血清抗体效价的测定
间接ELISA检测抗血清效价
间接ELISA检测抗血清效价间接ELISA检测抗血清效价姓名：王贤臣学号：1125400080（成都医学院医学检验成都610500）【摘要】目的：通过实验掌握间接酶联免疫吸附测定技术（ELISA）的原理及操作过程及间接ELISA检测抗血清效价的实验条件优化及效价的确定。
方法：间接ELISA双抗体夹心法对包被抗原及酶标抗体工作浓度进行探索。
结果：经过预实验初步确定抗人白蛋白血清包被浓度和一二抗的浓度，然后在正式实验确定其浓度，从而再进行研究。
讨论：间接ELISA检测抗血清效价的影响因素。
并将预实验方法的结果与确定实验的结果进行对比，和分析在实验过程中的注意事项。
【关键词】抗人白蛋白ABL ELISA前言：1971年Engvall和Perlmann 发表了酶联免疫吸附测定用于IgG 定量测定的文章，使得1966年开始用于抗原定位的酶标抗体技术发展为体液标本中微量物质的测定方法。
之一方法的基本原理是：①使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持器免疫活性。
②使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原后抗体即保留其免疫活性，又保留酶的活性。
在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。
用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。
加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅定性或定量分析。
由于酶的催化频率很高，故可极大的放大反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感度。
实验方法：预实验设计方案：1、材料与方法1.1仪器：洗板机（BIO-RAD MODEL 1575 ）SM自动化酶免疫分析仪（北京天石医疗用品制作所 BIO-RAD 680）电热恒温箱（上海恒科技仪器有限公司）移液枪（上海求精生化试剂仪器有限公司）微孔反应板刻度吸管（5ml、1ml）吸耳球试管架塑料试管封口纸烧杯1.2试剂：人ALB标准品（SIGMA :A1653 SIZE:250MG storage:2-8℃）PBS缓冲液：0.1M pH7.4(PBS 1L配方pH7.4：磷酸二氢钾(KH2PO4)0.2g，十二水水磷酸氢二钠(Na2HPO4.12H2O)3.58g，氯化钠(NaCl)8.0g，氯化钾(KCl)0.2g，加水至1000mL)包被液：0.05M pH9.6碳酸盐缓冲液洗涤液：0.05%Tween-PBS(即PBST) (0.05%Tween-PBS 1000mlPBS加500ul吐温）封闭液：1%干酪素-PBST（1%酪蛋白溶液 100mlPBS加1g干酪素）显色液（A液、B液Cat:ME002 可溶性TMB显色液)终止液：2M H2SO4酶标抗体（兔抗羊--HRP，武汉博士德生物工程有限公司）1.3待测标本：羊抗人ALB（效价1:70 批号：201106 贮存于4-20℃，有效期：2年）1.4方法：①预实验包被抗原(100ul/孔)↓4℃过夜或37℃2h 洗涤3次拍干加封闭液(300ul/孔)↓4℃过夜或37℃2h 洗涤3次拍干加入标本(100ul/孔)↓37℃1h 洗涤5次拍干加入酶标抗体(100ul/孔) 拍干↓37℃1h 洗涤5次加入显色剂A、B液各50ul/孔↓37℃15-20min加入终止液(100ul/孔)↓检测表1：包被抗体和酶标记抗体棋盘滴定羊抗人ALB血清羊抗人ALB血清兔抗羊IgG-HR P 1:11:41:161:641:2560PBS兔抗羊IgG-HRP1:11：41：161：641：2560PBS1:50 0 1:50 01:201:20人人00 001:80 00 1:80 001:16 0001:16000羊抗人ALB血清羊抗人ALB血清兔抗羊IgG-HR P 1:11:41:161:641:2560PBS兔抗羊IgG-HRP1:11：41：161：641：2560PBS1:50 0 1:50 01:20 00 1:20 001:80 00 1:80 001：1600 01:16000人人（1）将人ALB用包被液稀释为：0.01ug/ml 0.1ug/ml 1ug/ml 10ug/ml（2）酶标结合物（兔抗羊IgG-HRP）稀释为：1:500 1:2000 1:8000 1:16000（3）抗人白蛋白血清（羊抗人ALB血清）稀释为：1:10 1:40 1:160 1:640 1:2560在初步结果的基础上继续细化工作浓度，重新检测以确定最终最适包被抗原和酶标抗体的最终工作浓度，即建立间接ELISA法检测抗人白蛋白血效价。
母体IgG抗体效价检测卡操作规程
孕妇血清IgG抗体效价检测操作规程[样本要求]：血样标本最好采用EDTA抗凝（也可以用枸橼酸钠等抗凝），用血清代替血浆进行检测时，用前离心，2000g×10min，防止纤维蛋白干扰反应结果。
[样品准备]：试剂配制：用985ulPH7.4的PBS(或者生理盐水)溶解15ul二巯基乙醇（2-Me）,即为0.2M(2-Me)应用液,密封，避光，置2---6℃保存.红细胞标本的制备：用生理盐水配置红细胞悬液，红细胞最终浓度为1%左右.血清标本的制备：将被检者静脉血采入含兔脑粉或其它促凝剂的试管中,10分钟后离心取上清;或者将被检者静脉血采入无抗凝剂试管中,4℃放置12小时,或37℃放置2小时后离心,2000Rpm,10分钟,取上清.该上清不得有絮状物或沉淀；[配套试剂]：孕妇IgG抗体效价卡，标准A、B、O红细胞（取决于父亲血型），0.2M(2-Me)应用液[实验步骤]1、试剂卡室温平衡，离心一次，标记编号；2、配制中和血浆：先取待检者血浆200微升与生理盐水600微升做4倍稀释，然后取稀释后的标本和0.2M巯基乙醇(2-Me)应用液各200ul，混匀，37℃孵育30---60分钟，（充分破坏标本中IgM类抗体）既得到孕妇的中和血浆。
34、在所有孔中加入50ul健康人O型1%红细胞悬液(测定孕妇ABO血型系统以外IgG血型抗体)或所有孔中加入50ul健康人A型或B型1%红细胞悬液(测定孕妇ABO血型系统IgG血型抗体)，然后加入上述表格中稀释的中和血浆各50ul5、把加有血浆和红细胞的微柱卡置37 ℃专用孵育器孵育15分钟；6、用专用离心机离心5分钟（900r/min2分钟1500r/min3分钟）。
判定结果。
[结果判定]效价值：产生3+凝集的最高稀释度，其倒数即为效价。
[参考值]1、RH系统抗体效价16有临床意义2、ABO系统抗体效价64有临床意义[注意事项]1.据文献报道微柱凝胶法检测出的母体效价值比常规聚凝胺和抗人球蛋白试管法高出1-2个滴度（根据P.L.Mollison所著教材《临床医学中的输血（Blood Transfusion in Clinical Medicine）》）2. 红细胞标本一定不能被细菌污染，否则出现假阳性反应。
抗体效价——精选推荐
通常所说的抗体效价应该是否是与抗体含量相关？说某种抗体的效价高是什么意思？大家通常纯化单抗腹水能得到多大量抗体？问得好啊,考大家基础知识呢.我做了很久了,但你一问我还真有点一愣.回忆一下抗体效价好象是指一个抗原与最适稀释度的抗体进行正常抗原抗体反映的比例。
用通俗的方法来说，这种抗体能与特定抗原结合的量为多少。
中和多少抗原的能力吧例如血清滴度1:128为阳性，表示将抗体稀释到128倍后仍能与抗原结合，出现阳性结果. 在免疫学实验中，效价或滴度的稀释倍数是按实验要求对倍稀释的，一般为2n，例如1:4；1:8；1:16；1:64；1:256；1:512等首先,抗体的效价一般是指抗体的滴度，当然会与抗体含量相关了。
通常ELISA里面,只要OD值是P/N>2的都判为阳性。
但是，现在我们做ELISA分析里，也将指抗原与抗体的最佳结合浓度简称为效价了，这是一种通俗的称谓，也可以称作狭义的“效价“。
一般在ELISA 里，OD值在1.0左右的适合做分析用.说某种抗体效价高,指的是其中含有的针对某个抗原的特异性抗体的浓度高.通常纯化单抗腹水,得到抗体的量是根据所用纯化方法决定的,有的方法提纯得到的抗体浓度高些,有的损失大一些.具体的你可以在园子里搜索一下.请问那位朋友能给予帮助？我做了抗体后，如何测定其效价？现在还有原来的抗原，抗体的效价与抗原的浓度有关么？常用有两种方法测定抗体效价：1，ELISA法：ELISA测效价步骤：按照一定浓度包被抗原，前两个分别设为空白和阴性，从第三个孔开始从倍比稀释，抗血清的起始浓度建议为1：1000。
加入适当浓度的二抗，显色。
读数，选取P/N大于2.1的抗血清稀释度即为该血清的效价，这是一般的参照经验公式2，免疫双扩散法：大概方法为：在玻璃板上铺琼脂糖，打孔，梅花状，中间一孔点抗原，四周几孔点被比稀释的抗体，37℃湿盒孵育24h，有沉淀线出现的抗体稀释度即为抗体的效价。
具体方法和步骤可以在网上搜一下，很常规的办法，2000年以前的文献测抗体效价一般都用该方法，可能是那时候ELISA使用还不是很普遍。
效价的测定
二、免疫血清（浆）的效价测定—溶血法实验原理该方法的基本原理是根据补体的经典激活途径，即当抗原抗体复合物存在时，补体系统被激活，最后形成的攻复合体可使细胞性抗原溶解。
当实验中抗原和补体的量固定不变，且对于抗体相对过量时，则随着抗体量的不同，被溶解的细胞性抗原的量也不同，两者成正比关系，因此根据溶解的抗原的多少就可以判断出抗体的量。
实验材料1. 待测免疫血清（浆）2. 20%SRBC3. 补体4. 生理盐水5. 试管实验方法1. 将前面获得的小鼠抗 SRBC 免疫血浆首先稀释 10 倍，成为 1:10 免疫血浆。
2. 取3个试管,分别编号为A、B、C,用于对1:10免疫血浆的3倍、4倍和5倍稀释，即A号管内为1:30的免疫血浆;B号管为1:40 的免疫血浆；C号管为1:50的免疫血浆。
3. 取 15 支试管，分为A、B、C三列，每列5只，先给每管中加入生理盐水0.5ml,再从A、B、C号管中分别吸取0.5ml血浆加入相应各列的第一个管中,然后各列再进行倍比稀释,血清稀释度如下表：管号 1 2 3 4 5A 列1:60 1:120 1:240 1:480 1:960B 列1:80 1:160 1:320 1:640 1:1280C 列1:100 1:200 1:400 1:800 1:1600注意每列的最后一管应该弃去0.5ml液体。
4. 向每个试管中分别加入SRBC0.25ml和补体0.25ml 。
5. 混均各管中的液体,置37°C水浴30~40分钟。
结果判定以发生完全溶血的最高血清稀释度管为效价判定管，其血清稀释度即为免疫血清的效价。
注意事项1. 动物免疫时注意确保SRBC被注射到了腹腔中,要避免注入其他脏器（如肠、膀胱）内。
2. 稀释血清时尽量做到精确，注意用于不同列的吸管不要混用。
思考题1. 影响免疫血清质量的因素有那些？2. 各种检测抗体效价的方法相比有什么优缺点？返回。
血型抗体效价测定标准操作规程(sop)
血型抗体效价测定标准操作规程一、目的为规范红细胞血型抗体效价测定的技术操作，保证结果的准确性从而为临床疾病的诊断和治疗做出正确的评估。
二、适用范围输血科负责红细胞血型抗体效价测定的技术人员。
三、原理：将受检血清（如检测IgG类红细胞血型抗体效价须先用巯基试剂裂解其中的IgM型抗体）经连续倍比稀释后与表达目标抗体对应的抗原红细胞试剂反应，以受检血清凝集试剂红细胞的最高稀释倍数的倒数作为受检血清中检测目标抗体的效价，同时根据“红细胞凝集强度与评分标准”评分。
四、步骤和方法（1）盐水介质法测定IgM类红细胞血型抗体效价1、排试管12支，编号，以第1支试管为原倍进行生理盐水倍比稀释受检血清，第12支试管为2048倍，稀释后容积定为100微升。
2、分别往12支试管加入3%目标抗体对应的抗原红细胞试剂50微升，轻摇混匀。
3、用专用离心机120g离心1min，观察有无溶血和凝集情况。
4、结果判断：镜检呈“1+”凝集的最高稀释倍数的倒数为目标抗体的效价，再根据“红细胞凝集强度与评分标准”评分。
（2）IgG类红细胞血型抗体效价测定1、取200微升受检血清加入0.2mol/L二巯基乙醇（2—Me）应用液200微升混匀，将试管口密封，37℃孵育30min。
2、排11支试管，编号，进行生理盐水倍比稀释2—Me处理过的血清。
由于第1支已经进行了稀释，所以第11支试管为2048倍，稀释后容积定为100微升。
3、凝聚胺法检测时，往11支试管加入3%目标抗体对应的抗原红细胞试剂50微升，轻摇混匀，按照凝聚胺法操作步骤进行试验。
4、抗球蛋白法测定时，往11支试管加入3%目标抗体对应的抗原红细胞试剂50微升，轻摇混匀后置37℃孵育30min后，按照抗球蛋白法操作步骤进行试验。
5、结果判断：镜检呈“1+”凝集的最高稀释倍数的倒数为目标抗体的效价，再根据“红细胞凝集强度与评分标准”评分。
（1）评分标准根据稀释血清各管凝集强度进行评分，凝集强度与评分标准为：4+为12分，3+为10分，2+为8分，1+为5分，+/-或W+为2分，阴性为0分，稀释各管评分之和为积分。
综合性实验三、抗“O”和抗“H”血清的制备及效价测定
西安医学院教案（专业课程）课程名称临床免疫学与检验班级检本1008 专业，层次检验，本科教师武永红专业技术职务讲师授课方式（大，小班，实习）实验学时9学时授课题目（章，节）抗“O”和抗“H”血清的制备及效价测定基本教材或主要参考书王兰兰，许化溪主编.临床免疫学检验.第5版：人民卫生出版社，2012 刘辉．临床免疫学与检验实验指导第3版：人民卫生出版社，2009 曹励民．免疫学检验实验指导．自编教材，2011教学目的：1.掌握：细菌接种培养的操作能力，加强细菌性抗原免疫动物的实验操作能力，肥达氏反应的模拟操作及间接血凝实验测定细菌性抗体的效价，2.熟悉：临床用于诊断细菌或病毒感染的凝集反应测定效价试验的原理。
教学内容：1.细菌培养与免疫原的制备2.“O”和抗“H”血清的制备3.试管凝集试验测抗“O”和“H”血清效价4.间接血凝试验测抗“O”和“H”血清效价教学方法：启发式教学；讲授重点内容。
教具：板书示教教学重点、难点：1. 间接血凝试验测抗“O”和“H”血清效价教研室审阅意见（教研室主任签名）年月日教学内容教学手段时间分配抗“O”和抗“H”血清的制备及效价测定（一）细菌培养与免疫原的制备（二）“O”和抗“H”血清的制备（三）试管凝集试验测抗“O”和“H”血清效价（四）间接血凝试验测抗“O”和“H”血清效价（一）细菌培养与免疫原的制备伤寒沙门菌标准菌株干粉→生理盐水溶解→接种肉汤培养基→接种普通平板→生理盐水菌液（100℃水浴制备O抗原，甲醛处理制备H抗原）（二）“O”和抗“H”血清的制备Ag伤寒沙门菌O和H抗原→分别免疫两组家兔→抗O血清和抗H血清O/H抗原的免疫程序：日序（天）免疫剂量（ml）免疫途径1 1 皮内五点注射8 1.5 耳静脉注射15 1.5 耳静脉注射22 1.5 耳静脉注射放血方法：颈动脉采血试血方法：试管凝集试验（三）试管凝集试验测抗“O”和“H”血清效价试管凝集试验的原理：在试管内，用已知颗粒性抗原作为诊断试剂，与一系列倍比稀释的待检血清混合反应，在一定条件下，出现肉眼可见的凝集现象。
微注法血型抗体效价测定
微注法血型抗体效价测定（原创版）目录一、微注法血型抗体效价测定简介二、微注法的原理三、微注法的操作步骤四、微注法的优点与局限性五、微注法在血型抗体效价测定中的应用正文一、微注法血型抗体效价测定简介微注法血型抗体效价测定是一种常用的血型学检测方法，主要用于测定人类血液中各种血型抗体的效价。
这种方法具有操作简便、结果准确等优点，广泛应用于临床输血、血型鉴定以及血液学研究等领域。
二、微注法的原理微注法血型抗体效价测定的原理是根据抗原与抗体的特异性结合反应，通过观察红细胞凝集程度来判断抗体效价。
将一定量的红细胞与含有抗体的血清混合，红细胞与抗体结合后发生凝集现象。
根据红细胞凝集的程度，可以判断出血液中抗体的效价。
三、微注法的操作步骤1.采集血清样本：从受检者体内采集血液样本，提取血清。
2.制备红细胞悬液：将红细胞与生理盐水混合，制备成适当的红细胞悬液。
3.滴定抗体效价：将血清样本与红细胞悬液混合，观察红细胞凝集程度。
根据红细胞凝集的程度，判断抗体效价。
4.结果判断：根据凝集反应的结果，判断受检者体内各种血型抗体的效价。
四、微注法的优点与局限性微注法血型抗体效价测定具有以下优点：1.操作简便：微注法操作简单，实验设备要求较低，易于推广。
2.结果准确：微注法结果较为准确，可为临床输血提供可靠依据。
3.适用范围广泛：微注法可用于检测各种血型抗体效价，适用于临床输血、血型鉴定等领域。
然而，微注法也存在一定的局限性：1.检测范围有限：微注法仅能检测抗体效价，无法检测抗原。
2.检测时间较长：微注法需要观察红细胞凝集程度，检测时间相对较长。
五、微注法在血型抗体效价测定中的应用微注法在血型抗体效价测定中具有重要应用价值。
通过微注法检测血型抗体效价，可以为临床输血提供重要依据，降低输血不良反应的发生率。
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间接ELISA测定抗体的效价
间接ELISA测定抗体的效价【目的】测定样品中抗体的效价（Titer）【基本原理】将特异性抗原包被在固相载体上，加入含待测抗体的样品，使之与固相抗原结合（Ag-Ab），再加入酶标记的抗抗体（亦称二抗），与上述Ag-Ab复合物结合形成Ag-Ab-α-Ab-E复合物。
此时加入底物，复合物上的酶则催化底物而显色，以酶与底物的显色反应程度来确定待测抗体的效价。
由于每步之间均有冲洗步骤，因此若样品中不含相应的抗体，酶标抗体则将被洗掉，底物不显色而呈阴性反应。
间接法的优点是只要变换包被抗原就可利用同一酶标抗抗体建立检测相应抗体的方法。
1.包被固相载体常用聚苯乙烯微孔板，因为聚苯乙烯具有较强的吸附蛋白质的性能，抗体或蛋白质抗原吸附其上后仍保留原来的免疫学活性。
吸附主要为物理吸附，不发生化学反应，效果与缓冲液的浓度、pH、温育时间，载体表面性质等有关。
缓冲液宜偏碱性，离子强度较低，有利于蛋白质的吸附。
2.封闭由于血清中含有高浓度的非特异性抗体，因此在间接法中，抗原包被后一般用无关蛋白质(例如牛血清蛋白)再包被一次，以封闭固相上的空余间隙。
可用含1％BSA、1％明胶3－5％脱脂奶粉封闭。
酶标抗体可以用含BSA的PBS稀释，以减少非特异性吸附。
3.温育温育最好用水浴，室温也可，微孔板浮在水浴面可使温度迅速平衡。
且板上应加盖，避免蒸发。
应用酶促反应动力学原理，低温可提高结合率，高温可加速反应。
4.待测样品待测样品溶液中需不存在与标记酶相同的酶、底物、酶抵制剂和其它干扰因素，以防止干扰作用。
在检测过程中样本须先行稀释到适当浓度(1:40~1:200)，以避免过高的阴性本底影响结果的判断。
5.洗涤洗涤实验操作过程中决定实验成败的一个关键步骤。
目的是除去未结合的免疫反应物，终止抗原抗体的继续结合，除去标本中与反应无关的成分和游离的酶结合物以及反应过程中吸附在固相载体上的非特异性干扰物。
洗涤次数一般为3～4次，每次3分钟,要微微震荡，特别是最后一次，如有酶结合物的非特异吸附及残留，会使空白值升高，所以要使洗涤彻底。
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实验报告
10.选择波长630nm，将酶标板置于载板台上，开始扫描，测定OD值。
结果如下所示：
思考题：
1.查阅资料，了解共有哪些类型的ELISA实验，以及本实验中所用ELISA属于哪一类？答：本实验中所用ELISA属于间接法ELISA。
①直接ELISA
原理：将抗原与固相载体连接，洗涤除去未结合的抗原及杂质。
加酶标抗体进行孵育。
固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。
彻底洗涤未结合的酶标抗体。
此时固相上带有的酶量与标本中受检抗原的量相关。
加底物反应。
直接法主要用于测定抗原。
②间接法ELISA
原理：将抗原与固相载体相连结，形成固相抗原。
洗涤除去未结合的抗原及杂质。
加入特异性一抗与固相抗原相结合，形成固相抗原抗体复合物。
经洗涤后，加酶标二抗。
固相免疫复合物中的抗体与酶标二抗结合，从而间接地标记上酶。
洗涤后，加底物显色。
③双抗夹心法ELISA
原理：双抗体夹心法适用于测定二价或二价以上的大分子，但不适用于小分子抗原。
将特异。