蛋白质双向电泳及质谱技术
双向电泳实验蛋白质样品制备要点
双向电泳实验蛋白质样品制备要点1.选择适合的样品预处理方法：蛋白质样品预处理的方法包括提取、富集和纯化等。
常见的方法有溶细胞法、组织破碎法和亲和层析法等。
根据具体实验目的和样品特点，选择适合的方法进行样品预处理是确保蛋白质样品质量的重要因素。
2. 选择合适的蛋白质溶液：根据目的不同，选择适于蛋白质分离的缓冲液和胶液。
常用的缓冲液有Tris-Glycine、Tris-Tricine和Tris-Acetate等，常用的胶液有聚丙烯酰胺凝胶和聚丙烯酰胺/聚丙烯酰胺共聚物凝胶等。
根据蛋白质的特性和实验要求，选择合适的缓冲液和胶液可以提高分离效果和样品质量。
3. 蛋白质样品质量检测：在进行双向电泳实验前，需要对蛋白质样品进行质量检测。
常见的检测方法包括BCA法、Lowry法和Bradford法等。
这些方法可以测定样品中的蛋白质浓度，以确保实验的准确性和可重复性。
4.样品处理与加载：在进行双向电泳实验时，需要将蛋白质样品进行处理和加载，以便进行分离和鉴定。
样品处理的方法包括蛋白质还原、脱脂和蛋白质标记等。
蛋白质还原可使用还原剂如二巯基乙酸、巴布威和三丁基磺酸等，蛋白质脱脂可使用胰酶和胰酶胰凝乳酶等。
加载样品时，需要控制样品数量和均匀性，避免过多或过少的加载，以避免样品定位和分离差异。
5.电泳条件的优化：电泳条件的选择和优化是双向电泳实验的关键。
根据样品特性和实验目的，调整电场强度、升温速率和电泳时间等参数，以获得较好的分离效果。
此外，还需要注意电泳温度的控制，避免样品的热失活和电场影响。
6.截胶和染色：双向电泳实验结束后，需要进行截胶和染色步骤，以检测和鉴定分离的蛋白质。
截胶可使用染色剂如胭脂红和银染等，染色后可以通过人工或自动扫描仪对蛋白质进行定量和定位。
7. 数据分析和解释：双向电泳实验获得的数据需要进行分析和解释。
常见的数据分析方法包括质谱分析、2D胶电泳图像比较和蛋白质鉴定工具（如万得鉴定和Mascot等）。
蛋白质双向电泳简介
胶条平衡
在第二向SDS-PAGE分离前,必须要平衡IEF 胶。主要目的是用含有SDS的第二向介质 置换含有尿素的第一向介质,使分离蛋白质 与SDS能完全结合,保持蛋白质的巯基呈还 原状态,避免发生重氧化,确保在SDS-PAGE 过程中正常迁移。聚焦后的蛋白质在IEF胶 内处于其等电点处,净电荷为零,若未进行平 衡过程而直接进入第二向的SDS-PAGE分 离,蛋白质仍滞留在IEF胶中不能在第二向凝 胶中正常迁移。胶条平衡包括两个简短的 步骤,每步10~15 min。
复杂度较高的样品，为了尽可能的了解所包含的每种蛋白，需要反复实验才能完 成。如果将待检样品被富集以后则更易分析。
IPG胶条的pH范围
预试验确定 先宽后窄 先线性后非线性 先短后长
等电聚焦
胶条水合完成后,将开始运行等电聚焦。首先 在胶条两端接触电极处垫上水饱和的纸芯,以 防在高电压下胶条与电极的直接接触,损坏胶 条,同时可以吸附聚焦过程中迁移至两端的盐 离子。等电聚焦最好在高压电源下运行,在IPG 胶条的限制电流范围内迅速将电压升至最后的 目标电压。电压(V)与时间(h)的整合被称为伏 特小时(Vh),可以作为一个相同样品在不同运行 时间比较重现性的参数,也可以作为聚焦是否 充分的指标
增加样品溶解性的手段
变性剂：通过改变溶液中的氢键结构使蛋白质充分伸展， 将其疏水中心完全暴露，降低接近疏水残基的能量域。其 典型代表是尿素和硫尿。
表面活性剂：经过变性剂处理而暴露蛋白质的疏水基团后， 还常需至少一种表面活性剂来溶解疏水基团。常用的表面 活性剂有离子去污剂SDS、非离子去污剂Triton X-100和 NP-40、两性离子去污剂CHAPS、OBG等。其中CHAPS 和SB3-10最好。
蛋白质组学研究介绍结合双向电泳
蛋白质组学研究的主要内容和方法
蛋白质表达分析
研究不同生理或病理条件下蛋白质的表 达水平变化，揭示蛋白质的表达模式和
规律。
蛋白质相互作用研究
利用酵母双杂交、免疫共沉淀等技术 手段，研究蛋白质之的相互作用和
复合物的形成。
蛋白质功能研究
通过基因敲除、基因敲减、定点突变 等技术手段，研究蛋白质的功能和作 用机制。
智能化
结合人工智能和机器学习技术，实现双向电 泳的智能化分析，自动识别和鉴定蛋白质， 提高数据分析的准确性和可靠性。
拓展双向电泳技术的应用领域
临床诊断
01
将双向电泳技术应用于临床诊断，通过对生物标志物的检测和
分析，辅助医生进行疾病诊断和治疗方案的制定。
药物研发
02
利用双向电泳技术筛选和鉴定药物作用靶点，为新药研发提供
蛋白质芯片技术
高通量、快速、简便，但灵敏度和分辨率相对较低，且覆盖的蛋白质数量有限。
双向电泳与蛋白质免疫印迹技术的比较
双向电泳
可以对全蛋白质组进行分离和定性，分 辨率高。
VS
蛋白质免疫印迹技术
可以对特定蛋白质进行检测和定量，灵敏 度高，但只能针对已知的蛋白质进行检测 。
05
双向电泳技术的发展前景 和展望
蛋白质的纯化
通过双向电泳，可以去除样品中的杂 质，提高蛋白质的纯度，从而获得更 准确的鉴定结果。
蛋白质的表达和鉴定
蛋白质表达分析
通过比较不同生理状态或不同组织中 蛋白质的表达模式，可以研究蛋白质 的表达水平，进而了解其在生命活动 中的作用。
蛋白质鉴定
通过与已知蛋白质的数据库进行比对， 可以鉴定出双向电泳图谱中的蛋白质， 为后续的功能研究提供依据。
蛋白质谱i
蛋白质谱（Proteomic spectrum）是指对蛋白质进行分离、鉴定和定量分析的一种技术手段。
蛋白质谱技术主要包括双向电泳（Two-dimensional gel electrophoresis，2-DE）、质谱法（Mass spectrometry，MS）等。
通过蛋白质谱技术，研究人员可以研究细胞、组织或生物体中的蛋白质组成和表达差异，从而揭示生物学过程中的分子机制。
蛋白质谱的主要步骤如下：
1. 蛋白质分离：将样品中的蛋白质分离出来，通常采用双向电泳技术。
双向电泳是将蛋白质样品在聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳，然后将凝胶中的蛋白质进行染色和扫描，获得蛋白质的分布情况。
2. 蛋白质鉴定：对分离出的蛋白质进行质谱分析，将蛋白质分解成肽段，并通过质谱仪检测肽段的质量。
质谱法包括多种技术，如矩阵辅助激光解吸/电离质谱（MALDI-TOF MS）、电喷雾质谱（ESI-MS）等。
3. 蛋白质定量：通过质谱法检测蛋白质的相对含量。
质谱法可以准确地测定蛋白质的质量，从而实现对蛋白质的定量分析。
4. 数据处理与分析：将实验数据进行处理和分析，获得蛋白质的表达量、序列信息等。
研究人员可以利用生物信息学工具对数据进行挖掘，寻找蛋白质之间的功能关联和调控关系。
蛋白质谱技术在生物学、医学等领域具有广泛的应用价值，可以帮助研究人员深入了解生命过程中的分子机制，为疾病诊断、治疗和预防提供新的思路。
此外，蛋白质谱技术在药物研发、生物工程、食品安全等领域也具有重要应用前景。
【最新】电泳分离蛋白质
【最新】电泳分离蛋白质电泳分离蛋白质是一种常用的生物化学技术，它利用蛋白质带电性质和分子大小的差异，将不同蛋白质分离出来。
下面是电泳分离蛋白质的最新技术和应用方面的详细介绍。
一、电泳分离蛋白质的基本原理电泳是在电场作用下，带电粒子在溶液中的迁移运动。
由于蛋白质具有带电性质，因此它们在电场中会发生迁移运动。
不同蛋白质的带电量和分子量不同，因此在电场中的迁移速度也不同。
通过控制电场强度和迁移时间，可以将不同蛋白质分离出来。
二、最新技术进展1.双向电泳（Two-Dimensional Electrophoresis）双向电泳是一种将等电聚焦和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳相结合的电泳技术。
它可以将蛋白质分离成多个斑点，并利用计算机图像处理技术进行定性和定量分析。
双向电泳可以用于比较不同样品之间蛋白质表达谱的变化，以及寻找疾病生物标志物等。
2.全蛋白质组学研究（Proteome Research）全蛋白质组学研究是一种对细胞、组织或生物体中所有蛋白质进行系统研究的学科。
它涉及到蛋白质分离、鉴定、定量和功能分析等方面。
利用双向电泳技术和质谱技术，可以系统地分离和鉴定细胞中的蛋白质，为全蛋白质组学研究提供有力支持。
3.微流控芯片技术（Microfluidic Chip Technology）微流控芯片技术是一种将生化分析过程集成在微米尺度芯片上的技术。
它具有高效、快速、自动化和微型化等优点，可以用于蛋白质分离、鉴定和检测等方面。
利用微流控芯片技术，可以实现在单细胞水平上对蛋白质进行检测和分析，为生命科学和医学研究提供有力支持。
三、应用领域1.疾病诊断与治疗利用电泳分离蛋白质技术，可以分离和鉴定疾病相关蛋白质，为疾病诊断和治疗提供有力支持。
例如，通过比较健康人和患者的血清蛋白谱，可以寻找疾病特异性标志物，为疾病诊断和治疗提供指导。
2.药物筛选与研发利用电泳分离蛋白质技术，可以分离和鉴定药物作用靶点，为药物筛选和研发提供有力支持。
双向电泳和质谱技术
双向电泳和质谱技术双向电泳和质谱技术是两种广泛应用于生物化学和生物物理学领域的分析方法。
它们通过不同的原理和技术手段，可以对生物分子进行定性和定量的分析。
本文将介绍双向电泳和质谱技术的基本原理、应用领域以及发展前景。
一、双向电泳双向电泳是一种常用的蛋白质分析方法，它通过电泳将蛋白质在两个正交方向上进行分离，从而实现高分辨率的分析。
其基本原理是利用蛋白质在电场中的电荷、大小和形状等特性，通过在两个方向上施加电场，不断地移动蛋白质分子，使其在凝胶中分散开来，最终实现完全的分离。
双向电泳技术在生物化学和生物物理学领域中有着广泛的应用。
它可以用于研究蛋白质的组成和结构，探索蛋白质相互作用的机制，寻找新的蛋白质标记和药物靶点等。
双向电泳技术的主要优点是分离效果好、分析速度快、灵敏度高。
然而，该技术也存在一些局限性，比如在分离过程中可能出现混叠现象，对样品要求较高等。
二、质谱技术质谱技术是一种以测定生物样品中质量与荷电比（m/z）为基础的分析方法，它可以对样品中的化合物进行分析和鉴定。
质谱技术的基本原理是将样品中的化合物通过电离技术转化为带电离子，然后根据离子在磁场中受到的作用力大小，测量离子的质量和荷电比，从而确定分子的质量。
根据质谱仪的不同类型和检测模式，质谱技术可以分为质谱仪、质谱成像、质谱图谱等多种形式。
质谱技术在生物化学和生物物理学领域中扮演着重要的角色。
它可以用于寻找新的生物标记物、研究代谢产品的组成、药物的代谢途径以及蛋白质的翻译后修饰等。
同时，质谱技术还可以与其他分析方法进行联用，如液相色谱联用质谱、气相色谱联用质谱等，以增强分析的灵敏度和分辨率。
三、双向电泳与质谱技术的结合双向电泳和质谱技术在生物科学研究中常常被结合使用，以实现更全面、深入的分析。
双向电泳可以将蛋白质分子进行高效的分离，而质谱技术可以对分离得到的蛋白质进行质量测定和结构鉴定。
通过双向电泳与质谱技术的结合，可以在一定程度上弥补两种方法的局限性，提高分析结果的准确性和可靠性。
双向电泳操作步骤
双向电泳操作步骤双向电泳是一种常用的蛋白质分离和纯化方法。
下面是一篇超过1200字的双向电泳操作步骤：双向电泳是一种通过两个不同方向的电场来进行蛋白质分离的方法。
它可以更好地区分具有不同等电点和分子质量的蛋白质，并用于研究蛋白质组学以及生物化学等领域。
以下是一般的双向电泳操作步骤：1.确保准备充足的电泳装置，包括双向电泳槽、平衡缓冲液、电泳缓冲液、电泳细胞等。
2.准备样品：将待分离的蛋白质样品进行适当的前处理，包括样品提取、蛋白质浓缩、去除干扰物等。
将样品溶解在适当的电泳缓冲液中。
3.将样品加载到电泳槽中：在准备好的电泳缓冲液中加入样品，然后将样品加载到电泳槽中的样品孔中。
注意，为了保持电泳稳定性，在样品孔加载样品后，要尽快将缓冲液加入到其他储备槽以保持全面和均匀的电解质浓度。
4.进行等电点电泳：将电泳槽中的样品浸没在平衡缓冲液中，并在两侧分别连接正负极。
设置合适的电流和电压，开始进行等电点电泳。
在等电点电泳过程中，蛋白质根据它们的等电点被定向地分离。
5.停止等电点电泳：根据需要进行电泳时间的设定，一般情况下为2-3小时。
等电点电泳时间结束后，关闭电源，并小心地取出电泳舱。
6.水平电泳：停止等电点电泳后，将样品塘从上清洗掉，并用水平电泳缓冲液进行冲洗。
然后，在两侧连接正负极，设置合适的电流和电压，开始水平电泳。
在水平电泳过程中，蛋白质根据它们的分子质量被定向地分离。
7.停止水平电泳：根据需要进行电泳时间的设定，一般情况下为4-5小时。
水平电泳时间结束后，关闭电源，并小心地取出电泳舱。
8.染色和图像采集：将分离完毕的样品进行染色，常用的染色方法包括银染和荧光染色。
然后，使用图像采集系统获取电泳图像，可根据需要调整采集参数。
9.数据分析和解释：通过对电泳图像的分析，包括珠状图、分子质量标准物的修正和待测蛋白质的标定等，将分离出来的蛋白质鉴定和定位。
10. 验证和验证：对其中感兴趣的蛋白质进行验证和验证。
蛋白组差异分析
百泰派克生物科技
蛋白组差异分析
蛋白质是细胞功能的直接执行者，由于细胞或组织中蛋白质种类和含量有所差异，因此它们行使不同的生物学功能，扮演不同的角色。
蛋白组差异分析就是分析不同样本如正常与病理状态样本、未处理与特殊处理条件下样本之间蛋白种类和含量的差异，通过寻找有意义的差异蛋白来揭示样本的生理或病理变化的分子机制。
差异蛋白组学在揭示生命活动的本质方面扮演着重要的角色，广泛应用于各类疾病的发生研究、临床诊断以及病情追踪等，也是作物遗传育种、基因工程产物鉴定以及蛋白类食物评价的重要手段。
目前，差异蛋白组学的分析方法包括双向电泳技术、质谱技术和SELDI蛋白芯片技术等。
双向电泳技术是目前蛋白质覆盖度最高的技术；质谱技术可以对差异蛋白进行定性和定量分析；SELDI蛋白芯片技术不需要复杂的预处理，可以直接对各种体液、细胞裂解液以及分泌物进行检测分析。
百泰派克生物科技采用高通量质谱平台提供差异蛋白质组学分析服务，可以对差异蛋白质进行定性和相对/绝对定量分析，欢迎免费咨询。
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增加样品溶解性的手段
•变性剂
– 改变氢键结构，使蛋白疏水中心暴露伸展 – 尿素、硫尿
•表面活性剂
– 溶解疏水基团 – 离子去污剂SDS、非离子去污剂Triton X-100和NP-40、两性离子去 污剂CHAPS等
•还原剂
– 使变性蛋白进一步伸展溶解 – 含自由巯基的DTT或-巯基乙醇，不带电荷的磷酸三丁酯(TPB)
36000vh
电压
时间
IPG 胶条的平衡
• 平衡液
– 6 M 尿素和30% 甘油 – 减少电内渗
• 第一步平衡
– 加DTT – 使变性的非烷基化蛋白处于还原状态
• 第二步平衡
– 加碘乙酰胺 – 使蛋白质巯烷基化，防止其在电泳过程中重新氧化
第二向: SDS-PAGE
• SDS 平衡 • SDS-PAGE
• 去污剂降解(酵母、霉菌)
– 降解缓冲液(含尿素和去污剂) – SDS(应在IEF前去除)
• 酶降解(植物、细菌、真菌)
– 溶菌酶(细菌) – 纤维素酶，果胶酶(植物) – 溶壁酶(酵母)
剧烈破碎法
• 超声破碎(细胞悬浮液)
– 需以冰冷却避免过热
• 弗式细胞压碎器(French pressure cell，带壁微生物
2-DE 分离的可溶性 E. coli 蛋白
目前双向电泳需解决的问题
• 样品的制备及溶解
– 不溶性蛋白(膜蛋白及核内蛋白) – 难分离蛋白(如毛发及皮肤中的蛋白)
• • • • •
载样量的提高 初步分离 低丰度蛋白、碱性蛋白及大分子量蛋白 定量分析 灵敏度及可重复性
对于双向电泳的建议
• 首先采用宽pH范围的胶条，确定蛋白的分布范围，通常采 用pH3-10的胶条 • 如果pH线性分布的胶条分离效果不好，可采用非线性胶条 • 加大蛋白上样量，提高局部蛋白的分辨率 • 采用窄pH范围的胶条，提高某pH范围蛋白的分辨率
• 第二向采用梯度胶进行分离
• 去除高丰度蛋白，进行蛋白的分级处理，富集低丰度蛋白
蛋白质质谱技术
质谱基础
检测 电离
质量分选(过滤)
离子源
形成离子 (带电分子)
质量分析器
根据m/z分选离子
离子检测器
为什么要进行样品制备 ？
目前双向电泳一般只能分辨到1000-3000个蛋白质 点(spot)，而样品中的蛋白种类可达到10万种以上。 待研究样本(如临床样本)常是各种细胞和组织混 杂，而蛋白质组研究的通常是单一的细胞类型。
样品制备原则
1 保证样品蛋白质完全溶解，分级效果好，干扰因素少
– 尽量使所有待分析的蛋白样品全部处于溶解状态（包括多数疏水性蛋 白）。 – 避免样品制备过程中发生样品的抽提后化学修饰（如酶性或化学性降 解等）。
DNA/RNA的去除
• 样品中含核酸的不利影响
– 能被银染色法染色 – 在凝胶酸性部分产生水平条纹 – 当样品到达IEF凝胶酸性端时，与蛋白质一同沉淀
• 去除方法
– – – – 蛋白沉淀法 DNase/RNase处理 超声(机械破坏)、超高速离心 DNA/RNA抽提(苯酚/氯仿)
其他杂质的去除
• 脂质
IPG 胶条支架
IPG 胶条 定位
泡涨目的：使样品能完全以可溶形式进入 IPG胶条内
蛋白载样量
IPG胶条对蛋白载样量的影响因素：
• 待分析的蛋白点的量应满足随后的质谱分析待研究蛋白的丰度 • 样品的复杂度
– 复杂度较高的样品，为了尽可能的了解所包含的每种蛋白，需要反复实验 才能完成。如果将待检样品被富集以后则更易分析。
用量
24g 尿素加入 25mL H2O 385mg DTT或 500uL 200mM TBP原液 2g 见下表 100uL 0.1% 原液 定容至50mL
IPG 用两亲性电解液的组成
IPG 胶 pH 范围 3-10 4-7 3-6 5-8 7-10
两亲性电 两亲性电 解液范围 解液浓度 (w/v) 3-10 40% 4-6 40% 5-7 40% 3-5 40% 4-6 40% 5-8 40% 7-9 40% 8-10 20%
• 关键-可溶性
– 获得可以重新溶解的蛋白
• 常用方法
– – – – – 硫酸铵沉淀 TCA沉淀 丙酮沉淀 TCA/丙酮沉淀 醋酸铵/甲醇/苯酚抽提
样品中杂质的去除
• 去除原则
– 尽量不丢失蛋白 – 减少蛋白的修饰
• 杂质的主要种类
– – – – DNA/RNA 脂质 多糖盐 离子去污剂
– 其他固体杂质
两性电解质
pH 9 聚丙烯酰胺 pH 3 +
样品
-
等点聚焦 (第一向)
第二向
分子量
SDS-PAGE
pH 梯度(pI)
双向电泳具体步骤
• 样品制备
– 缓冲液的配制
• IPG条重泡涨及上样 • 第一向：IEF • IPG条平衡
– 平衡缓冲液Ⅰ(还原) – 平衡缓冲液Ⅱ(巯烷基化)
• 第二向：SDS-PAGE • 胶条染色 • 成像及图像分析
3% Na2CO3 0.0185% 甲醛
0.004% DTT 溶液 30min
2.3M 柠檬酸
0.1% AgNO3 30min
5% 乙酸 25% 甲醇
染色方法
• 负染
– – – – –
– – – –
主要包括金属盐染料、锌－咪唑染料等的使用 能专门提高PAGE胶上蛋白质的回收率 速度快（5~15min）且能保持蛋白质的生物活性 不能用于膜上染色 适用于蛋白质显色、完整蛋白质的胶上被动提取以及质谱分析
• 固体杂质
– 阻塞胶体，影响蛋白质沉淀、聚焦 – 过滤
样品的溶解
• 2-DE成功分离蛋白质的最关键因素之一 • 溶解的目标
– 样品中非共价结合的蛋白质复合物和聚积体完全破坏，从而形成 各个多肽的溶解液（否则样品中结合牢固的蛋白复合物可能使2DE中出现新的蛋白点，相应的表示单个多肽的点的强度会下降） – 溶解方法必须允许可能干扰2-DE分离的盐、脂类、多糖和核酸等 物质的去除 – 溶解方法要保证样品在电泳过程中保持溶解状态
•起载体作用的两性电解质
– 到达平衡位臵形成pH梯度，“运载”电流、pH – 捕获样品中少量盐分 – 浓度应小于0.2％（w/v，浓度过高会使IEF的速度降低)
样品液的准备
标准液： 试剂 8M 尿素 50mM DTT 或2mM TBP 4% CHAPS 0.2%两性电解质载体 0.0002%溴酚蓝 ddH2O
• 胺基黑染色
– 转印至聚偏二氟乙烯（PVDF）上的蛋白质的染色 – 转印至硝酸纤维素膜上的蛋白质的染色
• 银染
– 可减少胶内蛋白质产量 – 对某些种类的蛋白质染色效果差 – 对其后的蛋白质测序和质谱分析造成影响
银染色
50% 甲醇 25% 乙酸 4h ddH2O 洗3次 30min/次 ddH2O 30 sec
样品溶液 样品溶液 体积 体积 (/5ml) (/5ml) 25l 250 l 12.5 l 125 l 12.5 l 125 l 25 l 250 l 12.5 l 125 l 25 l 250 l 12.5 l 125 l 25 l 250 l
样品制备流程及注意事项
预处理
(清洗等)
破碎
富集
按溶解度分级
溶解
除杂
样品的破碎
原则－最小限度的减少蛋白水解和其它形式 的蛋白降解
样品的来源
易碎的细胞 坚硬的组织 植物细胞 真菌
温和
方法
剧烈
温和破碎法
• 渗透压冲击(培养的细胞)
– 低渗液中的悬浮细胞
• 反复冻融法(细菌)
– 液氮冷冻
– 使蛋白质不易溶解且会影响其分子量及pI – 丙酮沉淀
• 多糖
– 阻塞胶体，影响蛋白质沉淀、聚焦 – TCA、硫酸铵或醋酸铵/甲苯/苯酚沉淀；超速离心和高pH
• 盐
– 使胶条导电能力增强，共聚焦不易发生 – 透析；胶体过滤；沉淀或重新悬浮
• 离子去污剂
– 如SDS，使蛋白质带负电不能聚焦 – 丙酮沉淀；将含SDS的蛋白溶于含两性或非离子去污剂如CHAPS，Triton X-100，NP-40等的缓冲液中并使SDS终浓度＜0.25%
主要包括印度墨水染料、胶体金属染料等 高灵敏度检出电转印至硝酸纤维素和PVDF膜上的蛋白质 灵敏度与PAGE胶内的银染类似 不用于胶内染色
• 胶体扩散染料
染色方法
• 有机荧光团染料
– 包括共价结合和非共价结合的荧光团染料两类，后者最为常用， 其典型代表是已经商品化的SYPRO Red、 Orange、 Ruby等荧 光染料 – 可对SDS-PAGE胶内蛋白质进行一步染色，约30~60min完成 – 灵敏度为2~10ng其线性范围为3个数量级 – 在Tris/甘氨酸转印缓冲液中染色后，蛋白质可被转印至膜上并进 行免疫染色或Edman测序来鉴定蛋白质
– 细胞在剪切力作用下破碎
• 研磨(固体组织，微生物)
– 液氮中将固体组织磨成细粉末
• 样品研磨器(用于少量样品的处理)
– 用于精确样品
• 珠磨法(胞悬液，微生物)
– 通过磨珠研磨破坏细胞壁
样品的沉淀
• 作用
– 去除杂质 – 浓缩样品 – 抑制蛋白酶活性
对于疏水性特别强的蛋白 如膜蛋白
– 硫脲 – SDS – 新型两性表面活性剂(如磺 基甜菜碱)
SDS 平衡液
50 mM 6M 30% 2% 微量 Tris-HCl 尿素 丙三醇 SDS 溴酚蓝
使被分离的 蛋白质与SDS 完整结合
SDS
IPG 胶条
标记纸片
向电泳缓冲液中加 0.5%的琼脂糖
SDS-PAGE
SDS-PAGE