胞膜的融合，通过融合导入细 胞,这种转染方法称为脂质体导入法。

此方法对于贴壁细胞转染是最常用并首选的方法。
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磷酸钙-DNA共沉淀法
3、共转化（植物细胞）
共转化(cotransformation) 基因工程中将两个以上的基因同时导入感受 态真核细胞的方法，又称共转染。 适用于对不带有可选择标记性状的目的基因 进行研究。
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附图1
CaCl2热激法转化感受态细胞
附图2
2、磷酸钙-DNA共沉淀法（动物细胞）
磷酸钙-DNA共沉淀法 是指外源基因与磷酸钙混合形成磷酸钙-DNA共沉 淀物，可使DNA附在细胞表面，通过细胞吞入摄取 或通过细胞膜脂相收缩时裂开的空隙进入细胞内， 这种转染方法称为磷酸钙-DNA共沉淀法。


③基因组简单，不含线粒体和质体基因组，便于 对引入的外源基因进行遗传分析。
④原核生物多数为单细胞生物，容易获得一致性 的实验材料，并且培养简单，繁殖迅速，实验周 期短，重复实验快。
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原核生物细胞表达真核生物基因存在的缺点：

①原核生物细胞不具备真核生物的蛋白质折叠复 性系统，即使许多真核生物基因得以表达，得到 的也多是无特异性空间结构的多肽链。 ②原核生物细胞缺乏真核生物的蛋白质加工系统， 而许多真核生物蛋白质的生物活性正是依赖于其 侧链的糖基化或磷酸化等修饰作用。
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基因工程常用的受体细胞有:
大肠杆菌 枯草杆菌
土壤农杆菌
酵母菌
植物细胞
动物细胞
大肠杆菌
1、原核生物细胞的优点

①大部分原核生物细胞没有纤维素组成的坚硬细 胞壁，便于外源DNA的进入。 ②没有核膜，染色体DNA没有固定结合的蛋白质， 这为外源DNA与裸露的染色体DNA重组减少了麻烦。
Turtle HMGB1 0 1 1 1 0 2 2 7
Chick HMGB1 0 0 2 2 1 1 2 8
Mouse HMGB1 1 0 6 1 3 2 3 16
Human HMGB1 0 0 3 1 2 2 6 14
Human HMGB2 2 0 3 2 1 3 2 13
Human HMGB3 0 0 4 2 1 2 5 14
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电穿孔法
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5、基因枪法
基因枪法(又称粒子轰击法) 用高压气体加速把粘有DNA的细微金粉(或钨 粉颗粒)打向细胞，穿过细胞壁、细胞膜、细胞 质等层层构造到达细胞核，完成基因转移的方 法。 基因枪法适用于动植物组织或细胞、胚胎、细 菌及小动物等。 基因枪法特点：快速、简便、安全、高效。
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4、电转化
电转化又称电穿孔法(electroporation):

是指在细胞上施加短暂、高压的电流脉冲，在质膜上 形成纳米大小的微孔，DNA直接通过这些微孔或者作 为微孔闭合时所伴随发生的膜组分重新分布通过质膜 进入细胞质中，这种方法称为电穿孔法。

最早用于将DNA导入真核细胞,1988年,Dower等人成功 应用于大肠杆菌的转化。基本原理是利用高压电脉冲 作用，在大肠杆菌细胞膜上进行电穿孔，形成可逆的 瞬间通道,从而促进外源DNA的有效吸收。
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将目的基因表达载体DNA和标记基因表达载 体DNA混合后共同转移到靶细胞中，分别使 用标记基因与目的基因对应的选择剂进行两 次筛选，最后可得到复合转导的转化子。

共转化常用的报告基因:胸苷激酶基因(tk基因)、 抗新霉素基因(neor)、鸟嘌呤磷酸核糖转移酶 基因(XGPRT)等。
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脂质体介导转染的机制

阳离子脂质体表面带正电荷，能与核酸的磷酸根通 过静电作用将DNA分子包裹人内，形成DNA一脂复合 体，也能被表面带负电荷的细胞膜吸附，再通过膜 的融合或细胞的内吞作用，偶尔也通过直接渗透作 用,将DNA传递进入细胞，形成包涵体或进入溶酶体, 其中一小部分DNA能从包涵体内释放,并进入细胞质 中,再进一步进入核内转录、表达。
发展前景
生物学的研究表明，在地球上有许多动物具有很多
种优良的特性，是我们所不具备而又想具备的（猫
头鹰可以在黑夜看清东西；壁虎有再生能力）。如 果我们具备了地球上200种生物所有的优良特性，我
们的威力将会多么的强大！生物工程的发展表明，
这是完全有可能的。
本章重点掌握的内容




概念:受体细胞、电穿孔法、共转化、基因枪法、 感受态细胞、转化、转染、磷酸钙-DNA共沉淀法、 微注射技术。 选择受体细胞的基本原则 氯化钙转化法的基本原理 脂质体介导法及其转染的机制 常用的基因导入受体细胞的方法。 原核生物细胞作为受体细胞的优点与缺点。 酵母菌作为受体细胞的优点。 哺乳动物细胞作为受体细胞的优点与缺点。
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根据转移基因载体与受体的特性可分为：


质粒载体导入受体细胞的方法：CaCl2、电转化法；
噬菌体转染细胞的方法：体外包装感染法； DNA导入酵母菌的方法：电穿孔转化法； DNA导入植物细胞的方法：Ti质粒叶盘法、电穿孔转 化法、基因枪法；


DNA导入昆虫细胞的方法：杆状病毒感染法；
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3、动物细胞
常用的动物受体细胞有Hela细胞、猴肾细胞和中国 仓鼠巢细胞(CHO)等。
MCF-7
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哺乳动物细胞作为受体细胞的优点是：
①能识别和除去外源真核基因中的内含子，剪接加工成成熟的 RNA。 ②真核基因表达蛋白在翻译后能被正确加工或修饰,产物具有 较好的蛋白质免疫原性,约为酵母细胞16-20倍。 ③易被重组DNA质粒转染,具有遗传稳定性和可重复性。 ④经转化的动物细胞可将表达产物分泌到培养基中，便于提纯 和加工，成本低。 缺点是:组织培养技术要求高，如培养和筛选一个高度扩增的 转化子CHO细胞，通常需要数月之久,难度较大。
重组DNA技术操作过程可形象归纳为
分 切 接 转 筛 分离目的基因 限制酶切目的基因与载体 拼接重组体 转入受体菌 筛选重组体
第六章 重组DNA导入受体细胞
一、受体细胞 二、选择受体细胞的基本原则
三、重组DNA导入受体细胞的方法
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一、受体细胞
受体细胞(receptor cell) 又称为宿主细胞 (host cell)，是指能摄取外源 DNA并使其稳定维持的细胞。 感受态(competence) 是指细菌吸收外源DNA的生理状态。 感受态细胞(competence cell) 是指具有接受外源DNA能力的细胞。
转染(transfection):指感受态的大肠杆菌细胞捕获噬 菌体或以它为载体构建的重组DNA分子的过程。 转导(transduction):指病毒转移真核细胞A的过 程或噬菌体介导的细菌细胞之间基因转移的过程。



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1、氯化钙转化法（大肠杆菌）
●
1970年M.Mandel和A.Hige发现,大肠杆菌经过氯 化钙适当处理及短暂热休克之后,便能吸收λ噬菌 体DNA。1972年美国斯坦福大学 S.Cohen报道,经 氯化钙处理大肠杆菌细胞也能摄取质粒DNA。
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⑥能使重组DNA分子稳定存在于细胞中。
⑦受体细胞在遗传密码子的应用上无明显偏倚性。
⑧具有较好的转译后加工机制等，便于真核目的基 因的高效表达。
⑨在理论研究和生产实践上有较高的应用价值。
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稀有密码子：
Amino acid Leu Ile Pro
Rare codon CTA ATA CCC CGG
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载体与目的基因连接后，体系中可能存在下列 分子： a. 未连接的载体分子 b. 未连接的DNA片段 c. 载体的自连 d. 含有错误插入片段的重组DNA分子 e. 重组DNA分子
转化过程中，这些分子同时被转移到宿主细胞内。 未连接的分子即使被细菌摄取，寄主的酶可降解 这些DNA片段。 自连的载体和错误插入的重组质粒可以进入宿主 细胞进行正常的复制
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技术的忧患
1.基因污染： 人工组合的基因，可能会通过转基因作物或家养动物扩展 到其他栽培作物或自然界野生物种，并成为后者基因的 一部分。这就是基因污染。 2.基因武器 运用遗传工程技术，按人们需要，在一些致病细菌或病毒 中，接入能对抗普通疫苗或药物的基因，产生具有显著 抗药性的致病菌；或者在一些本来不会致病的微生物体 内接入致病基因，而制造出新的生物制剂。