测序 基础知识
测序的原理
测序的原理测序技术是现代生命科学研究中非常重要的工具，它可以帮助我们了解生物体内的基因组结构和功能，从而深入探究生命的奥秘。
本文将介绍测序的基本原理，包括测序方法的分类、DNA测序的过程和技术发展的历程。
一、测序方法的分类目前常用的测序方法主要包括Sanger测序、Illumina测序、PacBio测序和Nanopore测序等。
其中，Sanger测序是最早的测序方法，也是最经典的一种测序方法，它通过DNA链延伸的方式逐个测出DNA的碱基序列。
Illumina测序是一种高通量测序方法，能够同时测序数百万个DNA片段，速度快、准确性高，常用于基因组测序和转录组测序。
PacBio测序和Nanopore测序是第三代测序技术，主要特点是测序速度快、准确性高、读长长，能够对基因组进行完整测序。
二、DNA测序的过程DNA测序的过程大致可以分为文库构建、PCR扩增、片段纯化、测序和数据分析等几个步骤。
1. 文库构建文库构建是DNA测序的第一步，它的目的是将待测DNA样本转化为可以被测序仪读取的文库。
文库构建的方法因不同测序技术而异，一般包括以下几个步骤：DNA片段断裂、末端修复、连接接头、文库扩增等。
2. PCR扩增PCR扩增是DNA测序的第二步，它的主要作用是扩增文库中的DNA 片段，使其数量足够多，以便于后续测序。
PCR扩增的过程中，需要加入引物和酶等反应物，引物可以指定扩增目标DNA片段的起始和终止位置，酶则可以帮助DNA链的延伸和合成。
3. 片段纯化片段纯化是DNA测序的第三步，它的主要作用是去除PCR扩增产生的杂质，保留纯净的DNA片段。
不同的测序技术采用的片段纯化方法也不同，一般有凝胶切割、磁珠分离、离心等方法。
4. 测序测序是DNA测序的核心步骤，它的目的是逐个测定DNA片段中的碱基序列。
不同的测序技术采用的测序方法也不同，但其基本思路都是通过化学反应或物理信号转化将DNA的碱基信息转化为计算机可以识别的数字序列。
DNA测序概述非常全
DNA测序概述非常全DNA测序是一种通过测量DNA序列中的核苷酸顺序来确定个体遗传信息的技术。
它已经成为了现代生物学和医学领域中至关重要的工具，因为它可以揭示基因组的组成、功能和变异，帮助人们理解遗传疾病的发生机制，并开展个性化医疗等。
然后，实验人员需要使用合适的方法提取DNA。
DNA提取的过程是将样品中的DNA分离出来，以便进行后续的处理和测序。
通常使用的提取方法有有机溶剂法、酚-氯仿法、磁珠法等。
接下来，需要构建DNA文库。
DNA文库是测序的关键步骤之一，它是将DNA样品分割成较小的片段，并将其连接到测序平台上所需的适配器上。
构建DNA文库的方法有不同的选择，包括传统的Sanger测序方法和高通量测序方法，如Illumina测序。
在测序过程中，DNA分子将被放到测序仪中进行读取。
不同的测序技术有不同的原理和方法，如Sanger测序、Illumina测序、Ion Torrent测序等。
这些技术都以不同的方式读取DNA序列中的核苷酸顺序，生成原始测序数据。
测序完成后，实验人员需要进行数据分析。
数据分析通常包括质量控制、序列比对、变异检测等步骤。
质量控制可以评估测序数据的准确性和可靠性，确保后续的分析工作的可信度。
序列比对是将测序数据与参考序列进行比对，以确定测序数据中的序列位置和变异信息。
变异检测则是通过比对结果来寻找个体之间的差异，包括SNP（单核苷酸多态性）、缺失、插入等。
最后，通过对测序数据和分析结果的解读，可以获得遗传信息和相关疾病的相关信息。
这包括基因型、表型、个人风险评估等信息。
这些信息可以用于研究基因功能、疾病诊断和预后、个体化治疗等领域。
总之，DNA测序是一项基础而重要的技术，它以高通量、快速和精确的特点，为我们提供了揭示基因组的奥秘和改善人类健康的强大工具。
随着测序技术的不断进步和成本的降低，预计在未来的几年内，DNA测序将在基因组学、医学和其他领域的研究和应用中起到越来越重要的作用。
RNA-seq基础知识
RNA-seq基础知识1.RNA-Seq名词解释2.测序名词解释3.高通量测序常用名词解释4.转录组测序问题集锦RNA-Seq名词解释1.index 测序的标签，用于测定混合样本，通过每个样本添加的不同标签进行数据区分，鉴别测序样品。
2.碱基质量值（Quality Score或Q-score）是碱基识别（Base Calling）出错的概率的整数映射。
碱基质量值越高表明碱基识别越可靠，碱基测错的可能性越小。
3.Q30 碱基质量值为Q30代表碱基的精确度在99.9%。
4.FPKM（Fragments Per Kilobase of transcript per Millionfragments mapped）每1百万个map上的reads中map到外显子的每1K个碱基上的fragment个数。
计算公式为公式中，cDNAFragments 表示比对到某一转录本上的片段数目，即双端Reads数目；Mapped Reads(Millions)表示Mapped Reads总数，以10为单位；Transcript Length(kb)：转录本长度，以kb个碱基为单位。
5.FC（Fold Change）即差异表达倍数。
6.FDR（False Discovery Rate）即错误发现率，定义为在多重假设检验过程中，错误拒绝(拒绝真的原(零)假设)的个数占所有被拒绝的原假设个数的比例的期望值。
通过控制FDR来决定P值的阈值。
7.P值（P-value）即概率，反映某一事件发生的可能性大小。
统计学根据显著性检验方法所得到的P 值，一般以P<0.05为显著，P<0.01为非常显著，其含义是样本间的差异由抽样误差所致的概率小于0.05或0.01。
8.可变剪接（Alternative splicing）有些基因的一个mRNA前体通过不同的剪接方式（选择不同的剪接位点）产生不同的mRNA剪接异构体，这一过程称为可变剪接(或选择性剪接，alternative splicing)。
DNA测序最基础知识-必读
Sugar Moiety
contains a hydrogen (H) atom at the number
2' carbon. Normal ribose has a hydorxyl (-OH) group at this position.
Nitrogen Bases
Attached to the 5' carbon is a triphosphate group. This group is important because in a DNA chain it undergoes a reaction with the 3' OH group to produce polydeoxynucleotide.
DNA Structure
A. The Concept
DNA has a regular structure. It's orientation, width, width between nucleotides, length and number of nucleotides per helical turn is constant. All of these features were described by Watson and Crick. Adenine is always opposite thymine, and cytosine is always oppostie guanine. The two strands are held together by hydrogen bonds: two bonds between adeninine and thymine and three bonds between guanine and cytosine.
测序基础知识--整理
测序基础知识--整理测序： 如何计算测序深度，或产出的数据量？ 10的9次⽅=1G 如果测序的read是pair-end的、且每条read长150bp，则，平均测序深度为=（reads数×150bp×2）/（3*10的10次⽅）。
即：测序得到的碱基总数/⼈类基因组的碱基对数=平均测序深度。
⽐如，我想得到30x的测序数据，那么需要的数据量是90G的数据。
（此处，还不甚了解，我觉得应该是900G的数据啊） （⼈类基因组有30亿个碱基对（3*10的10次⽅）） 测序错误率：⼀般选择的阀值是10的-3次⽅，即测序错误率是0.001。
（PCR的错误率是10的-6次⽅） coverage与depth的概念：coverage指的是测序数据覆盖的⼈类基因组的碱基数。
depth指的是平均每个碱基被测序read覆盖的次数（即被测到的次数）。
index的含义：index⽤来区分不同的样本。
单端index共6个碱基，排列组合，共4的6次⽅个碱基，⽆法区分66个样本。
故，需要采⽤双端index。
双端index，分为i5和i7端。
i5端有8个碱基，i7端有12个碱基。
测序的cycle：⼀个cycle读取⼀个碱基。
也称为：base call。
若有index序列，则测序仪会多读⼏个cycle。
⽂库构建： 加Y型adapter的⽬的：1）区分read1和read2，即DNA链的两端；2）防⽌adapter⾃连。
Y型adapter不是互补的，两端的序列不⼀致。
10ng的DNA就可以建库，测序。
WGS： 全基因组的重复率是20%，⽤picard统计duplicate的⼯具（原理：map位置相同，cigar值相同）。
建库流程：提取全基因组，打断、末端不平加A，加adapter，PCR扩增，测序。
区别cfDNA的靶向建库：cfDNA已经是断裂的⽚段，所以不需要打断、末端补平加A的步骤，只要提取游离DNA后，⽤引物扩增即可。
高通量测序-名词解释
高通量测序基础知识汇总一代测序技术：即传统的Sanger测序法，Sanger法是根据核苷酸在待定序列模板上的引物点开始，随机在某一个特定的碱基处终止，并且在每个碱基后面进行荧光标记，产生以A、T、C、G结束的四组不同长度的一系列核苷酸，每一次序列测定由一套四个单独的反应构成，每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)，并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)。
由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH 基团，使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、A、T或C处终止，使反应得到一组长几百至几千碱基的链终止产物。
它们具有共同的起始点，但终止在不同的的核苷酸上，可通过高分辨率变性凝胶电泳别离大小不同的片段，通过检测得到DNA碱基序列。
二代测序技术：next generation sequencing〔NGS〕又称为高通量测序技术，与传统测序相比，二代测序技术可以一次对几十万到几百万条核酸分子同时进行序列测定，从而使得对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能，所以又被称为深度测序〔Deep sequencing〕。
NGS主要的平台有Roche〔454 & 454+〕，Illumina〔HiSeq 2000/2500、GA IIx、MiSeq〕，ABI SOLiD等。
基因：Gene，是遗传的物质基础，是DNA或RNA分子上具有遗传信息的特定核苷酸序列。
基因通过复制把遗传信息传递给下一代，使后代出现与亲代相似的性状。
DNA：Deoxyribonucleic acid，脱氧核糖核酸，一个脱氧核苷酸分子由三部分组成：含氮碱基、脱氧核糖、磷酸。
脱氧核糖核酸通过3',5'-磷酸二酯键按一定的顺序彼此相连构成长链，即DNA链，DNA链上特定的核苷酸序列包含有生物的遗传信息，是绝大部分生物遗传信息的载体。
RNA：Ribonucleic Acid，，核糖核酸，一个核糖核苷酸分子由碱基，核糖和磷酸构成。
测序_精品文档
测序测序技术介绍及应用摘要：测序是现代生物学研究中一种重要的技术手段，可以用于研究基因组、转录组和表观组。
本文旨在介绍测序的原理、常用的测序技术、测序数据分析的基本流程以及测序技术在生物学研究和医学应用中的重要作用。
一、引言随着DNA测序技术的不断发展，研究者可以更加深入地了解生命的本质。
通过测序，我们可以获取基因组、基因序列以及整个生物体内的遗传信息。
测序技术的重要性不言而喻，它在基因组学、转录组学、表观组学等领域起着至关重要的作用。
二、测序原理测序技术的原理是根据DNA的碱基序列信息，通过不同的方法将碱基按序进行识别和标记。
常见的测序原理有Sanger测序和下一代测序技术。
1. Sanger测序Sanger测序是一种经典的测序技术，它利用DNA聚合酶在模板链上添加dNTP（脱氧核苷酸三磷酸），以及引物链终止反应和分子量分析的方法，逐个测序DNA片段中的碱基。
2. 下一代测序技术下一代测序技术包括Illumina测序、Ion Torrent测序、PacBio测序和Oxford Nanopore测序等。
这些技术在测序过程中，通过将DNA片段连接到适当的载体上，通过PCR扩增或形成“微块”等方法，使得每个片段在同一时间被反复测序，大大提高了测序的速度和效率。
三、常用的测序技术目前，常用的测序技术主要包括Sanger测序和下一代测序技术。
1. Sanger测序Sanger测序是一种传统的测序技术，具有准确性高和稳定性好的特点，适用于小规模测序和验证性实验。
2. Illumina测序Illumina测序是下一代测序技术中最常用的技术之一，具有高通量、高精确度和较低成本的特点。
它利用DNA片段的桥式PCR和碱基逐个加入的方式，实现了对大规模DNA测序的高效率和高覆盖度。
3. Ion Torrent测序Ion Torrent测序是一种基于半导体技术的测序方法，它利用DNA聚合酶在模板链上加入dNTP的过程中释放出的质子信号来检测碱基的序列。
dna测序的基本原理和应用
DNA测序的基本原理和应用1. DNA测序的基本原理DNA测序是指通过分析DNA分子的核苷酸序列，来确定DNA中各个碱基的排列顺序的技术方法。
DNA测序的基本原理是通过一系列的化学反应和细胞生物学技术，将DNA分子扩增、分离、定位和记录。
以下是DNA测序的基本原理：•DNA分子的扩增：DNA测序的第一步是通过PCR（聚合酶链式反应）或其他扩增技术，使得需要测序的DNA片段得到快速繁殖，以提高测序的灵敏度。
•DNA分子的分离：扩增后的DNA片段经过一系列的分离步骤，如凝胶电泳或离心等，使得不同大小的DNA片段可以被分离出来，为后续的测序步骤做准备。
•核苷酸的定位：通过使用荧光标记、放射性同位素标记或质谱分析等标记技术，将DNA片段的每个碱基进行标记。
•数据记录和分析：通过激发荧光或接收质谱信号等方式，将标记的碱基进行记录。
然后，根据每个碱基的信号强度，确定每个位置的碱基种类。
2. DNA测序的应用DNA测序是一项重要的基因组学技术，它在许多生物领域中得到了广泛的应用。
以下是DNA测序的一些主要应用：2.1 人类基因组的研究DNA测序技术的快速发展使得人类基因组的测序成为可能。
通过对人类基因组的测序，可以深入研究人类基因的组成和作用，从而揭示人类遗传信息的奥秘，为人类疾病的研究提供基础。
2.2 生物进化和种群遗传学的研究DNA测序技术还可以用于研究生物的进化关系和种群遗传学。
通过对不同物种或不同个体的DNA进行测序比较，可以揭示物种的进化关系以及不同个体之间的遗传差异。
2.3 疾病的诊断和治疗DNA测序技术在医学领域中也得到了广泛的应用。
通过对疾病相关基因的测序，可以帮助诊断各种遗传疾病，并开展个体化的治疗。
此外，通过对个体基因组的测序，还可以预测个体对药物的反应，从而实现个体化的药物治疗。
2.4 基因工程和转基因技术DNA测序技术在基因工程和转基因技术中也起到了关键的作用。
通过对目标基因进行测序，可以获取基因的完整信息，并为基因的操作和改造提供依据。
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转录组高通量测序中，reads、contigs、scaffold、unigene、singleton
高通量测序时，在芯片上的每个反应，会读出一条序列，是比较短的，叫read，它们是原始数据；
有很多reads通过片段重叠，能够组装成一个更大的片段，称为contig（克隆群）；
多个contigs通过片段重叠，组成一个更长的scaffold；
一个contig被组成出来之后，鉴定发现它是编码蛋白质的基因，就叫singleton；
多个contigs组装成scaffold之后，鉴定发现它编码蛋白质的基因，叫unigene。
基因组测序方法：
链中止法测序：通过合成与单链DNA互补的多核甘酸链，由于合成的互补链可在不同位置随机终止反应，产生只差一个核苷酸的DNA分子，从而来读取待测DNA分子的顺序。
化学降解法测序：在待定的核苷酸碱基中引入化学集团，再用化合物处理，使DNA分子在被修饰的位置降解。
自动化测序：与链终止测序原理相同，这姿势用不同的荧光色彩标记ddNTP，如ddA TP 标记红色荧光，ddCTP标记蓝色荧光，ddGTP标记黄色荧光，ddTTP标记绿色荧光。
由于每种ddNTP带有各自待定的荧光颜色，二简化为由1个泳道同时判读4种碱基。
非常规DNA测序毛细管电泳、光点测序、DNA芯片测序、随机的组装（鸟枪法）鸟枪法：就有可能出现错装。
鸟枪法策略指导测序策略
不需要背景信息构建克隆群
时间短需要几年时间
需要大型计算机
得到的是草图（Draft）得到的是精细图谱
EST （Expressed sequence tag）测序
EST是一种重要的基因组图分子标记，以EST为探针很容易从cDNA文库中筛选全基因，又可从BAC克隆中找到其基因组的基因序列。
优点：mRNA可直接反转录成cDNA，而且cDNA文库也可比较容易构建。
对cDNA文库大量测序，即可获得大量的EST序列
EST为基因的编码区，不包括内含子和基因间区域，一次测序的结果足以鉴定所代表的基因。
人类基因组计划于1990年启动，我国于1999年加入，承担1%任务，即人类3号染色体短臂上约30MB的测序任务。
2000年6月26完成草图。
测序错误率低于1%%。