第四章抗生素效价的微生物检定法
抗生素效价的测定ppt课件
continue
依次求出6个不同浓度梯度的标准溶液对应 的校正后抑菌圈直径大小。 d1= d0.4-a1； d3= d0.8-a3 d5= d1.2-a5 d2= d0.6-a2 d4= d1.0-a4 d6= d1.4-a6
标准曲线
．
d6 抑菌圈直径d
抗 生 素 浓 度 C
C6
．
C5
continue
例如：6组中1U/mL标准品54个抑菌圈直 径总平均值为22.6mm，而0.4U/mL(第 一组）的一组中9个1U/mL标准品抑菌圈 直径的平均值为22.4mm，则第一组的矫 正值为22.6-22.4=0.2。 如果第一组9个0.4U/mL标准品抑菌圈直 径的平均值为18.6mm，则第一组抑菌圈 直径校正后为18.6+0.2=18.8mm。
抗生素效价：用抗生素效价单位表示，反映抗生 素的活性。 抗生素效价单位：每毫升或每毫克中含有某种抗 生素的有效成分的多少，用单位U或ug表示。
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一、微生物检定法
1、原理 以抗生素对微生物的杀伤或抑制程度为 指标来衡量抗生素效价的方法。 量反应平行原理： 在实验所用的剂量范围内，对数剂量和 反应呈直线关系，供试品和标准品的直 线应平行。
稀释法 比浊法 管碟琼脂扩散法（中国）
管碟琼脂扩散法
利用抗生素在涂布特定试验菌 的固定培养基内呈球形扩散，形成 含一定浓度的抗生素球形区，抑制 了试验菌的繁殖而呈现出透明的抑 菌圈。 通过比较标准品与供试品产生 抑菌圈的大小来测定供试品的效价。
2、测 定 方 法
（1）青霉素发酵液样品溶液的制备
抗生素效价测定操作规程
QCA/QC-SOP-0061.主题内容和适用范围本规程规定了公司外购原料药品及生产成品中抗生素的效价测定方法及要求。
本规程适用于公司外购原料药品及生产成品中抗生素的效价测定。
2.引用标准《中国药典》2010年版二部。
3.术语抗生素微生物检定法：在适宜的条件下，根据量反应平行原理设计，通过检测抗生素对微生物的抑制作用，计算抗生素活性（效价）方法。
抗生素微生物检定包括两种方法，即管碟法和浊度法。
本法采用的是管碟法。
4.操作技术（仪器与用具）4.1操作室：光线明亮，操作间分a.一般操作间b半无菌操作间。
室温控制20-25℃。
注意抗生素的污染。
4.2双蝶：内径90mm高16-17mm.用后经高压灭菌倒出培养基后，置专用洗液或清洁液中浸泡过夜，冲洗，沥干150-160℃干热灭菌2小时或高压灭菌121℃30min,备用。
4.3陶瓦盖：内径103mm,外经108mm,吸水性强，定期清洗、干燥或干热灭菌。
4.4钢管：内径6.0±0.1mm高7.8±0.1mm或8.0±0.1mm,10.0±0.1mm.重量差异不超±0.05g.用后置1:1000苯扎溴铵溶液内浸泡2h以上,再灭菌洗涤,先用水洗,超声波30min或用去污粉的沙布条串擦内外壁,水冲洗,淋干,PW冲洗3次150-160℃干热灭菌2小时备用.4.5钢管放置器4.6恒温培养箱:隔水式为宜35-37℃4.7灭菌刻度吸管:用于吸取菌液及培养基（5ml、20ml），用后立即置5%石碳酸或1:1000苯扎溴铵溶液中消毒后再常规洗涤.150-160℃干热灭菌2小时备用.4.8玻璃容器:滴定管、移液管、刻度吸管、容量瓶.符合一等品规定用前用清洁液浸泡, 水洗、PW冲3次4.9称量瓶:具塞,重量在10g以下.水冲洗、淋干,置清洁液浸泡2小时以上,水洗、PW冲3次,置洁净的大平皿中.120℃干热3h,待冷到70-60℃时,取出置干燥器中备用.4.10毛细滴管: 清洁液浸泡, 水洗、PW冲3次.120℃干燥3h4.11天平:分析天平,感量0.1mg4.12抑菌圈测量仪(多功能微生物自动测量分析仪)4.13超净工作台5.菌悬液制备取短小芽孢杆菌工作用菌种营养琼脂斜面培养物，加灭菌水1~2ml将菌苔洗下，制成悬液，用吸管将此悬液接种至盛有营养琼脂培养基的扁培养瓶内，摊布均匀，在35~37℃培养7天。
抗生素的生物效价测定法
抗生素的生物效价测定法(管碟法)(总12页)--本页仅作为文档封面，使用时请直接删除即可----内页可以根据需求调整合适字体及大小--抗生素的生物效价测定法测定抗生素效价的方法比较多，一般可以分为物理学方法、化学方法、生物学方法、和两种方法配合等四大类，可根据具体情况选择使用。
生物学方法以抗生素的杀菌力作为衡量效价的标准，其原理恰好和临床应用于的要求一致这是它的优点；又其灵敏度较高，需用检品的量较小，也是其它方法所不及的。
抗生素的生物效价测定法，常用的有稀释法、比浊法和扩散法（或称渗透法）。
稀释法这一方法是用培养基将检品抗生素稀释到各种浓度，并依次分装到一系列的容器内，再加入等量“试验菌种”菌种菌液，并放在37 ℃保温箱内培养一定时间，观察何种稀释度适能抑制细菌的生长，该稀释度即为测定终点（或以细菌生长所引起的PH改变及溶血现象等生化反应作为测定终点），再与同样处理的标准抗生素的终点作比较，即可求得检品的效价。
这种方法可以使用液体培养基，也可以使用固体培养基。
所用的材料及培养基都必须严格无菌，并要注意无菌操作。
由于测定终点是以有无细菌生长来判断的，因此所得结果公是一个范围。
比浊法原理及操作大致与稀释法相同。
比浊法也是将不同量的检品及标准品分别加入培养基中，观察其对“试验菌种”的效应——即细菌生长所引起的混浊。
这一方法和稀释法的区别有二：a.比浊法的稀释间隔的密度比较近，准确度高一些；b.比浊法不以细菌有无生长的区分为终点，而是将标准品浓度和细菌生长所引起的混浊度求得一定的比例，再由检品的细菌生长混浊度推算检品的效价。
这一方法易受杂质的影响，并且不适用于有色或混浊的检品。
扩散法使用固体培养基，在培养基凝固以前将“试验菌种”混合进去，在这样备妥的培养表面，可以用种种设计使检品液或含有抗生素的物质与有菌种的培养基接触。
经过培育后，由于抗生素向培养基中扩散，凡抑菌浓度所能达到之下细菌不能生长因而形成透明的抑菌范围，此种范围一般都呈圆形，称为“抑菌圈”。
第四章抗生素效价的微生物检定法
４、特定单位 以特定的抗生素样品的某一质 量定为一单位。
复习旧课:
1、抗生素是指主要由_____生成的———————— ________________________一类________化合物 称之。
2、作为医疗用抗生素应具有————、————、— ———、————特点。
第四章： 抗生素效价的微生物检定法
教学目标：
１.解释抗生素概念、叙述医疗用抗生素特点、 了解抗生素的主要作用机制
２.叙述抗生素的效价和单位及其表示方法 ３.熟知抗生素效价检定操作流程与基本要求 ４.述说测定原理。 教学重点： 抗生素概念、医疗用抗生素特点、抗生素的效价 和单位及其表示方法 抗生素效价检定操作方法与基本要求
浊度法：系利用抗生素在液体培养基中对试验菌生 长的抑制作用，通过测定培养后细菌浊度值的大小， 比较标准品与供试品对试验菌生长抑制的程度，以 测定供试品效价的种方法。
管碟法：是利用抗生素在含敏感试验菌的琼脂培养 基中的球面扩散渗透作用，从而形成一定的抑菌圈。 通过琼脂培养基，可观察并测量出抑菌圈的大小。 在一定的抗生素浓度范围内，对数剂量(浓度)与抑 菌圈的表面积或直径成正比。
② 高、低剂量所形成的抑菌圈之差最好大于 2 mm，有些抗生素的差数可较小；
③ 高、低剂量之比一般用2:1，当高、低剂量 所致的抑菌圈差别较小时，可用高低剂量之 比为4:1的比率。
操作步骤： 1. 称量 2. 稀释 3. 双碟的制备 4. 放置钢管 5. 滴加抗生素溶液 6. 抑菌圈测量
图4－6：钢管放置器 （北京先驱威锋技术开 发公司生产开发）
教学难点： 抗生素效价检定操作方法 二剂量法效价计算公式 抗生素的主要作用机制
抗生素微生物检定法
抗生素微生物检定法本法系在适宜条件下，根据量反应平行线原理设计，通过检测抗生素对微生物的抑制作用，计算抗生素活性（效价）的方法。
抗生素微生物检定包括两种方法，即管碟法和浊度法。
测定结果经计算所得的效价，如低于估计效价的90%或高于估计效价的110%时，应调整其估计效价，重新试验（标准曲线法除外）。
除另有规定外，本法的可信限率不得大于5%。
管碟法本法系利用抗生素在琼脂培养基的扩散作用，比较标准品与供试品两者对接种的试验菌产生抑菌圈的大小，以测定供试品效价的一种方法。
（一）基本设备、用具、试验材料及标准品1. 基本设备（1）抗生素效价测定实验室：室应为半无菌，装有紫外线灯，有固定的效价测定台，台面要求水平、防震。
该室应与稀释抗生素溶液的工作室隔离，以防止空气、地面污染抗生素。
（2）超净工作台：超净工作台应放置在洁净工作室或半无菌室。
（3）抑菌圈面积测量分析仪：该仪器装有微处理机，可自动测量抑菌圈面积，并打印出统计分析的各种数据。
2. 用具（1）玻璃双碟：为硬质玻璃制品，碟底径约90mm，碟高16~17mm，碟底面应平，厚薄均匀无凹凸现象。
新购的双碟应按上述要求进行检查。
检查时可将双碟底平放在水平台上，每碟加入2ml染料液，仔细观察碟底反映的颜色深浅是否一致，挑选底部平的双碟，洗净晾干，置高温烘箱140~160 ℃干热灭菌2小时后备用。
（2）瓦圆盖：应平，无凹凸现象。
（3）不锈钢小管：外径7.8±0.1mm，径6.0±0.1mm，高10.0±0.1mm，重量差异不超过±25mg，钢管外壁要求光洁，管壁厚薄要一致，两端面要平坦光洁。
（4）小钢管放置器：四孔和六孔各一台。
（5）游标卡尺：精密度0.02mm。
（6）滴管：管口应细长平滑，不得有缺口。
3. 试验材料（1）培养基及其制备方法以下培养基、缓冲液制备时，均以115℃灭菌30分钟。
培养基Ⅰ胨 5g 磷酸氢二钾 3g 水 1000ml牛肉浸出粉 3g 琼脂 15~20g除琼脂外，混合上述成分，调节PH使比最终的PH值略高0.2~0.4，加入琼脂，加热溶化后滤过（用纸浆减压滤过或纱布棉花滤过），调节PH值使灭菌后为7.8~8.0或6.5~6.6，分装，灭菌。
抗生素微生物检定管碟法
抗生素微生物检定管碟法抗生素微生物检定管碟法抗生素微生物检定法可分为：（1）稀释法；（2）比浊法；（3）琼脂扩散法（管碟法和打孔法）。
各国药典通常采用后两种方法测定抗生素的效价。
管碟法：利用抗生素在摊布特定试验菌的固体培养基内成球面形扩散，形成含一定浓度抗生素球形区，抑制了试验菌的繁殖而呈现出透明的抑菌圈。
此法系根据抗生素在一定浓度范围内，对数剂量与抑菌圈直径（面积）呈直线关系而设计，通过检测抗生素对微生物的抑制作用，比较标准品与供试品产生抑菌圈的大小，计算出供试品的效价。
原理：利用抗生素在固体培养基中的平面扩散作用，依据量反应平行线原理并采用交叉实验设计方法，在相同实验条件下通过比较标准品（已知效价）和供试品两者对所接种试验菌产生的抑菌圈（直径或面积）大小，来测定供试品效价的一种方法。
管碟法的操作步骤：1、预试验：确定最佳的试验条件：调整试验菌的浓度、使用量、抗生素终浓度、培养基等，使抑菌圈的大小符合规定：一剂量法中心点的抑菌圈直径应在16～17.5mm，二剂量法高剂量浓度标准品溶液所致的抑菌圈直径在18～22mm，三剂量法中间剂量浓度标准品溶液所致的抑菌圈直径在15～18mm。
2、试验准备：双碟、钢管、毛细滴管、吸管的清洗及灭菌；容量瓶、定量吸管的清洗；培养基、缓冲液的准备、半无菌间的紫外消毒等。
3、双碟的制备：每只双碟加底层培养基约20ml，待培养基凝固后，将双碟放入35～37℃培养箱中，待用。
4、供试品、标准品溶液的制备：估计供试品的效价，根据试验要求设计供试品、标准品溶液稀释步骤，平行制备供试品、标准品相关剂量的溶液。
5、菌层的制备：注意菌层培养基温度；根据预试验确定加入菌层培养基的菌液量，注意制备菌层的速度和平整度。
6、滴加抗生素溶液：注意标准品、供试品高、低剂量溶液滴加顺序，保证滴加速度和加量的均匀一致。
7、双碟的培养：根据培养温度的要求在培养箱中进行培养，培养箱中水平碟放的双碟数以不超过三层为宜。
抗生素微生物检定法.ppt
抗生素效价
用管碟法（2.2）法，测定链霉素活菌剂的效价，估计效价为1 000 000 u/g，供试品最终浓度为1.4u/ml 及0.7u/ml。
链霉素的效价测定抗生素微生物检定法本法系在适宜条件下，根据量反应平行线原理设计，通过检测抗生素对微生物的抑制作用，计算抗生素活性（效性）的方法。
抗生素微生物检定包括两种方法，即管碟法和浊度法。
测定结果经计算所得的效价，如低于估计效价的90%或高于估计效价的110%时，应调整其估计效价，重新试验。
除另有规定外，本法的可信限率不得大于5%。
第一法管碟法本法系利用抗生素在琼脂培养基内的扩散作用，比较标准品与供试品两者对接种的试验菌产生抑菌圈的大小，以测定供试品效价的一种方法。
菌悬液的制备枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）悬液取枯草芽孢杆菌［CMCC（B）63501］的营养琼脂斜面培养物，接种于盛有营养琼脂培养基的培养瓶中，在35～37℃培养7日，用革兰氏染色法涂片镜检，应有芽孢85％以上。
用灭菌水将芽孢洗下，在65℃加热30分钟，备用。
短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)悬液取短小芽孢杆菌［CMCC(B)63202］的营养琼脂斜面培养物，照上述方法制备。
金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）悬液取金黄色葡萄球菌［CMCC（B）26003］的营养琼脂斜面培养物,接种于营养琼脂斜面上，在35～37℃培养20～22小时。
临用时，用灭菌水或0.9％灭菌氯化钠溶液将菌苔洗下，备用。
藤黄微球菌（Micrococcus luteus）悬液取藤黄微球菌［CMCC（B）28001］的营养琼脂斜面培养物，接种于盛有营养琼脂培养基的培养瓶中，在26～27℃培养24小时，或采用适当方法制备的菌斜面,用培养基Ⅲ或0.9％灭菌氯化钠溶液将菌苔洗下，备用。
大肠杆菌（Escherichia coli）悬液取大肠杆菌［CMCC（B）44103］的营养琼脂斜面培养物，接种于营养琼脂斜面上，在35～37℃培养20～22小时。
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授课人:汪穗福(高级讲师) 苏惠虹(助理讲师)
广州市医药中专学校
教学目标：
１.解释抗生素概念、叙述医疗用抗生素特点、 了解抗生素的主要作用机制
２.叙述抗生素的效价和单位及其表示方法 ３.熟知抗生素效价检定操作流程与基本要求 ４.述说测定原理。 教学重点： 抗生素概念、医疗用抗生素特点、抗生素的效价 和单位及其表示方法 抗生素效价检定操作方法与基本要求
单位（unit,u）：是衡量抗生素有效成分 的具体尺度。
二、抗生素的效价单位的表示方法
１、质量单位 以抗生素的生物活性部分质量作 单位，１微克（ｕｇ）＝１单位，１毫克＝１０ ００单位。
２、类似质量单位 以特定的纯粹抗生素盐类 的质量作为１单位。如纯粹金霉素盐酸盐及四 环素盐酸盐（包括无生物活性的盐酸根在内） １微克（ｕｇ）＝１单位，１毫克＝１０００ 个单位。
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第三节 管碟法测定操作
教学目标：
熟知抗生素效价检定操作流程与基本要求
教学重点： 抗生素效价检定操作方法与基本要求
教学难点：
抗生素效价检定操作方法
第三节 管碟法测定操作
1. 试验用菌液、缓冲液、培养基的制备 按药 典规定进行制备。
2. 标准品与供试品溶液的制备 按药典规定制备标准品 与供试品高低不同浓度溶液。
抗生素效价检定管碟法操作流程:
标准品的称量 →标准品的稀释→标准品溶液 --─┐
缓冲液的制备
供试品的称量 →供试品的稀释→供试品溶液 ─┐
┌───平板的制备────┐
（二）抑菌圈的形成
1、抑菌圈： 将不锈钢小管(俗称为牛津杯)
放置在含敏感试验菌的琼脂培养 基上，将抗生素溶液注入小钢管 中，抗生素分子随溶剂向培养基 内呈球面状放射状扩散。同时将 培养基置入适宜试验菌生长的培 养箱中，琼脂培养基中的试验菌 开始生长。抗生素分子在琼脂培 养基中的浓度，随离开小钢管的 距离增大而降低，离小钢管愈远， 琼脂培养基中抗生素分子愈少， 相应的抗生素浓度愈低。当抗生 素分子扩散到一定时间，在小钢 管周围形成一个能有效的抑制试 验菌生长的范围，也就是通常所 说的抑菌圈。
３、质量折算单位 以特定的纯抗生素盐的 质量为单位而加以折算。
４、特定单位 以特定的抗生素样品的某一质 量定为一单位。
复习旧课:
1、抗生素是指主要由_____生成的———————— ________________________一类________化合物 称之。
2、作为医疗用抗生素应具有————、————、— ———、————特点。
2、影响抑菌圈大小的因素：
抑菌圈的半径(大小)与最小抑菌浓 度C，琼脂层厚度H，抗生素在琼脂 内扩散系数D，抗生素在小钢管中的 量M，以及抗生素的扩散时间T有关： 这些因素的改变，常会影响抑菌圈的 大小和清晰度。
3、管碟法常用的三种方法：
按设计原理不同分:
一剂量法（标准曲线法）
管
碟
二剂量法（2·2法）
浊度法：系利用抗生素在液体培养基中对试验菌生 长的抑制作用，通过测定培养后细菌浊度值的大小， 比较标准品与供试品对试验菌生长抑制的程度，以 测定供试品效价的种方法。
管碟法：是利用抗生素在含敏感试验菌的琼脂培养 基中的球面扩散渗透作用，从而形成一定的抑菌圈。 通过琼脂培养基，可观察并测量出抑菌圈的大小。 在一定的抗生素浓度范围内，对数剂量(浓度)与抑 菌圈的表面积或直径成正比。
四、抗生素效价微生物测定技术
（一）概述
效价测定技术方法：
1、物理、化学法：简便、快速，本 身纯度不高，采用该法会引起偏差， 因此只有在纯度较高情况下可采用
2、微生物法：原理和临床应用的要 求相一致，直接反映出抗生素的疗效， 且灵敏度较高，需用量较小，因此被 广泛使用。
微生物法：
依据抗生素最小抑菌浓度而设计的稀释法；根据 不同浓度的抗生素对微生物生长速度的不同影响程 度而设计的比浊法；有依据抗生素渗透到含敏感菌 的琼脂培养基中产生抑菌圈而设计的管碟法(又称扩 散法，杯碟法或垂直扩散法)；根据对微生物呼吸抑 制程度而设计的呼吸度量法；根据对微生物代谢产 物的影响而设计的快速法，对微生物体内酶系统产 生影响的脱氢法。
教学难点： 抗生素效价检定操作方法 二剂量法效价计算公式 抗生素的主要作用机制
第一节 概述
第二节 抗生素的效价和单位 第三节 管碟法测定操作 第四节 二剂量法 总结及作业
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第一节 概述
一、抗生素的主要作用机制 １、抑制细胞壁的合成 ２、影响细胞膜的功能 ３、干扰蛋白质的合成 ４、抑制核酸的合成 二、抗生素的概念:抗生素主要是由微生物所产生的 极微量便具有选择性地杀死或抑制它种生物或肿瘤、 细胞生长的一类天然有机化合物。 三、医药用抗生素的特点： (1)有较大的差异毒力 ：差异毒力越强，越有利于临床 应用。 (2)抗菌活性强：MIC值越小，表示活性越强。 (3)抗菌谱广：广谱抗生素、窄谱抗生素 (4)不产生副作用和不良反应
法
三剂量法（3·3法）
日常使用多采用二剂量法，对于有争议结果， 必须使用三剂量法测定的结果仲裁。
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第二节 抗生素的效价和单位
一、抗生素的效价和单位 抗生素的含量用效价和单位表示。该词有
时不加区别统称为效价单位。 效价（ｐotency）：指检品的实际单位数
与其标示量的比值。常表示为效价的百分数。 效价是从比较检品与标准品的生物活性而得。
3. 双碟的制备 制备底层(每个培养皿20ML)及含一定量 试验菌的菌层(每个培养皿5ML)，并安置小钢管。
4. 滴加药液到小钢管内 将标准品、供试品溶液滴入相应 的小钢管中。
5. 培养 在恒温培养箱中培养至规定时间。（注意更换成瓦盖）
6. 测量抑菌圈 可用手工测量或仪器测量。
7. 计算结果 先进行可靠性测验,符合规定,再进行效价计算
3、抗生素效价的微生物检定法常用————、——— —方法进行。
4、表示抗生素的效价和单位有————、———— 、————、————等方法。
5、中国药典规定的应用方法中2．2法中第1个与第2 个2是分别表示＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿ ＿＿＿，而两个2则是分别表示＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿ ＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿意思。