蛋白质酪氨酸磷酸化_免疫沉淀及Western印迹两种方法的比较_陈沙力
蛋白质印迹法（免疫印迹试验，WesternBlot）
蛋⽩质印迹法（免疫印迹试验，WesternBlot）蛋⽩质印迹法（免疫印迹试验）即 Western Blot。
它是分⼦⽣物学、⽣物化学和免疫遗传学中常⽤的⼀种实验⽅法。
其基本原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或⽣物组织样品进⾏着⾊。
通过分析着⾊的位置和着⾊深度获得特定蛋⽩质在所分析的细胞或组织中表达情况的信息。
蛋⽩免疫印迹（Western Blot）是将电泳分离后的细胞或组织中蛋⽩质从凝胶转移到固相⽀持物NC膜或PVDF膜上，然后⽤特异性抗体检测某特定抗原的⼀种蛋⽩质检测技术，现已⼴泛应⽤于基因在蛋⽩⽔平的表达研究、抗体活性检测和疾病早期诊断等多个⽅⾯。
⼀提起Western blot，⼤家会不禁联想到Southern blot和Northern blot。
其实它们的名字也是个有趣的故事。
1975年，Edwin Southern教授发明了DNA杂交检测技术，故命名为Southern blot。
之后，James Alwine、David Kemp和George Stark三位教授⼜发明了RNA杂交检测技术，因与Southern blot相似，故命名为Northern。
George Stark这位⽜⼈教授在两年后⼜开发出类似的蛋⽩质检测⽅法。
1981年，Neal Burnette将其命名为Western blot。
为什么当时没叫Eastern blot呢？这⽆从考证，不过科学家们还真是挺有创意的。
30年来， Western blot技术已成为蛋⽩质研究中最常⽤的⼯具。
它的标准流程如下：蛋⽩质⾸先通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，再通过电泳转移到固相⽀持物上，固相⽀持物包括硝酸纤维素膜、PVDF膜和尼龙膜。
⾸先将膜上未反应的位点封闭起来，以抑制抗体的⾮特异性吸附，这样固定的蛋⽩质即可与特异性的多克隆或单克隆抗体相互作⽤。
最后通过放射、⽣⾊或化学发光的⽅法进⾏定位。
Western Blot原理与Northern Blot、Southern blot类似。
做磷酸化蛋白的westernblot如何事半功倍？
做磷酸化蛋白的westernblot如何事半功倍？本人的研究生实验被western blot承包了，尤其是做磷酸化蛋白上摸爬滚打了这么多年，所以总结下自己的经验，希望能助同道中人一臂之力，少走点弯路，早日出结果发paper, 迎娶白富美，走向人生巅峰那首先先思考几个问题，什么是蛋白质磷酸化？在哪些位点发生蛋白质的磷酸化呢？发生磷酸化有什么作用呢？下面我们来一一揭晓蛋白质磷酸化的神奇面纱：Q1: 什么是蛋白质磷酸化呢？蛋白质磷酸化是在蛋白质激酶催化下，把ATP的磷酸基转移到其他蛋白质氨基酸残基。
Q2: 什么是蛋白质的去磷酸化呢？上述磷酸化的蛋白在蛋白磷酸酶的作用下去磷酸化，这个过程是可逆的图所示Q3: 蛋白质磷酸化主要发生的氨基酸残基是谁呢？蛋白质磷酸化主要发生在两种氨基酸上，一种是丝氨酸(包括苏氨酸)，另一种是酪氨酸Q4: 蛋白质磷酸化的作用？蛋白质磷酸化是生物体内一种普通的调节方式，在细胞信号转导的过程中起重要作用。
好啦，知道蛋白质磷酸化是怎么一回事，那通过什么手段检测蛋白质是否磷酸化以及磷酸化水平呢？那常用到的方法就是western blot啦，有人会说western blot还不好做吗？那可是研究生的技能标配，但是磷酸化蛋白的western blot就不能小看了，多少人在这里摸爬滚打，绞尽脑汁。
好了下面重点来了，赶紧搬个小板凳认真学起来。
收蛋白样：1、收蛋白样一定冰上操作，动作要快，防止磷酸化蛋白的降解；2、蛋白裂解液配置：蛋白裂解液RAPI：蛋白酶抑制剂PMSF=100:1, 因为蛋白裂解液RAPI中含有NaF（抑制酸性磷酸酶），所以不加磷酸酶抑制剂也是可以跑出很漂亮的条带;3、如果自己配置的蛋白裂解液不含磷酸酶抑制剂，为了防止磷酸化蛋白的降解，可根据需要另行添加磷酸酶抑制剂（氟化钠NaF：抑制酸性磷酸酶，使用浓度10mM; 正钒酸钠Na3VO4：抑制碱性磷酸酶和酪氨酸磷酸酶，使用浓度1 mM；焦磷酸钠Na2P2O4：抑制丝氨酸-苏氨酸磷酸酶，使用浓度1 mM）；4、蛋白裂解后4℃离心后，最好立即加入loading buffer进行煮沸变性，也是防止磷酸酶降解磷酸蛋白。
蛋白质印迹分析-WesternBlotanalysis
实验四蛋白质印迹分析【实验目的】了解蛋白质印迹法的基本原理及其操作和应用。
【实验原理】蛋白质印迹法又称为免疫印迹法，这是一种可以检测固定在固相载体上蛋白质的免疫化学技术方法。
待测蛋白既可以是粗提物也可以经过一定的分离和纯化, 另外这项技术的应用需要利用待测蛋白的单克隆或多克隆抗体进行识别。
如图所示，可溶性抗原，也就是待测蛋白首先要根据其性质，如分子量，分子大小，电荷以及其等电点等采用不同的电泳方法进行分离；通过电流将凝胶中的蛋白质转移到聚偏二氟乙烯膜上；利用抗体(一抗) 与抗原发生特异性结合的原理，以抗体作为探针钓取目的蛋白。
值得注意的是在加入一抗前应首先加入非特异性蛋白，如牛血清白蛋白对膜进行“封阻” 而防止抗体与膜的非特异性结合。
经电泳分离后的蛋白往往需再利用电泳方法将蛋白质转移到固相载体上, 我们把这个过程称为电泳印迹。
常用的两种电转移方法分别为:1.半干法: 凝胶和固相载体被夹在用缓冲溶液浸湿的滤纸之间,通电时间为10 分钟~30 分钟。
2. 湿法：凝胶和固相载体夹心浸放在转移缓冲溶液中，转移时间可从45 分钟延长到过夜进行。
由于湿法的使用弹性更大并且没有明显浪费更多的时间和原料，因此我们在这里只描述湿法的基本操作过程。
对于目的蛋白的识别需要采用能够识别一抗的第二抗体。
该抗体往往是购买的成品，已经被结合或标记了特定的试剂，如辣根过氧化物酶。
这种标记是利用辣根过氧化物酶所催化的一个比色反应，该反应的产物有特定的颜色且固定在固相载体上，容易鉴别。
因此可通过对二抗的识别而识别一抗，进而判断出目标蛋白所在的位置。
其他的识别系统包括碱性磷酸酶系统和125I 标记系统。
【实验材料】1. 实验器材SDS/PAGE实验相关材料；电转移装置；供电设备；PVDF膜 ( Millipore Immobion-P #IPVH 000 10 ); Whatman 3MM纸；其他工具：镊子、海绵垫、剪子、手套、小塑料或玻璃容器、浅盘。
免疫组化技术与Westernblotting、ELISA的异同
免疫组化技术与Westernblotting、ELISA的异同
1）是应用免疫学基本原理——抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及相对定量的研究，称为免疫组织化学(immunohistochemistry)或免疫细胞化学技术(immunocytochemistry)。
2）Western blotting
蛋白质免疫印迹，也是利用抗体抗原反应原理，结合化学发光等技术来检查组织或细胞样品内蛋白含量的检测方法。
与免疫组化技术相比，定量可能更加准确;当然Western blotting也可定性和定位(通过提取膜蛋白或核蛋白、胞浆蛋白分别检测其中抗原含量，进而间接反映它们的定位)，但敏感性远远低于免疫组化技术。
3）ELISA
酶联免疫吸附试验，也是利用抗体-抗原-抗原结合反应原理来检查体液或组织匀浆中蛋白含量的检测。
与免疫组化技术相比，定量最准确，是分泌性蛋白检测首选方法之一。
免疫印迹怎么测定磷酸化的蛋白
免疫印迹怎么测定磷酸化的蛋白免疫印迹（Western blot，WB）是利用抗原抗体特异性结合的原理，基于SDS-PAGE凝胶电泳进行蛋白质分离、纯化以及相互作用研究的技术，也是评估蛋白磷酸化状态的最常用方法。
蛋白印迹技术先利用SDS-PAGE分离蛋白质样品，随后将电泳条带转移到固相载体膜上（如PVDF或尼龙膜），再利用磷酸化特异的抗体（一抗）来鉴定目的蛋白，能与磷酸化特异抗体结合的蛋白质即为磷酸化蛋白，最后通过标记的二抗识别一抗可以指示一抗的位置，即是待研究的磷酸化蛋白质的位置。
免疫印迹法不适用放射性32P标记，避免了使用放射性同位素时的危险品和废物处理。
此外，磷酸化抗体的灵敏性较强，可以轻松的检测常规细胞提取物中的磷酸化蛋白，对样品的用量要求不算严格。
WB除了能定性检测磷酸化蛋白外，还能一定程度上评估磷酸化蛋白质的水平，由于受到不同实验处理和凝集上样误差的影响，通常先用一个抗体来检测同源蛋白的总水平(而不考虑磷酸化状态)，以确定磷酸化组分相对于总组分的比例，并充当上样内对照。
百泰派克生物科技拥有纯熟的免疫印迹技术，专业的技术分析团队，为您提供一站式磷酸化蛋白免疫印迹鉴定服务，可以根据您的需求定制实验，并对可能影响结果的潜在因素进行评估。
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相关服务：Far-Western Blot分析。
翻译后修饰蛋白组分析。
磷酸化定量蛋白组学研究。
免疫共沉淀法（CO-IP）结合质谱联用的蛋白互作分析。
蛋白质相互作用分析。
蛋白质相互作用质谱分析。
SILAC与免疫共沉淀质谱联用的蛋白互作分析。
交联法蛋白相互作用分析。
标记转移法蛋白相互作用分析。
Pull-down靶蛋白质谱鉴定。
蛋白磷酸化实验方法
蛋白磷酸化实验方法蛋白磷酸化实验方法主要包括以下几种：1. Western blot：这是评估蛋白磷酸化状态的最常用方法，利用SDS-PAGE分离生物样品，随后转移到膜上(通常是PVDF或尼龙膜)，之后利用磷酸化特异的抗体来鉴定目的蛋白。
2. 放射性标记法：先用32P标记ATP，通过细胞代谢标记到磷酸化蛋白质上，再经一维或二维凝胶电泳或色谱法进行分离，最后通过放射自显影进行检测。
3. 免疫印迹法：基于抗体特异性结合抗原的原理，利用抗磷酸化氨基酸抗体与电泳分离得到的磷酸化蛋白质进行免疫印迹反应来检测磷酸化蛋白质。
在实验中，通常将免疫印迹与免疫沉淀结合使用，因为磷酸化蛋白质的含量较低，先利用免疫沉淀法对磷酸化蛋白质进行富集，可以降低非磷酸化蛋白质的干扰。
4. 荧光染色法：利用荧光染料直接对凝胶中结合在酪氨酸、丝氨酸或苏氨酸残基上的磷酸进行选择性染色，再通过荧光扫描仪检测就能直接鉴别出磷酸化的蛋白质。
5. 质谱法：首先将含磷酸化修饰的蛋白样品进行酶切，然后对酸化肽段进行富集，再将富集得到的磷酸化肽段进行串联质谱分析，最后利用质谱数据结合生物信息学分析对磷酸化蛋白质进行鉴定。
6. ELISA：ELISA已逐渐成为测定蛋白磷酸化的一种有力方法。
这种微孔板形式的分析一般利用目的蛋白特异的捕获抗体，与磷酸化状态无关。
随后让目的蛋白结合在抗体包被的分析板中，目的蛋白可以是纯的，也可以是复杂的异质样品(如细胞裂解液)中的一个组分。
加入待分析的磷酸化位点特异的检测抗体。
这些分析通常设计为显色或荧光检测。
产生的信号强度与最初样品中存在的磷酸化蛋白的浓度成正比。
与更为传统的免疫印迹相比，磷酸化特异的ELISA技术具有一些优点。
首先，利用经过校准的标准品，可轻松定量结果。
其次，以三明治形式使用目的蛋白特异的两个抗体，带来了高的特异性。
第三，ELISA的灵敏度更高允许使用更少量样品，检测低丰度的蛋白。
最后，微孔板形式的通量比传统的Western blotting要高得多。
western 每步实验方法对比
Western实验原理免疫印迹（Western Blotting）的基本原理及应用免疫印迹是一个用于蛋白质分析的常规技术，在电场的作用下将电泳分离的蛋白从凝胶转移至一种固相支持物，然后利用抗原-抗体的特异性反应，从蛋白混合物中检测出目标蛋白，从而定量或定性的确定正常或实验条件下细胞或组织中目标蛋白的表达情况。
Western blotting还可用于蛋白-蛋白、蛋白-DNA和蛋白-RNA相互作用的后续分析，作为一种廉价、便捷、可靠的研究工具，将与质谱和蛋白质芯片等技术一起在蛋白质组时代发挥重要作用。
Western Blotting的protocol种类繁多，但大同小异，基本为上述几个步骤。
要得到一个完美的实验结果，不仅需要优质的抗体，同时应对整个实验流程和体系进行严格的质量控制，才能最终达到你的实验目的。
影响免疫印迹成败的一个主要因素是抗原分子中可被抗体识别的表位性质。
因为涉及到抗原样品的变性，只有那些识别耐变性表位的抗体可以与抗原结合。
多数多克隆抗体中或多或少含有这种类型的抗体，所以在免疫印迹中常选用多克隆抗体。
第二个影响因素是蛋白原液中抗原的浓度。
一些表达量低的蛋白在免疫印迹前常需要通过免疫沉淀，亚细胞分离等手段富集。
Western实验步骤基本实验步骤一、样品制备对于Western Blotting实验而言，样品处理是关键步骤之一，获得的蛋白样品必须均质、可溶，并解离成单个多肽亚基，且尽量减少相互间的聚集，使其最终仅依赖本身的分子量大小进行分离。
当目标蛋白的含量很低时，需要选取目标蛋白含量较高的组织或细胞器（如核抽提物），或者通过免疫沉淀等方式进行富集。
通常样品有重组蛋白、细胞和组织等。
1.样品收集1）培养的细胞贴壁和悬浮细胞收集方式不同，细胞裂解液种类各异，推荐含SDS的凝胶加样缓冲液裂解，煮沸即可。
2）动物组织与细胞不同，组织块由于体积较大，须预先经破碎匀浆处理。
2．样品定量样品电泳前需测定蛋白浓度，以便保证上样量一致，有利于后续定量或半定量分析。
药物分析中的蛋白质磷酸化分析技术研究
药物分析中的蛋白质磷酸化分析技术研究1. 引言蛋白质磷酸化是一种重要的细胞信号传导方式，参与调控细胞的生理和病理过程。
药物研究中，了解蛋白质是否被磷酸化，以及磷酸化的程度，对于理解药物靶点、药效机制以及发现新的治疗靶点具有重要意义。
本文将介绍药物分析中的蛋白质磷酸化分析技术的研究进展及应用。
2. 蛋白质磷酸化的分析方法2.1 免疫印迹法免疫印迹法是最早用于检测蛋白质磷酸化的方法之一。
该方法利用特异性的抗体与目标蛋白质结合，再通过酶标记的二抗进行信号放大，最终通过底物的发光或显色反应来检测蛋白质磷酸化水平。
免疫印迹法具有灵敏度高、操作简便等优点，且可同时检测多个靶点。
2.2 质谱法质谱法是一种高分辨率的蛋白质分析技术，也被广泛应用于蛋白质磷酸化的研究。
代表性的方法有质谱光谱法和质谱成像法。
质谱光谱法通过质谱仪器分析磷酸化产生的质谱图谱，从而鉴定和定量蛋白质磷酸化水平。
质谱成像法则可以将荧光探针和质谱技术结合，实现对蛋白质磷酸化的直观可视化。
2.3 磷酸化位点特异性酶切法磷酸化位点特异性酶切法利用特定的蛋白酶识别和切割蛋白质的磷酸化位点，从而将磷酸化和非磷酸化的蛋白质区分开来。
通过质谱法或免疫印迹法等技术进一步分析切割后蛋白质的磷酸化水平，用于研究磷酸化的生物学功能和相应靶向药物的发现。
3. 蛋白质磷酸化的应用3.1 药物靶点鉴定蛋白质磷酸化分析可用于帮助药物研究人员鉴定药物的作用靶点。
通过分析药物处理后的蛋白质磷酸化模式，可以确定药物是否与特定的蛋白质发生相互作用，并进一步研究该蛋白质在疾病发生发展中的作用机制。
3.2 药效机制研究药物的疗效与其作用靶点及所调控的信号通路密切相关。
蛋白质磷酸化分析可以帮助研究人员深入了解药物对靶点蛋白质的调控机制，揭示药物与细胞信号传导之间的相互作用关系，从而为药效机制的研究提供重要的信息。
3.3 新药物靶点发现通过对疾病相关信号通路上关键蛋白质的磷酸化分析，可以发现新的治疗靶点。
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蛋白质酪氨酸磷酸化-免疫沉淀及Wes tern印迹两种方法的比较*预防医学院放射生物实验室 陈沙力 刘树铮提 要 为了深入了解在细胞信息传递中蛋白质酪氨酸磷酸化研究的较佳方法,采用免疫沉淀法及Western 印迹法对电离辐射诱导的小鼠胸腺细胞蛋白质磷酸化进行了比较分析。
免疫沉淀结果表明,照射后17500、22000、28000、32000、40000、43000及53000蛋白分子发生酪氨酸磷酸化。
Western 印迹结果表明,照射后28000、32000蛋白分子发生酪氨酸磷酸化。
提示在蛋白质酪氨酸磷酸化的研究中,免疫沉淀法优于Western 印迹法。
关键词 蛋白质 磷酸化 免疫沉淀 免疫印迹中图号 R331 蛋白质酪氨酸磷酸化是多种刺激因素诱导激活基因表达的细胞信息传递通路中的基础步骤,也是电离辐射激活淋巴细胞PKC 信息传递通路及转录因子N F -kB 最基本的步骤〔1〕。
预先的研究表明,低剂量电离辐射可诱导小鼠胸腺细胞数种蛋白分子发生变化〔2〕,其中包括辐射刺激引起蛋白分子的甲基化、糖基化及磷酸化等化学修饰变化。
研究蛋白质磷酸化在细胞信息传递中的作用具有重要的意义。
本研究采用免疫沉淀及Western 印迹两种方法对辐射诱导的小鼠胸腺细胞蛋白分子磷酸化进行了比较研究,现将结果报告如下。
1 材料和方法1.1 动物及照射条件健康雄性昆明小鼠,体重18～22g 。
采用Philips 深部X 射线机照射动物,电压200kV ,电流10m A,滤板0.5mm Cu,1.0mm Al,靶皮距离212cm 。
单次全身照射,剂量率为12.5m Gy /min ,剂量为75m Gy 。
1.2 小鼠胸腺细胞分离及金黄色葡萄球菌Cow an I 株(SAC )的活化、纯化、鉴定、增殖、回收及处理 * 国家自然科学基金资助课题(39270207)参见文献〔3,4〕。
1.3 免疫沉淀 1.3.1 H 332PO 4代谢标记胸腺细胞及细胞裂解 用无磷酸盐RPM I 1640培养液(Sig-ma )调细胞浓度至107个/ml ,加入H 332PO 4(中科院原子能研究院)4.625×109Bq /ml,37℃平缓摇动培养3h ,冷生理盐水洗涤2次并溶解于细胞裂解液(50mmol /L Tris,p H 7.5,150mm ol /L Na Cl ,1%N P -40,0.1mol /L NaF ,10mm ol /L Na 3VO 4,5mm ol /L EDT A,1mmol /L PM SF ,2U Aprotinin )中,冰浴30min ,间或振荡,反复通过22号针头,15000r /min 离心20min ,上清移至另一离心管中。
1.3.2 细胞裂解物的预清除 将S AC 置离心管中,7000r /min 离心15min,将沉淀悬于含0.05%N P -40的细胞裂解液中至原体积,加等体积的无关杂交瘤细胞培养上清,冰浴30min ,用细胞裂解液洗涤3次,再以1/2原体积裂解液悬浮,终浓度为20%。
将等体积S AC 加到裂解上清中,冰浴2h,4℃12000r /min 离心15min ,小心取出上清保存备用。
1.3.3 抗原抗体复合物的形成 将细胞裂解上清(抗原)分为两等份,置于微量离心管中(3×106细胞),各加入N ET-明胶缓冲液(50—678—第23卷 第6期1997年 白 求 恩 医 科 大 学 学 报J .N.BET HU N E U N IV.M ED.SCI. V ol.23 N o.61997m mol/L Tris,p H7.5,150mmo l/L NaCl, 0.05%N P-40,1m mol/L EDTA,0.25%明胶, 0.02%NaN3)至总体积为0.5ml,在一管中加入磷酸化酪氨酸单克隆抗体(Clone2G8.D6杂交瘤细胞培养上清)100μl,在另一管中加入非相关杂交瘤细胞培养上清100μl作为对照, 0℃平缓摇动1h。
1.3.4 靶蛋白的免疫沉淀 加SAC到抗原-抗体复合物中(200μl10%SAC),4℃平缓摇动1h,3000r/min离心6min,弃上清,加入1m l洗涤液(NE T-明胶缓冲液,100mm ol/L Na F,2mmo l/L Na3V O4),振荡悬浮,重复洗涤3次,吸干残液。
加SDS-PAGE上样液30～60μl,振荡悬浮,100℃水浴3min,15000r/min 离心10min,仔细收集上清。
1.3.5 SDS-PAGE〔3〕 10%分离胶, 4.5%浓缩胶,胶厚1mm,胶长12.5cm。
上样蛋白浓度为150～250μg,150V电泳6～8h。
1.3.6 干胶及放射自显影 电泳后,置胶于滤纸上,用保鲜膜覆盖后真空干燥凝胶,压X 光片3～5d。
1.4 W estern印迹 1.4.1 细胞裂解及蛋白质提取 将5×106细胞溶解于0.5m l裂解液(20mm ol/L Tris,p H8.0,137mm ol/L Na Cl,1%N P-40, 10%Glycerol,1mmo l/L PM SF,0.15U Apro tinin/m l,1m mol/L Na3VO4)中,4℃30 min,间或振荡,反复通过22号针头以剪切DN A,15000r/min离心20min,上清加等倍2×SDS-PAGE上样液,沸水浴3min。
1.4.2 SDS-PAGE 8%分离胶,4.5%浓缩胶,胶厚1m m,胶长12.5cm。
上样蛋白为150～250μg,150V电泳6～8h。
1.4.3 转膜 切4张Whatman3号滤纸,1张硝酸纤维膜,用水漂浮浸膜后,浸入水中5min,将膜及滤纸浸入转膜缓冲液(25 m mol/L Tris,192mmol/L Glycine,20% Methanal)5min。
阳极侧依次为滤纸、膜、胶、滤纸,用移液管作滚筒排出气泡。
采用电转印装置60V,4℃转印4～6h或40V,4℃转印过夜。
用丽春红S染液(丽春红S2g,三氯乙酸30g,磺基水杨酸30g,用水定容至100m l,用前1∶10稀释)染膜5～10min,间或轻摇染液。
蛋白带出现后,用水洗膜数次,标记M arker位置。
1.4.4 抗体与靶蛋白结合 硝纤膜置封闭液(3%无脂奶粉,50mmo l/L Tris,p H7.5, 150m mol/L NaCl)中室温孵育2h。
在封闭液中加入磷酸化酪氨酸单克隆抗体(Clone 2G8.D6杂交瘤细胞培养上清)室温2h,以Tris缓冲液(50m mol/L Tris,pH7.5,150 mm ol/L NaCl)洗膜4次,每次10min。
置硝纤膜于新鲜封闭液中,加入碱性磷酸酶标记的羊抗鼠Ig G(Sig ma),室温2h,洗膜4次。
1.4.5 显色 置硝纤膜于显色缓冲液(100mm ol/L Tris,p H9.5,100mmol/L Na Cl, 5mm ol/L Mg Cl2,165m g BCIP/L,330mg NB T/L)中,待区带显示清楚时,用水洗膜终止反应。
2 结果与讨论 采用免疫沉淀技术观察电离辐射对胸腺细胞蛋白质磷酸化影响的结果表明,照射后部分蛋白质明显发生酪氨酸磷酸化,其分子量范围为17000、22000、28000、32000、40000、43000及53000。
Western印迹结果表明,照射后28000及32000蛋白分子发生酪氨酸磷酸化。
结果揭示在蛋白质酪氨酸磷酸化的研究中,免疫沉淀法优于Western印迹法。
用于检测复杂蛋白质混合物中靶抗原及其含量的方法包括免疫沉淀法、W estern印迹法及固相放射免疫测定法。
免疫沉淀法可应用于复杂蛋白质混合物中靶抗原的定性与定量,整个实验过程是在液相中进行,其独特优点是高选择性、特异性及敏感性,可检出低至100pg的放射性标记蛋白。
该法与SDS-PAGE结合应用是研究原核细胞、真核细胞或体外翻译系统所表达外源抗原蛋白的合成与加工过程的理想技术。
—679—陈沙力等 蛋白质酪氨酸磷酸化-免疫沉淀及W ester n印迹两种方法的比较Western印迹法是对非放射性标记复杂蛋白混合中的某些特定靶蛋白进行定性鉴别及定量分析的方法,实验过程是在固相支持膜上进行,可检出1～5ng中等大小的待检蛋白而又无需像免疫沉淀法那样必须对靶蛋白进行放射性标记。
由于蛋白质的电泳分离几乎总是在变性条件下进行,因此,免疫沉淀法中的溶解、聚集以及靶蛋白与外来蛋白的共沉淀等诸多问题能够得到解决。
由于在这一实验中靶蛋白是彻底变性的,故并非所有单克隆抗体都适合用于W estern印迹,而多克隆抗血清是由单一免疫球蛋白组成的不确定混合物,通常对其特异性、亲和力以及浓度都一无所知,因而很难预测用特定多克隆抗血清来测定某一固定化变性靶蛋白上的不同抗原表位的效果。
但Western印迹法在实际应用中遇到的大多数问题都可通过设置适当的对照加以解决。
免疫沉淀法通常是从已被放射性标记的细胞提取物中通过免疫反应沉淀靶蛋白,但还可被用于非标记蛋白的分析,当靶蛋白与抗体解离后,则可使用诸如酶活性检测、放射性配体的结合及W estern印迹分析等方法检出特定的非标记蛋白。
本文所述两种方法结合应用将能修正各自存在的问题。
参 考 文 献1 陈沙力,刘树铮.国外医学放射医学核医学分册, 1996,20:782 陈沙力,孟庆勇,刘树铮.中华放射医学与防护杂志, 1996,16:1613 陈沙力,孟庆勇,刘树铮.白求恩医科大学学报, 1996,22:3164 Kessler S.J Imm unol,1975,115:1617(1996—07—23收稿)Tyrosine phosphorylation of proteins in murine thymocytes-a comparison between immunoprecipitationand Western blottingChen Shali,Liu Shuz heng(MPH Radiobiology Research Unit,NB Univ.of Med ical sciences)Abstract A com pariso n betw een the two m ethods w as perfo rm ed fo r ty ro sine phospho ry la-tion of pro teins in m urine thymo cy tes ex po sed to low dose radia tion using anti-pho spho ty rosine Mc Ab.It was show n tha t tyro sine pho spho rylation o f17.5kD,22kD,28kD,32kD,40kD,43k D and53kD protein mo lecules labelled metabolically with H332PO4appeared in the thymocy tes after radiatio n by immunoprecipita tio n technique and ty rosine pho spho rylation of28kD,32kD pro tein m olecules a ppeared by w estern blo tting.The results sug gest that immunoprecipitatio n is superio r to Western blotting in detectio n of protein ty rosine phospho rylatio n.Key words Thymocy te Pro tein ty ro sine pho spho ryla tion Im muno precipitation W estern blot-ting—680—白求恩医科大学学报 1997年 第23卷 第6期。