生物样品前处理
干湿结合生物学研究方法
干湿结合生物学研究方法在生物学研究领域，干湿结合的方法已经成为一种高效、全面的研究策略，涵盖了从生物样品的前处理到测序与表达分析等多个步骤。
干湿结合生物学研究方法结合了湿法和干法两种技术，下面将详细介绍这些内容。
1、湿法生物样品前处理湿法生物样品前处理是一种常用的样品处理方法，主要利用液体介质进行样品破碎、细胞裂解和蛋白质、核酸等生物分子的提取。
湿法处理具有高效、温和的优点，适用于大部分生物样品的处理。
湿法生物样品前处理的主要步骤包括：样品收集、细胞破碎、细胞裂解、蛋白质变性、核酸提取等。
在操作过程中，需要注意保持无菌条件，避免样品污染，同时要尽量减少对生物分子的破坏，保持其天然活性。
2、干法生物样品前处理干法生物样品前处理主要利用干粉试剂或干式生化试剂进行样品破碎、细胞裂解和生物分子的提取。
干法处理具有简便、快速、无需特殊设备的优点，适用于一些不易获得的生物样品或需要快速处理的紧急样品。
干法生物样品前处理的主要步骤包括：样品收集、细胞破碎、细胞裂解、干燥、试剂添加等。
在操作过程中，需要注意避免样品污染，保证细胞的充分破碎和裂解，同时要保证生物分子的完整性。
3、蛋白质生物样品分离与纯化蛋白质生物样品分离与纯化是生物学研究中的重要步骤，其主要目的是将目标蛋白质与其他生物分子（如核酸、脂质等）进行有效分离，从而对其进行深入研究和应用。
蛋白质生物样品分离与纯化的主要方法包括：离子交换色谱、凝胶色谱、亲和色谱、电泳等。
这些方法各有特点，适用范围也不同，需要根据具体研究需求进行选择。
在操作过程中，需要注意保证样品的均一性和回收率，同时要尽量避免非特异性吸附和样品损失。
4、DNA生物样品提取与纯化DNA生物样品提取与纯化的目的是从生物样品中提取出高质量的DNA，去除其中的杂质和干扰物质，以便进行后续的基因组学研究。
DNA生物样品提取与纯化的主要方法包括：酚氯仿抽提法、硅胶膜吸附法、磁珠法等。
这些方法都能够高效地提取和纯化DNA，但操作过程和适用范围略有不同。
生物样品前处理方法
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生物样品前处理的考虑因素
▲药物的理化性质和存在形式 ▲待测药物的浓度范围 ▲选用的生物样品类型
▲样品预处理与分析技术的关系
▲药物测定的目的
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生物样品前处理-有机破坏法
▲湿法破坏
硝酸-高氯酸法、电热消化器法、电热板消化法、烘箱消化 法。
▲干法破坏
高温电阻炉灰化法、低温等离子灰化法。
中某些组分，再用适当溶剂冲出杂质。 然后用少量溶剂洗脱，从而达到分离、净化与浓缩的目 的。
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生物样品前处理-固相萃取法
▲固相萃取法适用范围
大多数液体生物样品的前处理（如血浆、尿等）。
固体、半固体样品经过处理后也可使用SPE进行分离。
▲固相萃取法操作步骤
活化：根据所选择固定相的类型使用相应的活化溶剂
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生物样品前处理-固相萃取法
▲固相萃取法简介
固相萃取技术（SPE）是从上世纪八十年代中期发展起
来的，广泛运用于医学、制药、环境、食品等领域。 固相萃取法（SPE）就是用固体物质作为萃取剂，采用 高效、高选择性的固定相，进行萃取的样品预处理技术。
▲固相萃取法原理
以吸附剂为固定相，当液体样品通过固定相时，保留其
▲ 沉淀蛋白法优点
操作简便易行
▲ 沉淀蛋白法缺点
此法仅除去了蛋白质，内源性杂质并没有除去。
运用此法处理后的样品浓度会被稀释，不利于检测。
。 此法所得样品不能用光谱法检测。
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生物样品前处理-液液萃取法
▲液液萃取法简介
多数药物是亲脂性的，在适当的有机溶剂中的溶解度大于在水 相中的溶解度，而生物样品中的大多数内源性杂质是强极性 的水溶性物质。因而用有机溶剂萃取一次即可除去大部分杂 质。
生物样品前处理
[5]胡小刚,李攻科.分子印迹技术在样品前处理中的应用[J].分析化学.2006,(34)7: 1035-1041
[6]张丽华，肖国平，宋游.微波技术在生物样品预处理中的应用[J].基础和应用基础研究与放射化学与核化学:133
2.对于在常温下需要长时间反应的样品，可将准备好的样品放置过夜，第2天再放进消解炉消解。
3.对于预处理时间长的难处理样品，也可采用放过夜的方法，第2天再进行消解处理。样品经过处理后，若溶液体积小于5ml时，则必须补加水或酸，使其体积不小于5ml，然后再进行微波消解。
总之,生物样品的预处理因其多样、复杂而成为整个检测过程中的关键环节。所述各种处理方法各有其特点,根据化合物的物理化学性质选择合适的前处理方法是取得满意检测结果的必要条件。
[1]周婷婷,范国荣,吴玉田.超临界流体萃取法在生物样品前处理中的应用[J].药学学报.2004 ,39(4) :317 – 320
[2]张颖.生物样品预处理技术及应用进展[J].天津药学,2006, 18(1):56-58
[3]李向阳，杨梅，彭宝珠.固相微萃取在生物药物分析中的应用[J].2002,23(4):69-71
目前各类文献上报道的MIP制备方法基本上是非共价法。在此方法中,印迹分子与功能单体之间通过分子间的非共价作用预先自组装排列,以非共价键形成多重作用位点,这种分子间的相互作用通过交联聚合后保留下来。常用的非共价作用有:氢键、静电引力、金属螯合作用、电荷转移、疏水作用以及范德华力等,其中以氢键应用最为广泛[5]。
分子印迹聚合物(molecularly imp rinted polymer, MIP)制备简单,能够反复使用,机械强度较高,稳定性好。因此它非常适合用作SPE的填充剂或SPME的涂层材料来分离富集复杂样品中的分析物,以达到分离净化和富集的目的。
生物样品前处理
Oasis HLB柱（聚合物基质）
离子交换与反相模式 混合的固相萃取
离子交换 反相作用
•强阳离子和反相双重保留基质 •常用于提取净化生物基质中的 弱碱性化合物 •酸性环境中含氮碱性基团与磺 酸基结合 •酸性药物呈分子状态发生反相 结合作用
离子交换与反相模式 混合的固相萃取
固相萃取法方法总结
SPE优点：
生物样品常用的处理方法
主要考虑生物样品的种类、被测药物的性质和测定方 法三个方面的问题：
一
二
三
沉淀蛋白 (PPT)
液液萃取 (LLE)
固相萃取 (SPE)
固相萃取技术(SPE)
固相萃取(Solid Phase Extraction，简称SPE)是从
八十年代中期开始发展起来的一 项样品前处理技术。由液固萃取 和液相色谱技术相结合发展而来。 主要通过固相填料对样品组分的 选择性吸咐及解吸过程，实现对 样品的分离，纯化和富集。主要 目的在于降低样品基质干扰，提 高检测灵敏度
基质效应评价方法
柱后灌注法 提取后加入法（相对基质效应评价）
•MF：基质效应因子 •MF=Set 2/Set 1 •IS-normalized MF : 内标归一化基质效应因子
血浆
血浆
➢将采取的血液置含有抗凝剂 （如肝素、EDTA)的试管中，混 合后，3000-4000r/min离心，分 离红细胞，上清液即为血浆。 ➢测定血中药物浓度通常是指测 定血浆或血清中的药物浓度，而 不是指含有血细胞的全血中 的 药物浓度。
血清
血清
➢血清是采血后不加任何抗凝剂， 于室温下静置15-30min，待其自 然凝结后，离心，分离出上清液。 ➢血清较血浆颜色更浅，较血浆 少了大部分纤维蛋白，更易进行 处理，且血浆及血清中的药物浓 度测定值通常是相同的。
药物分析中的生物样品前处理方法研究
药物分析中的生物样品前处理方法研究近年来，随着生物医药领域的快速发展，药物分析在疾病的诊断和治疗中扮演着至关重要的角色。
为了获得准确可靠的分析结果，生物样品的前处理方法显得尤为重要。
本文将探讨药物分析中常用的生物样品前处理方法的研究进展。
一、血液样品的前处理方法研究血液样品作为一种常见的生物样品，在药物分析中扮演着重要的角色。
然而，血液样品中存在着各种成分的干扰，如蛋白质、血红蛋白等。
因此，研究人员提出了多种前处理方法来解决这些问题。
1. 血浆/血清的蛋白质沉淀方法血浆/血清中的蛋白质是最常见的干扰物之一。
为了降低蛋白质对分析结果的影响，研究人员开发了各种蛋白质沉淀方法。
例如，酸沉淀法可以通过改变pH值使蛋白质凝聚沉淀，从而去除蛋白质干扰。
此外，还有醇沉淀法、有机溶剂沉淀法等。
2. 血浆/血清的固相萃取方法固相萃取方法是血液样品前处理中常用的技术之一。
其原理是利用吸附剂对目标化合物进行特异性吸附，从而去除干扰物。
通过选择合适的吸附剂，可以实现对特定成分的富集。
例如，固相萃取柱常用于血浆/血清样品中药物的富集与净化。
二、尿液样品的前处理方法研究尿液样品常用于药物代谢和排泄的研究，但由于其复杂的成分和高度变异性，前处理方法显得尤为重要。
1. 尿液样品的前处理方法选择尿液样品前处理的关键是选择合适的方法。
常见的前处理方法包括尿液蛋白质去除、有机溶剂浓缩、尿液稀释等。
根据具体的分析需求和目标物质的特性，选择恰当的前处理方法可以显著提高分析结果的准确性和灵敏度。
2. 尿液样品的固相萃取方法研究固相萃取也是尿液样品前处理中常用的技术之一。
通过选择适当的吸附剂和前处理条件，可以有效地去除尿液中的杂质，提高目标物质的测量灵敏度。
例如，固相萃取柱结合气相色谱-质谱联用技术可以用于尿液样品中药物代谢产物的研究。
三、其他生物样品的前处理方法研究除了血液和尿液样品，还有其他生物样品在药物分析中的应用。
例如，头发样品被广泛用于毒品滥用的检测。
化学分析方法的生物样品前处理技术
化学分析方法的生物样品前处理技术化学分析是现代科学研究和工业生产中不可或缺的一环。
为了获得准确和可靠的化学分析结果，对于生物样品的前处理技术至关重要。
本文将介绍几种常用的生物样品前处理技术，包括固相萃取、液液萃取、溶剂萃取和分离提纯技术。
一、固相萃取技术固相萃取（Solid-phase Extraction，简称SPE）是一种用于生物样品前处理的重要技术。
其原理是将待检样品与吸附剂接触或通过吸附剂时，目标分析物被吸附到吸附剂上，达到样品的富集和净化。
固相萃取技术具有以下优点：操作简单、灵敏度高、富集效果好、耗时短等。
在化学分析领域中被广泛应用。
二、液液萃取技术液液萃取（Liquid-Liquid Extraction，简称LLE）是一种通过溶剂与待检样品中目标分析物的选择性溶解度差异而发生分离的技术。
其原理是将待检样品与萃取溶剂进行充分混合搅拌后，静置，根据目标分析物在两种溶剂中的分配系数，使其转移到相应的溶剂层中。
液液萃取技术适用范围广泛，操作简单。
但其溶剂消耗大，使用过程中易产生有机溶剂挥发、环境危害等问题，因此在实际应用中需要加以控制和优化。
三、溶剂萃取技术溶剂萃取技术（Solvent Extraction）是指通过非挥发性溶剂将目标分析物从待测样品中提取出来。
它是一种在液液界面上基于物质间相互作用力原理进行的分离技术。
该技术广泛应用于生物样品的前处理中。
溶剂萃取技术不仅可以提取有机物，还能用于提取无机物，同时能实现溶液的浓缩和纯化。
在生物样品前处理中，该技术常与其他技术，如SPE技术结合使用，以实现样品更好的富集和净化效果。
四、分离提纯技术分离提纯技术在生物样品前处理过程中起到了至关重要的作用。
常见的分离提纯技术包括薄层色谱、气相色谱、高效液相色谱等。
薄层色谱技术（Thin Layer Chromatography，简称TLC）是一种常用的分离化合物的方法。
它通过将待测样品在薄层色谱板上作用，根据各种成分的溶解度差异和物理化学性质等特点进行分离。
生物样本样品前处理
4
常用液液提取溶剂
溶剂名称 二氯甲烷 乙酸乙酯 氯代正丁烷
乙醚 戊烷 环己烷 正己烷 甲苯 异丙醇* 四氢呋喃* 乙腈* 正丁醇* 水*
分子量 84.9 88.1 92.6 74.1 72.2 84.2 86.2 92.2 60.1 72.1 41.1 74.1 18.0
注：“*”表示与水互溶
沸点（℃） 40
5、固相萃取法：可实现自动化，基质效应降低，同时完成样品的富
集与净化；但成本较高
3
液液提取法
利用目标化合物在生物基质和与水不互溶的有机溶剂中溶解度或分配 系数的不同，使化合物从生物基质中转移至有机相中。
➢两相的分离需借助两相的密度差来实现
➢原理：相似相溶
➢分配系数：kA=yA/xA yA和xA分别表示在萃取相和萃余相中的质量比率
常见表面活性剂：Triton-X-100，吐温等
Tips
1、表面活性剂需确立一个浓度范围而不是单一浓度。 2、样本已经采集，考虑将待测物从容器中解离出来。
14
讨论和问题
Thank you!
15
0.08 0.36 1.66 1.63 3.92 1.50 1.84
5
固相提取法
◇HLB(Hydrophilic-Lipophilic Balance Copolymer)材料的优点
△水可浸润 △反相保留 △PH1-14范围内稳定 △没有裸露硅羟基
6
固相提取法
7
固相提取法
8
固相提取法
改变化合物PH，酸性 保留，碱性洗脱
77.1 77
34.5 36.1 80.7
69 110.6 82.4
66 81.6 117 100
密度（g/mL) 1.33 0.90 0.89 0.71 0.63 0.78 0.66 0.87 0.79 0.89 0.78 1.00 1.00
透射电镜生物样品前处理步骤
电镜样品制备步骤1、取材：放入2.5%戊二醛溶液中固定2-4h(4℃可保存1-2周，冷冻可保存2年)注：不可用自来水冲洗，被钳、镊夹取造成机械损伤的组织不可部分可取较大面积，但厚度必须小于1mm（戊二醛固定能力小于0.5mm）2、漂洗：牙签取出样品至新的1.5ml离心管，用0.1M pH7.0磷酸缓冲液（PBS）漂洗样品三次（摇床），每次15min3、锇酸固定与再漂洗：1%锇酸溶液固定样品1-2h（临用前计算用量≤50ul/样，用0.1M PBS将2%锇酸稀释至1%，通风橱操作），吸出固定液，用0.1M pH7.0 PBS漂洗样品三次，每次15min注：漂洗以清除固定液，避免产生沉淀物干扰结构观察4、脱水剂梯度脱水：用梯度浓度（50%，70%，80%，90%和95%）乙醇溶液对样品进行脱水处理，每个浓度处理15min再用100%乙醇处理20min （乙醇细胞内抽提少，但与包埋剂相容性差）最后用纯丙酮处理20min（若包埋剂为Epon改用环氧乙烷置换）注：脱水以清除游离水以便包埋剂均匀渗透；脱水剂易吸收空气中水分，密封，置换时应该迅速由低到高逐级脱水而不能急剧脱水，更换溶液时应迅速，以免组织内外产生气泡。
5、包埋剂梯度渗透：①用包埋剂丙酮混合液（V/V=1/1）处理样品1h：计算用量80ul/样再配制(参考样品大小)②用包埋剂丙酮混合液（V/V=3/1）处理样品3h：计算用量80ul/样再配制(参考样品大小)③纯包埋剂渗透样品过夜：将样品移至干燥的新离心管中，常温过夜(所用器具均应干燥)注：样品周围不能有气泡6、加热聚合：牙签取出经渗透处理的样品至0.5ml干燥离心管（预先装入约300ul包埋剂），加热聚合仪70℃加热过夜。
7、莱卡EM UC 7超薄切片仪修快、切片（50-70nm）8、正染色：塑料包埋模具（刀划几道缝隙），染色时温度低影响染色效果，冬天空调醋酸双氧铀50%乙醇饱和溶液100ul染色（15min-1h），双蒸水冲洗柠檬酸铅100ul染色15min（极易吸收空气中CO2产生PbCO3,染色时毋对着说话、呼吸，同时放置数块NaOH）9、日立H-7650透射电镜观察spurr包埋剂配制：ERL 2.5gNSA 5.2 g 混合均匀后再加入催化剂DMAE，搅拌30min；低温干燥保存DER 2.5 gDMAE 0.1g宜新鲜配制但由于使用期限长(3-4天)，混合物可在使用前一天制备。
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LLE方法操作实例
操作实例
萃取剂
LLE方法操作实例
待测药物：氯雷他定
内标：地西泮
LLE方法总结
优点
➢选择性高，可除去大部分杂质 ➢对有机溶剂蒸发后复溶，可以对样品进行浓缩 ➢样品较干净，对仪器污染小 ➢不同PH体系中与不同的萃取剂组合，可控制回收率，并降 低基质效应
缺点
➢操作繁琐，不能自动化 ➢易乳化 ➢一般提取回收率较低 ➢不适用于极性大或者易挥发的化合物的提取 ➢由于需要挥发有机溶剂，对于热不稳定的化合物也不太适合， 容器吸附的化合物也有一定的困难
生物样品的储存
一、冷藏或冷冻
➢采样后除了立即分析外，为防止药物发生变化，应： 短期保存，可4℃冷藏 长期保存，可-20℃冷冻，不要反复冻融（大部分药物） -80℃，阿莫西林等抗生素
二、有时，还应考虑加入稳定剂
➢酶抑制剂：一些酯类药物，如普鲁卡因、阿糖胞苷，易受 血浆酯酶作用而发生水解，而应在采样后立即加入酶抑制剂 如氟化钠。 ➢抗氧化剂：一些易氧化的物质，可加入VC或其它氧化剂。 如血浆中的儿茶酚类药物常规保存仅4周，若加入适量的VC， 则能保存10周。
常用中性盐种类
•饱和硫酸铵、硫酸钠、镁盐、磷酸盐、枸橼酸盐
操作实例
•血清和饱和硫酸铵的比例为1:2，混合，离心10000r/min 1-2min， 即可除去90%以上蛋白质
生物样品常用的性质和测定方 法三个方面的问题：
一
二
三
沉淀蛋白 (PPT)
液液萃取 (LLE)
固相萃取技术基本原理和方法
基本原理
➢采用选择性吸附、选择性洗脱的方式对样品进行富集、分离、 纯化，是一种包括液相和固相的物理萃取过程；也可以将其近 似地看作一种简单的色谱过程
基本方法
➢较常用的方法是使液体样品通过一吸附剂，保留其中被测物 质，再选用适当强度溶剂冲去杂质，然后用少量良溶剂洗脱被 测物质，从而达到快速分离净化与浓缩的目的 ➢也可选择性吸附干扰杂质，而让被测物质流出
吸附型萃取
➢采用极性较强的硅胶、硅藻土和氧化铝等吸附剂
固相萃取和HPLC相比的特点
➢ SPE也是一个柱色谱分离过程，分离机理、固定相 和溶剂的选择等方面与高效液相色谱（HPLC）有许多 相似之处。
➢ 但是SPE柱的填料粒径（>40µm）要比HPLC填料 （3~10µm）大。由于短的柱床和大的粒径，SPE柱效 比HPLC色谱柱低得多。
生物样品的储存和预处理 (添加酶抑制剂)
体内胆碱酯酶的 作用下缓慢代谢
盐酸班布特罗（前药）
阻断水解 特布他林（代谢产物）
毒扁豆碱 (胆碱酯酶抑制剂）
生物样品的储存和预处理(避光）
生物样品的储存和预处理 (PH值和温度）
生物样品预处理目的
1
2
3
➢将药物从缀 合物（尿）或 结合物中释放 出来，以测定 药物浓度
缺点
➢只适用于样品中浓度较高的药物测定； ➢样品处理后仍然存在很多干扰物质，对结果产生干扰； ➢残余的杂质会堵塞色谱柱，污染仪器
加入强酸
原理
➢当PH低于蛋白质等电点时，蛋白质以阳离子形式存在，加入强酸， 可与蛋白质阳离子形成不溶性盐沉淀。
常用有机溶剂种类
•10%三氯醋酸， 10%高氯酸等
经验总结
➢血清与强酸的比例为1:0.6混合，高速离心，就可除去蛋白质 ➢在酸性条件下分解的药物不宜本法除蛋白
Oasis HLB柱（聚合物基质）
Oasis HLB柱（聚合物基质）
➢亲水亲脂柱的优点
•亲水基团（吡咯烷酮基团）和疏水基团（二 乙烯基苯）,对极性化合物和非极性化合物均 有较好的保留，具有亲水亲脂平衡的特性 •具有水可润湿性，填料经活化后，即使柱床 干涸，吸附剂对目标物的保留也不会发生变化 •有机聚合物而非硅胶，在pH 0-14 的范围内 表现稳定 •有机聚合物基质的吸附剂，不存在次级相互 作用，用于碱性化合物能够得到满意的结果
生物样品常用的处理方法
主要考虑生物样品的种类、被测药物的性质和测定方 法三个方面的问题：
一
二
三
沉淀蛋白 (PPT)
液液萃取 (LLE)
固相萃取 (SPE)
固相萃取技术(SPE)
固相萃取(Solid Phase Extraction，简称SPE)是从
八十年代中期开始发展起来的一 项样品前处理技术。由液固萃取 和液相色谱技术相结合发展而来。 主要通过固相填料对样品组分的 选择性吸咐及解吸过程，实现对 样品的分离，纯化和富集。主要 目的在于降低样品基质干扰，提 高检测灵敏度
平衡
上样
淋洗
洗脱
基质 杂质 目标化合物
常见的固相萃取柱
➢普通C18固相萃取 •固相萃取材料耐受PH范围窄（2-7.5） •硅胶键合吸附剂的表面存在未键合的硅羟基，对碱性化合 物的保留较强，用硅胶键合吸附剂处理碱性化合物，回收率 通常较低 •对极性化合物保留差
➢HLB(Hydrophilic-lipophilic Balance Copolymer) •PH1-14范围内稳定 •无裸露的硅醇羟基 •亲水物质和亲脂物质具有均衡的保留能力，覆盖了非极性、 弱极性、极性化合物
Oasis HLB柱（聚合物基质）
离子交换与反相模式 混合的固相萃取
离子交换 反相作用
•强阳离子和反相双重保留基质 •常用于提取净化生物基质中的 弱碱性化合物 •酸性环境中含氮碱性基团与磺 酸基结合 •酸性药物呈分子状态发生反相 结合作用
离子交换与反相模式 混合的固相萃取
固相萃取法方法总结
SPE优点：
➢将微量药物 从复杂介质中 纯化、富集起 来
➢防止分析仪 器的污染，提 高测定灵敏度 和选择性
生物样品常用的处理方法
主要考虑生物样品的种类、被测药物的性质和测定方 法三个方面的问题：
一
二
三
沉淀蛋白 (PPT)
液液萃取 (LLE)
固相萃取 (SPE)
沉淀蛋白
通过沉淀蛋白质可以使结合的药物释放出来，达到对待测组分的 提纯和纯化
奥氮平
有机溶剂沉淀法
经验总结
➢血浆或血清与有机溶剂的体积比为1:1~3，就可以将90%以上的蛋白质 除去，采用低温低速3500r/min离心10min便可将析出的蛋白质完全沉淀。
优点
➢操作简单，快速，精密度好，为方法开发中优先考虑使用的，特别在 LC-MS方法中 ➢几乎使用于所有小分子化合物，无论其极性大小 ➢化合物回收率接近100%，几乎所有小分子化合物都被提取，尤其适用 于代谢产物鉴定
基质效应及其影响
基质效应（martix effect）：
➢定义：样品测试过程中，由于待测物以外的的其它 物质存在，直接或间接影响待测物相应的现象 ➢如测定血液中的红霉素浓度为例，除了红霉素之外 的蛋白、磷脂、及其它内源性物质为基质 ➢共流成分会改变待测化合物的离子化效率，引起对 待测化合物监测信号的抑制或提高
生物样品种类
均匀生物样品
血液（全血、血浆、血清） 尿液、唾液、胆汁、乳汁、 脑脊液、淋巴液、汗液等
非均匀生物样品
心、肝、肾、脾、肺、脑、 胃、肠、子宫、肌肉、皮 肤等组织、器官
全血
全血
➢全血包括液体成分的血浆和分 散悬浮于其中的血细胞 ➢全血不易保存，且血细胞中含 有很多干扰物质，影响测定， 故较少用全血测定药物浓度。 ➢仅用于血浆药物浓度太低或者 血浆药物浓度波动较大，且难 以控制的药物，如环抱霉素A。
有机溶剂 沉淀法
加入中 性盐
有机酸
加入锌盐 或铜盐沉
淀剂
酶解法
有机溶剂沉淀法
原理
➢加入水溶性有机溶剂，可使蛋白质的分子内及分子间的氢键发生变化
常用有机溶剂种类
•乙腈、甲醇、丙酮、乙醇、四氢呋喃等
操作实例
50μl 血浆+150μl甲醇 取上清液进样分析
涡旋1min
3500rpm离心10min
有机溶剂沉淀法实例
生物样品前处理
制作人：叶超
目录
1 生物样品种类 2 生物样品储存 3 生物样品预处理 4 克服基质效应方法
Distribution Metabolism
Absorption Excretion
生物样品中药物的分析测定是定量描述药物体内过程、 获得药代参数的重要手段之一
体内生物样品分析特点
体内生物样 品分析特点
固相萃取 (SPE)
液-液提取方法（LLE）
原理 ➢药物在体内吸收，需经跨膜转运，所 以多数药物具有一定脂溶性 ➢生物样品中大多数内源性杂质是强极 性的水溶性物质
可以根据药物分子与基质之间的极性差异，使用适 当的有机溶剂提取药物，可一次性除去大部分杂质
LLE方法需是考虑的问题
一、溶剂的选择原则
常用液-液萃取溶剂
固相萃取分离类型
反相固相萃取
➢硅胶上键合C18，C8，C2，苯基，腈基 ➢流动相极性大于固定相，适合分离中小极性的化合物的萃取 ➢疏水性相互作用
正相固相萃取
➢无键合硅胶、或硅胶上键合氰基、NH2、二醇基 ➢流动相极性小于固定相，适合于极性的化合物的萃取 ➢亲水性相互作用
离子交换萃取
➢硅胶基质的离子交换官能团，季胺，氨基、二氨基、苯磺酸基、羧基 ➢带有电荷的化合物靠静电吸引到带有电荷的吸附剂表面
血浆
血浆
➢将采取的血液置含有抗凝剂 （如肝素、EDTA)的试管中，混 合后，3000-4000r/min离心，分 离红细胞，上清液即为血浆。 ➢测定血中药物浓度通常是指测 定血浆或血清中的药物浓度，而 不是指含有血细胞的全血中 的 药物浓度。
血清
血清
➢血清是采血后不加任何抗凝剂， 于室温下静置15-30min，待其自 然凝结后，离心，分离出上清液。 ➢血清较血浆颜色更浅，较血浆 少了大部分纤维蛋白，更易进行 处理，且血浆及血清中的药物浓 度测定值通常是相同的。