腺病毒载体工艺平台说明
腺病毒载体操作手册中文版解析
腺病毒载体操作手册中文版解析腺病毒载体操作手册中文版AdEasyTM操作手册目录缩写英文全称中文全称Ad Adenovirus 腺病毒Ad5 Adenovirus serotype 5 血清5型腺病毒AdV Adenoviral Vector 腺病毒载体Amp Ampicillin 氨苄青霉素β-Gal β-Galactosidase β-半乳糖苷酶bp Base Pair 碱基对BSA Bovine Serum Albumin 小牛血清白蛋白cDNA Complementary DNA 互补DNAcccDNA Closed Circular Coiled DNA 闭环螺旋DNACPE Cytopathic Effect 细胞病理效应CsCl Cesium Chloride 氯化铯DMEM Dulbecco’s Modified Eagle Medium DMEM培养基DMSO Dimethyl Sulfoxide 二甲基亚砜DTT Dithiothreitol 二硫苏糖醇EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic Acid 乙二胺四乙酸EtBr Ethidium Bromide 溴化乙锭FBS Fetal Bovine Serum 胎牛血清Hr Hour 小时ITR Inverted Terminal Repeat 反向末端重复Kan Kanamycin 卡那霉素kb Kilobases 千碱基对KDa KiloDaltons 千道尔顿LB Luria-Bertani ( broth ) LB培养基MCS Multiple Cloning Site 多克隆位点Min Minute 分钟MOI Multiplicity of Infection (Virus/Cell ) 感染复数mRNA Messenger RNA 信使RNAMWCO MOIecular Weight Cut-offPAGE PolyAcrylamide Gel Electrophoresis 聚丙烯凝胶电泳PBS Phosphate Buffered Saline 磷酸盐缓冲液PFU Plaque Forming Unit 空斑形成单位pi Post Infection 感染后RCA Replication Competent Adenovirus 增殖性腺病毒RITR Right Inverted Terminal Repeat 右侧反向末端重复SDS Sodium Dodecyl Sulfate 十二烷基硫酸钠TBE Tris Borate/EDTA 三羟甲基氨基甲烷硼酸盐/乙二胺四乙酸TCID50 Tissue Culture Infectious Dose 50 50%组织培养感染剂量TCP Total Cellular Protein 细胞总蛋白TE Tris/EDTA TE溶液wt Wild Type 野生型X-Gal 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-D-Galactopyranoside 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷第一章简介当今基因输送技术的发展日趋复杂，一些治疗药物（生长激素、干扰素、抗病毒和抗癌复合物）和诊断性蛋白（单克隆抗体）的设计、发展与合成需要更高效的基因输送工具。
腺病毒中文操作手册
腺病毒中文操作手册腺病毒载体操作手册中文版腺病毒重组系统AdEasyTM操作手册目录第一章简介 1 第二章应用重组腺病毒的优点 2 第三章AdEasyTM 技术 3 3.1 技术概况 3 3.2 AdEasyTM系统中产生重组腺病毒的时程 3 第四章主要流程 4 4.1 将基因克隆入AdEasyTM转移载体 44.1.1 克隆的一般原则 4 4.1.2 构建重组AdEasyTM转移载体54.2 细菌内AdEasyTM重组子的产生54.2.1 共转化的一般原则 54.2.2 共转化方法 54.2.3 预期结果 5 4.3 AdEasyTM重组质粒的筛选和扩增 6 4.4 AdEasyTM重组子转染QBI-293A 细胞 64.4.1 细胞铺板 64.4.2 磷酸钙转化技术7 第五章常见技术85.1 QBI-293A细胞培养8 5.1.1 QBI-293A细胞的初始培养8 5.1.2 QBI-293A细胞的维持培养和增殖8 5.1.3 QBI-293A细胞的冻存8 5.2 QBI-293A细胞的转染和病毒空斑的产生9 5.2.1 感染QBI-293A细胞95.2.2 病毒空斑形成9 5.2.3 琼脂糖覆盖被感染细胞9 5.3 MOI测定10 5.4 腺病毒感染力测定105.4.1 X-Gal染色11 5.5 重组腺病毒的筛选和纯化11 5.5.1 挑选最佳重组腺病毒：表示和基因输送11 5.5.2 病毒空斑挑选和小量扩增125.5.3 Western杂交13 5.5.4 Southern杂交和点杂交13 5.5.5 病毒裂解产物PCR 145.5.6 免疫测定145.5.7 功能测定14 5.6 病毒颗粒在QBI-293A细胞中的大量扩增15 5.7 两次氯化铯密度梯度离心纯化重组腺病毒16 5.7.1 不连续密度梯度离心17 5.7.2 连续密度梯度离心17 5.7.3 病毒溶液去盐和浓集17 5.8 病毒滴度测定185.8.1 O.D.260 nm (VP/ml) 195.8.2 空斑测定法20 5.8.3 50%组织培养感染剂量法20 第六章疑难解答226.1 QBI-293A细胞培养22 6.2 感染力测定22 6.3 转移载体克隆23 6.4 在BJ5183细胞中共转化和重组246.5 转染QBI-293A细胞25 6.6 筛选和测定25 6.7 在QBI-293A细胞中表示26 6.8 重组腺病毒的扩增26 6.9 纯化26 6.10 病毒滴度测定 27缩写英文全称中文全称Ad Adenovirus 腺病毒Ad5 Adenovirus serotype 5 血清5型腺病毒AdV Adenoviral Vector 腺病毒载体Amp Ampicillin 氨苄青霉素β-Gal β-Galactosidase β-半乳糖苷酶bp Base Pair 碱基对BSA Bovine Serum Albumin 小牛血清白蛋白cDNA Complementary DNA 互补DNA cccDNA Closed Circular Coiled DNA 闭环螺旋DNA CPE Cytopathic Effect 细胞病理效应CsCl Cesium Chloride 氯化铯DMEM Dulbecco’s Modified Eagle Medium DMEM培养基DMSO Dimethyl Sulfoxide 二甲基亚砜DTT Dithiothreitol 二硫苏糖醇EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic Acid 乙二胺四乙酸EtBr Ethidium Bromide 溴化乙锭FBS Fetal Bovine Serum 胎牛血清Hr Hour 小时ITR Inverted Terminal Repeat 反向末端重复Kan Kanamycin 卡那霉素kb Kilobases 千碱基对KDa KiloDaltons 千道尔顿LB Luria-Bertani ( broth ) LB培养基MCS Multiple Cloning Site 多克隆位点Min Minute 分钟MOI Multiplicity of Infection (Virus/Cell ) 感染复数mRNA Messenger RNA 信使RNA MWCO MOIecular Weight Cut-off PAGE PolyAcrylamide Gel Electrophoresis 聚丙烯凝胶电泳PBS Phosphate Buffered Saline 磷酸盐缓冲液PFU Plaque Forming Unit 空斑形成单位pi Post Infection 感染后RCA Replication Competent Adenovirus 增殖性腺病毒RITR Right Inverted Terminal Repeat 右侧反向末端重复SDS Sodium Dodecyl Sulfate 十二烷基硫酸钠TBE Tris Borate/EDTA 三羟甲基氨基甲烷硼酸盐/乙二胺四乙酸TCID50 Tissue Culture Infectious Dose50 50%组织培养感染剂量TCP Total Cellular Protein 细胞总蛋白TE Tris/EDTA TE溶液wt Wild Type 野生型X-Gal 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-D-Galactopyranoside 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷第一章简介当今基因输送技术的发展日趋复杂，一些治疗药物（生长激素、干扰素、抗病毒和抗癌复合物）和诊断性蛋白（单克隆抗体）的设计、发展与合成需要更高效的基因输送工具。
pAAV-hSyn-RFP腺病毒载体说明(图)
pAAV-‐hSyn-‐RFP编号 载体名称 北京华越洋VECT10040 pAAV-‐hSyn-‐RFPpAAV-‐hSyn-‐RFP载体基本信息：载体名称: pAAV-‐hSyn-‐RFP质粒类型: 腺病毒载体；荧光报告载体高拷贝/低拷贝: 高拷贝克隆方法: 限制性内切酶，多克隆位点启动子: human S ynapsin 1载体大小: 5909 b p5' 测序引物及序列: -‐-‐3' 测序引物及序列: SP6 5'ATTTAGGTGACACTATAG 3'载体标签: -‐-‐载体抗性: 氨苄青霉素筛选标记: 红色荧光蛋白DsRedExpress克隆菌株: Stbl3 或 NEB S tble宿主细胞（系）: 神经细胞备注: pAAV-‐hSyn-‐RFP载体含有human s ynapsin 1 启动子，适合在神经细胞中表达。
稳定性: 稳表达组成型/诱导型: 组成型病毒/非病毒: 腺病毒pAAV-‐hSyn-‐RFP载体质粒图谱和多克隆位点信息：pAAV-‐hSyn-‐RFP载体序列：ORIGIN1 G TGGATAACC G TATTACCGC C TTTGAGTGA G CTGATACCG C TCGCCGCAG C CGAACGACC61 G AGCGCAGCG A GTCAGTGAG C GAGCGAGCG C GCAGAGAGG G AGTGGCCAA C TCCATCACT 121 A GGGGTTCCT T GTAGTTAAT G ATTAACCCG C CATGCTACT T ATCTACGTA G CCATGCTCT181 A GAGGATCCT T CGAAAAGCT T CTGCAGAGG G CCCTGCGTA T GAGTGCAAG T GGGTTTTAG 241 G ACCAGGATG A GGCGGGGTG G GGGTGCCTA C CTGACGACC G ACCCCGACC C ACTGGACAA 301 G CACCCAACC C CCATTCCCC A AATTGCGCA T CCCCTATCA G AGAGGGGGA G GGGAAACAG 361 G ATGCGGCGA G GCGCGTGCG C ACTGCCAGC T TCAGCACCG C GGACAGTGC C TTCGCCCCC 421 G CCTGGCGGC G CGCGCCACC G CCGCCTCAG C ACTGAAGGC G CGCTGACGT C ACTCGCCGG 481 T CCCCCGCAA A CTCCCCTTC C CGGCCACCT T GGTCGCGTC C GCGCCGCCG C CGGCCCAGC541 C GGACCGCAC C ACGCGAGGC G CGAGATAGG G GGGCACGGG C GCGACCATC T GCGCTGCGG 601 C GCCGGCGAC T CAGCGCTGC C TCAGTCTGC G GTGGGCAGC G GAGGAGTCG T GTCGTGCCT 661 G AGAGCGCAG T CGAGGCGCG C CGAGCTCGG A TCCTGAGAA C TTCAGGGTG A GTCTATGGG 721 A CCCTTGATG T TTTCTTTCC C CTTCTTTTC T ATGGTTAAG T TCATGTCAT A GGAAGGGGA781 G AAGTAACAG G GTACACATA T TGACCAAAT C AGGGTAATT T TGCATTTGT A ATTTTAAAA841 A ATGCTTTCT T CTTTTAATA T ACTTTTTTG T TTATCTTAT T TCTAATACT T TCCCTAATC901 T CTTTCTTTC A GGGCAATAA T GATACAATG T ATCATGCCT C TTTGCACCA T TCTAAAGAA961 T AACAGTGAT A ATTTCTGGG T TAAGGCAAT A GCAATATTT C TGCATATAA A TATTTCTGC1021 A TATAAATTG T AACTGATGT A AGAGGTTTC A TATTGCTAA T AGCAGCTAC A ATCCAGCTA1081 C CATTCTGCT T TTATTTTAT G GTTGGGATA A GGCTGGATT A TTCTGAGTC C AAGCTAGGC1141 C CTTTTGCTA A TCATGTTCA T ACCTCTTAT C TTCCTCCCA C AGCTCCTGG G CAACGTGCT1201 G GTCTGTGTG C TGGCCCATC A CTTTGGCAA A GCACGTGAA T TCGAAGATC T GGCCGCCTC1261 G GCCTCTAGA A CTAGTGGAT C CCCCGGGCT G CAGGAATTC G ATGCTACCG G TCGCCACCA1321 T GGCCTCCTC C GAGGACGTC A TCAAGGAGT T CATGCGCTT C AAGGTGCGC A TGGAGGGCT 1381 C CGTGAACGG C CACGAGTTC G AGATCGAGG G CGAGGGCGA G GGCCGCCCC T ACGAGGGCA 1441 C CCAGACCGC C AAGCTGAAG G TGACCAAGG G CGGCCCCCT G CCCTTCGCC T GGGACATCC 1501 T GTCCCCCCA G TTCCAGTAC G GCTCCAAGG T GTACGTGAA G CACCCCGCC G ACATCCCCG1561 A CTACAAGAA G CTGTCCTTC C CCGAGGGCT T CAAGTGGGA G CGCGTGATG A ACTTCGAGG 1621 A CGGCGGCGT G GTGACCGTG A CCCAGGACT C CTCCCTGCA G GACGGCTCC T TCATCTACA1681 A GGTGAAGTT C ATCGGCGTG A ACTTCCCCT C CGACGGCCC C GTAATGCAG A AGAAGACTA 1741 T GGGCTGGGA G GCCTCCACC G AGCGCCTGT A CCCCCGCGA C GGCGTGCTG A AGGGCGAGA 1801 T CCACAAGGC C CTGAAGCTG A AGGACGGCG G CCACTACCT G GTGGAGTTC A AGTCCATCT 1861 A CATGGCCAA G AAGCCCGTG C AGCTGCCCG G CTACTACTA C GTGGACTCC A AGCTGGACA 1921 T CACCTCCCA C AACGAGGAC T ACACCATCG T GGAGCAGTA C GAGCGCGCC G AGGGCCGCC 1981 A CCACCTGTT C CTGTAGCGG C CAAATGAAT T CCCAAACCG T ACGGGAAAC G GCCCTATTC2041 T ATAGTGTCA C CTAAATGCT A GAGCTCGCT G ATCAGCCTC G ACTGTGCCT T CTAGTTGCC2101 A GCCATCTGT T GTTTGCCCC T CCCCCGTGC C TTCCTTGAC C CTGGAAGGT G CCACTCCCA2161 C TGTCCTTTC C TAATAAAAT G AGGAAATTG C ATCGCATTG T CTGAGTAGG T GTCATTCTA2221 T TCTGGGGGG T GGGGTGGGG C AGGACAGCA A GGGGGAGGA T TGGGAAGAC A ATAGCGCGG 2281 C CGCTCTAGA G CATGGCTAC G TAGATAAGT A GCATGGCGG G TTAATCATT A ACTACAAGG 2341 A ACCCCTAGT G ATGGAGTTG G CCACTCCCT C TCTGCGCGC T CGCTCGCTC A CTGAGGCCG2401 G GCGACCAAA G GTCGCCCGA C GCCCGGGCT T TGCCCGGGC G GCCTCAGTG A GCGAGCGAG 2461 C GCGCAGCTG G CGTAATAGC G AAGAGGCCC G CACCGATCG C CCTTCCCAA C AGTTGCGCA2521 G CCTGAATGG C GAATGGCGA T TCCGTTGCA A TGGCTGGCG G TAATATTGT T CTGGATATT 2581 A CCAGCAAGG C CGATAGTTT G AGTTCTTCT A CTCAGGCAA G TGATGTTAT T ACTAATCAA 2641 A GAAGTATTG C GACAACGGT T AATTTGCGT G ATGGACAGA C TCTTTTACT C GGTGGCCTC 2701 A CTGATTATA A AAACACTTC T CAGGATTCT G GCGTACCGT T CCTGTCTAA A ATCCCTTTA2761 A TCGGCCTCC T GTTTAGCTC C CGCTCTGAT T CTAACGAGG A AAGCACGTT A TACGTGCTC 2821 G TCAAAGCAA C CATAGTACG C GCCCTGTAG C GGCGCATTA A GCGCGGCGG G TGTGGTGGT 2881 T ACGCGCAGC G TGACCGCTA C ACTTGCCAG C GCCCTAGCG C CCGCTCCTT T CGCTTTCTT2941 C CCTTCCTTT C TCGCCACGT T CGCCGGCTT T CCCCGTCAA G CTCTAAATC G GGGGCTCCC3001 T TTAGGGTTC C GATTTAGTG C TTTACGGCA C CTCGACCCC A AAAAACTTG A TTAGGGTGA 3061 T GGTTCACGT A GTGGGCCAT C GCCCTGATA G ACGGTTTTT C GCCCTTTGA C GTTGGAGTC 3121 C ACGTTCTTT A ATAGTGGAC T CTTGTTCCA A ACTGGAACA A CACTCAACC C TATCTCGGT3181 C TATTCTTTT G ATTTATAAG G GATTTTGCC G ATTTCGGCC T ATTGGTTAA A AAATGAGCT3241 G ATTTAACAA A AATTTAACG C GAATTTTAA C AAAATATTA A CGCTTACAA T TTAAATATT3301 T GCTTATACA A TCTTCCTGT T TTTGGGGCT T TTCTGATTA T CAACCGGGG T ACATATGAT3361 T GACATGCTA G TTTTACGAT T ACCGTTCAT C GATTCTCTT G TTTGCTCCA G ACTCTCAGG3421 C AATGACCTG A TAGCCTTTG T AGAGACCTC T CAAAAATAG C TACCCTCTC C GGCATGAAT 3481 T TATCAGCTA G AACGGTTGA A TATCATATT G ATGGTGATT T GACTGTCTC C GGCCTTTCT3541 C ACCCGTTTG A ATCTTTACC T ACACATTAC T CAGGCATTG C ATTTAAAAT A TATGAGGGT3601 T CTAAAAATT T TTATCCTTG C GTTGAAATA A AGGCTTCTC C CGCAAAAGT A TTACAGGGT 3661 C ATAATGTTT T TGGTACAAC C GATTTAGCT T TATGCTCTG A GGCTTTATT G CTTAATTTT3721 G CTAATTCTT T GCCTTGCCT G TATGATTTA T TGGATGTTG G AATCGCCTG A TGCGGTATT3781 T TCTCCTTAC G CATCTGTGC G GTATTTCAC A CCGCATATG G TGCACTCTC A GTACAATCT3841 G CTCTGATGC C GCATAGTTA A GCCAGCCCC G ACACCCGCC A ACACCCGCT G ACGCGCCCT 3901 G ACGGGCTTG T CTGCTCCCG G CATCCGCTT A CAGACAAGC T GTGACCGTC T ccgggagct3961 g catgtgtca g aggttttca c cgtcatcac c gaaacgcgc g agACGAAAG G GCCTCGTGA4021 T ACGCCTATT T TTATAGGTT A ATGTCATGA T AATAATGGT T TCTTAGACG T CAGGTGGCA 4081 C TTTTCGGGG A AATGTGCGC G GAACCCCTA T TTGTTTATT T TTCTAAATA C ATTCAAATA4141 T GTATCCGCT C ATGAGACAA T AACCCTGAT A AATGCTTCA A TAATATTGA A AAAGGAAGA 4201 G TATGAGTAT T CAACATTTC C GTGTCGCCC T TATTCCCTT T TTTGCGGCA T TTTGCCTTC4261 C TGTTTTTGC T CACCCAGAA A CGCTGGTGA A AGTAAAAGA T GCTGAAGAT C AGTTGGGTG 4321 C ACGAGTGGG T TACATCGAA C TGGATCTCA A CAGCGGTAA G ATCCTTGAG A GTTTTCGCC 4381 C CGAAGAACG T TTTCCAATG A TGAGCACTT T TAAAGTTCT G CTATGTGGC G CGGTATTAT 4441 C CCGTATTGA C GCCGGGCAA G AGCAACTCG G TCGCCGCAT A CACTATTCT C AGAATGACT 4501 T GGTTGAGTA C TCACCAGTC A CAGAAAAGC A TCTTACGGA T GGCATGACA G TAAGAGAAT 4561 T ATGCAGTGC T GCCATAACC A TGAGTGATA A CACTGCGGC C AACTTACTT C TGACAACGA 4621 T CGGAGGACC G AAGGAGCTA A CCGCTTTTT T GCACAACAT G GGGGATCAT G TAACTCGCC 4681 T TGATCGTTG G GAACCGGAG C TGAATGAAG C CATACCAAA C GACGAGCGT G ACACCACGA 4741 T GCCTGTAGC A ATGGCAACA A CGTTGCGCA A ACTATTAAC T GGCGAACTA C TTACTCTAG 4801 C TTCCCGGCA A CAATTAATA G ACTGGATGG A GGCGGATAA A GTTGCAGGA C CACTTCTGC 4861 G CTCGGCCCT T CCGGCTGGC T GGTTTATTG C TGATAAATC T GGAGCCGGT G AGCGTGGGT 4921 C TCGCGGTAT C ATTGCAGCA C TGGGGCCAG A TGGTAAGCC C TCCCGTATC G TAGTTATCT 4981 A CACGACGGG G AGTCAGGCA A CTATGGATG A ACGAAATAG A CAGATCGCT G AGATAGGTG 5041 C CTCACTGAT T AAGCATTGG T AACTGTCAG A CCAAGTTTA C TCATATATA C TTTAGATTG5101 A TTTAAAACT T CATTTTTAA T TTAAAAGGA T CTAGGTGAA G ATCCTTTTT G ATAATCTCA5161 T GACCAAAAT C CCTTAACGT G AGTTTTCGT T CCACTGAGC G TCAGACCCC G TAGAAAAGA 5221 T CAAAGGATC T TCTTGAGAT C CTTTTTTTC T GCGCGTAAT C TGCTGCTTG C AAACAAAAA5281 A ACCACCGCT A CCAGCGGTG G TTTGTTTGC C GGATCAAGA G CTACCAACT C TTTTTCCGA5341 A GGTAACTGG C TTCAGCAGA G CGCAGATAC C AAATACTGT T CTTCTAGTG T AGCCGTAGT 5401 T AGGCCACCA C TTCAAGAAC T CTGTAGCAC C GCCTACATA C CTCGCTCTG C TAATCCTGT5461 T ACCAGTGGC T GCTGCCAGT G GCGATAAGT C GTGTCTTAC C GGGTTGGAC T CAAGACGAT 5521 A GTTACCGGA T AAGGCGCAG C GGTCGGGCT G AACGGGGGG T TCGTGCACA C AGCCCAGCT 5581 T GGAGCGAAC G ACCTACACC G AACTGAGAT A CCTACAGCG T GAGCTATGA G AAAGCGCCA 5641 C GCTTCCCGA A GGGAGAAAG G CGGACAGGT A TCCGGTAAG C GGCAGGGTC G GAACAGGAG 5701 A GCGCACGAG G GAGCTTCCA G GGGGAAACG C CTGGTATCT T TATAGTCCT G TCGGGTTTC 5761 G CCACCTCTG A CTTGAGCGT C GATTTTTGT G ATGCTCGTC A GGGGGGCGG A GCCTATGGA 5821 A AAACGCCAG C AACGCGGCC T TTTTACGGT T CCTGGCCTT T TGCTGGCCT T TTGCTCACA5881 T GTTCTTTCC T GCGTTATCC C CTGATTCT//pAAV-‐hSyn-‐RFP其他腺病毒表达载体：pNTAP-‐Shuttle-‐B pAAV-‐CAG-‐RFPpAAV-‐CaMKIIa-‐EGFP pCTAP-‐Shuttle-‐ApAAV-‐CMV-‐Rluc pNTAP-‐Shuttle-‐ApAAV-‐CAG-‐GFP pBHGloxdelE13cre pCTAP-‐Shuttle-‐C pDC511pDC515 pDC312pAdTrack-‐CMV pAAV-‐IRES-‐hrGFP pShuttle-‐IRES-‐hrGFP-‐1 pShuttle-‐CMV-‐EGFP-‐C pacAd5 9.2-‐100 pacAd5 C MV-‐GFPpAAV-‐Syn-‐Rluc pCMV-‐MCSpShuttle-‐IRES-‐hrGFP-‐2 pShuttle-‐CMVpAAV-‐Syn-‐Rluc pAAV-‐hSyn-‐RFPpAAV-‐CMV-‐iRFP pAAV-‐UbCpDC415 pAAV-‐CAG-‐FlucpAAV-‐LacZ pNTAP-‐Shuttle-‐BpDC316 pDC516pAAV-‐CA pDC416pNTAP-‐Shuttle-‐C pDC311pDC512 pAAV-‐hrGFPpDC411 pAAV-‐RCpAdTrack pacAd5 C MVK-‐NpA pAdEasy-‐1 pDC315pAAV-‐MCS pShuttlepHelper pBApo-‐CMV-‐neo pShuttle-‐CMV-‐lacZ pBApo-‐CMVpAAV-‐TRE-‐Syn-‐Fluc pBApo-‐CMV-‐PurpAAV-‐minCMV-‐mCherry。
吉玛重组腺病毒操作手册说明书
如有疑问欢迎垂询上海电话：************-8009苏州电话：*************-8042E-mail：************************** E-mail：************************吉玛重组腺病毒操作手册GenePharma Recombinant Adenovirus Operation Manual2017 年 6 月如有疑问欢迎垂询上海电话：************-8009苏州电话：*************-8042E-mail：**************************E-mail：************************目录一、产品简介 (4)二、腺病毒载体优势 (4)三、生物安全性 (5)3.1安全性 (5)3.2实验室安全措施 (5)四、流程描述 (6)五、材料与仪器 (7)5.1实验材料 (7)5.1.1细胞株 (7)5.1.2质粒 (7)5.1.3试剂 (8)5.2实验耗材及仪器 (8)5.2.1耗材 (8)5.2.2仪器 (9)六、具体步骤 (9)6.1细胞培养 (9)6.1.1活细胞计数 (9)6.1.2细胞株的冻存 (9)6.1.3细胞复苏 (10)6.1.4细胞传代 (10)6.2病毒包装 (10)6.3病毒收集 (11)6.4病毒扩增 (12)6.5病毒纯化 (12)6.6病毒重悬和保存 (13)6.7病毒滴度检测 (13)七、使用方法 (14)如有疑问欢迎垂询上海电话：************-8009苏州电话：*************-8042E-mail：************************** E-mail：************************重组腺病毒在细胞水平使用 (14)7.1病毒滴度复核（有限稀释法测定） (14)7.2靶细胞感染预实验 (16)7.3正式试验 (18)八、运输和储存 (18)九、常见问题及解决方案 (19)十、吉玛案例 (20)十一、附录 (21)如有疑问欢迎垂询上海电话：************-8009苏州电话：*************-8042E-mail：************************** E-mail：************************一、产品简介腺病毒(Adenovirus，Adv)是一种线性双链DNA 病毒。
汉恒腺病毒载体操作手册
6
汉恒生物公司地址：上海市徐汇区斜土路
E-mail:service@
1175 号 15 楼
T实e验l：室02地1-址51：29上62海58市张江高科技园区蔡伦路 781 弄张江药谷 503
腺病毒载体操作手册
四、腺病毒包装、扩增和纯化
（一）腺病毒包装
5118bp
GFP
(NotI ) (NcoI ) (NcoI )
pUC ori
SV40 PolyA LoxP
HindIII
[ SacI SalI
Amp r pUC ori
SacII
XbaI(456)
ITR
ITR
1
(NdeI )
(NdeI )
NheI(1384)
pHB Ad-U6-RFP 4993bp
1
汉恒生物公司地址：上海市徐汇区斜土路
E-mail:service@
1175 号 15 楼
T实e验l：室02地1-址51：29上62海58市张江高科技园区蔡伦路 781 弄张江药谷 503
腺病毒载体操作手册
蛋白（GFP）。pHBAd-CMV-IRES-RFP 和 pHBAd-U6-RFP 能表达 红色荧光蛋白（RFP）。
3、将细胞溶液转移到 15ml 离心管中，并在其中加上 1ml 新鲜 的完全培养基，混匀后离心，1000rpm，5min。
pBHGloxdelE13cre腺病毒载体说明(图)
pBHGloxdelE13cre编号 载体名称 北京华越洋VECT10032 pBHGloxdelE13crepBHGloxdelE13cre载体基本信息：载体名称: pBHGloxdelE13cre质粒类型: 哺乳细胞表达；腺病毒载体高拷贝/低拷贝: -‐-‐启动子: CMV克隆方法: 多克隆位点，限制性内切酶载体大小: 34707bp5' 测序引物及序列: -‐-‐3' 测序引物及序列: -‐-‐载体标签: -‐-‐载体抗性: 氨苄青霉素(Ampicillin)筛选标记: -‐-‐备注: -‐-‐稳定性: -‐-‐组成型: -‐-‐病毒/非病毒: 腺病毒pBHGloxdelE13cre载体质粒图谱和多克隆位点信息pBHGloxdelE13cre其他腺病毒表达载体：pNTAP-‐Shuttle-‐B pAAV-‐CAG-‐RFP pAAV-‐CaMKIIa-‐EGFP pCTAP-‐Shuttle-‐A pAAV-‐CMV-‐Rluc pNTAP-‐Shuttle-‐A pAAV-‐CAG-‐GFP pBHGloxdelE13cre pCTAP-‐Shuttle-‐C pDC511pDC515 pDC312pAdTrack-‐CMV pAAV-‐IRES-‐hrGFP pShuttle-‐IRES-‐hrGFP-‐1 pShuttle-‐CMV-‐EGFP-‐C pacAd5 9.2-‐100 pacAd5 C MV-‐GFP pAAV-‐Syn-‐Rluc pCMV-‐MCS pShuttle-‐IRES-‐hrGFP-‐2 pShuttle-‐CMV pAAV-‐Syn-‐Rluc pAAV-‐hSyn-‐RFP pAAV-‐CMV-‐iRFP pAAV-‐UbCpDC415 pAAV-‐CAG-‐Fluc pAAV-‐LacZ pNTAP-‐Shuttle-‐B pDC316 pDC516pAAV-‐CA pDC416pNTAP-‐Shuttle-‐C pDC311pDC512 pAAV-‐hrGFPpDC411 pAAV-‐RC pAdTrack pacAd5 C MVK-‐NpA pAdEasy-‐1 pDC315pAAV-‐MCS pShuttlepHelper pBApo-‐CMV-‐neo pShuttle-‐CMV-‐lacZ pBApo-‐CMVpAAV-‐TRE-‐Syn-‐Fluc pBApo-‐CMV-‐Pur pAAV-‐minCMV-‐mCherry。
腺病毒包装操作手册
汉恒重组腺病毒操作手册目录腺病毒安全使用和注意事项腺病毒储存与稀释的注意事项一、整体实验流程二、实验材料三、腺病毒包装和浓缩四、重组腺病毒滴度（PFU）的测定五、重组腺病毒感染目的细胞六、重组腺病毒用于动物实验附1：汉恒生物腺病毒载体附2：腺病毒感染细胞最佳MOI的摸索（表达荧光的病毒） 附3：汉恒生物常见三种病毒感染目的细胞比较腺病毒安全使用和注意事项➢腺病毒安全使用注意事项（*非常重要*）1) 腺病毒相关实验请在生物安全柜（BL-2级别）内操作。
2) 操作病毒时请穿实验服，佩戴口罩和手套，尽量不要裸露双手及手臂的皮肤。
3) 操作病毒时需要特别小心病毒溅出。
如果操作时超净工作台有病毒污染，请立即用70%乙醇加 1%的SDS溶液擦拭干净。
4) 接触过病毒的枪头、离心管、培养板及培养瓶请用84消毒液浸泡后统一处理。
5) 如实验过程中需要离心，应使用密封性好的离心管，必要时请用封口膜封口后离心。
6) 病毒相关的废弃物需要特殊收集，统一经高温灭菌后处理。
7) 实验完毕后请用香皂清洗双手。
➢腺病毒储存与稀释的注意事项1）腺病毒的储存收到病毒液后若在短期内使用，可将病毒放置于 4℃保存（一周内使用完最佳）；如需长期保存请分装后放置于 -80 ℃ 。
注：a.反复冻融会降低病毒滴度（每次冻融会使病毒滴度降低10%~50%），因此在病毒使用过程中尽量避免反复冻融。
汉恒生物对病毒已进行分装（200 μl/tube），收到后请直接放置-80℃冰箱保存即可。
b.若病毒储存时间超过6个月，汉恒生物建议在使用前重新测定病毒滴度（参见附表2-慢病毒滴度测定方法）。
2）腺病毒的稀释需要稀释病毒时，请将病毒取出置于冰浴融解后，使用PBS或培养目的细胞用的无血清培养基(含血清或含双抗不影响病毒感染)混匀分装后置于 4℃保存(一周内使用完最佳)。
重组腺病毒是一种复制缺陷的腺病毒载体系统，在基因治疗、基础生命科学研究等领域被广泛应用。
腺病毒载体工艺平台介绍
腺病毒载体工艺平台介绍腺病毒载体是一种常用的基因传递工具，被广泛应用于基因治疗和基因工程研究领域。
为了应对不同研究需求和提高载体表达效率，许多研究人员和企业建立了腺病毒载体工艺平台，以帮助加速基因传递和基因治疗的研究进展。
腺病毒载体工艺平台是一种综合的研究和生产系统，主要包括以下几个方面：1. 载体构建：利用分子生物学技术，将感兴趣的基因序列插入腺病毒基因组的合适位点。
在载体构建过程中，可以根据需要选择不同的载体类型、启动子、响应元件等，以调控基因的表达水平和时机。
2. 载体包装：通过与辅助质粒（helper plasmid）共转染细胞，使细胞内形成完整的腺病毒基因组，并通过细胞内重组事件来复制和包装腺病毒颗粒。
载体包装的过程中，通常需要参考文献中的方法和优化步骤，以获得高效的包装效率。
3. 病毒扩增：将包装好的腺病毒载体接种到适宜的宿主细胞中，通过培养和扩增过程，使腺病毒繁殖并增加至足够的浓度。
扩增过程中要注意控制细胞的生长状态、感染剂量和细胞培养条件，以获得高产量和活性的腺病毒。
4. 病毒纯化：通过离心、超滤和柱层析等技术手段，从扩增培养物中纯化腺病毒颗粒。
纯化过程中，可以采用单步或多步骤的方法来去除杂质、浓缩和提纯腺病毒。
5. 固定化：对腺病毒进行固定化处理，可用于获得更稳定、可储存和长期使用的腺病毒制剂。
常用的固定化方法包括酶解固定化、化学固定化、冻干固定化等。
6. 质量检测：对纯化的腺病毒产品进行质量鉴定，包括病毒滴度测定、细胞感染测定、基因表达水平测定等。
同时，还可以进行病毒颗粒观察、基因序列测定、重组蛋白表达等验证实验。
腺病毒载体工艺平台的建立有助于提高基因治疗和基因工程研究的效率和可靠性。
通过系统、规范和高效的工艺流程，可以大幅度减少研究人员在载体构建、病毒包装和纯化等环节上的工作量，同时提高腺病毒的产量和纯度。
这为基因治疗的临床应用以及基因工程研究提供了可靠的技术支持。
腺病毒载体工艺平台是基因治疗和基因工程研究中不可或缺的一部分。
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药学研究主要内容
• 上游构建及鉴定 • 细胞/毒种研究及三级库建立 • 原液工艺研究 • 制剂工艺研究 • 检测方法及质量标准研究 • 稳定性研究 • 试制三批样品
细胞及毒种研究
• 细胞检定、传代稳定性研究 • 毒种检定、代次及遗传稳定性研究
建细胞库
原始细胞
700
600
500
400
300
200
100
0 0.0
10.0
20.0
30.0
40.0
50.0
min
制剂工艺成品配制除菌 分装
轧盖 灯检 贴签 包装、贮存
病毒保存 液
胶塞灭菌 铝盖清洗、烘干
检测
制剂处方筛选结果
滴度（IU/ml）
不同处方贮存情况比较图
4.50E+09 4.00E+09 3.50E+09 3.00E+09 2.50E+09 2.00E+09 1.50E+09 1.00E+09 5.00E+08 0.00E+00
残留量 牛血清白蛋白残留量
RCA
AAV检测 293细胞蛋白残留量
无菌试验 （含支原体） 细菌内毒素 小鼠异常毒性试验
源兴基因药物研发中心
腺病毒载体工艺平台介绍
研发中心厂房及设备
源兴基因药物研发中心建筑面积1900多平方 米，其中符合国家GMP要求的洁净厂房面积1600 多平方米，包括原液生产车间、制剂生产车间、 质量控制实验室以及研发实验室。
研发中心配置了NBS细胞罐、AKTA纯化系统、 高速冷冻离心机、切向流超滤系统、二氧化碳培 养箱、生物安全柜、分析型HPLC系统、PCR仪、 电泳仪、酶标仪、超声波破碎仪、超声波西林瓶 清洗机、隧道式灭菌烘箱、液体灌装加塞机、轧 盖机、凝胶扫描成像系统、超纯水仪、多效蒸馏 水机等仪器设备。
B0706日糖耗(g) B0804日糖耗(g)
细胞罐产毒浓度曲线
罐内病毒VP浓度(HPLC峰面积)
图4 EGFR三罐病毒培养期VP浓度曲线
700000
600000
500000
400000 300000
200000
100000 0
0 4 6 30 48 72 96 120 144
1
2
3
4
5
6
7
8
9
病毒培养时间(小时)
B0803日收获病毒vp(e14)
纯化工艺
罐病毒收获液 离心
超滤浓缩 酶切
离子交换层析 分子筛层析 原液
纯化图谱
mAU 800
Manual run 1:1_UV1_280nm
Manual run 1:1_UV2_260nm
Manual run 1:1_Cond
Manual run 1:1_Conc
B0704病毒培养期VP浓度(HPLC峰面积) B0804日收获病毒VP(HPLC峰面积)
B0803日收获病毒vp(HPLC峰面积) 感染时间(小时)
细胞罐病毒收获曲线
日收获病毒VP(e14)
图3 EGFR三罐实验日糖耗&日收获病毒比较
8
7
6
5
4 3
2
1
0
1
2
3
4
5
6
病毒培养时间(天)
B0704日收获病毒VP(e14) B0804日收获病毒VP(e14)
能够满足腺病毒载体药物研发、生产和质量 控制的要求。
研发中心生产系统组织图
总经理
生产总监
工艺开发部 （10人）
质控部 （5人）
设备工程部 （4人）
细胞病毒培养
纯化
制剂分装
清洁辅助
物控部 （3人）
研发队伍
• 打造了一支技术过硬的研发队伍，能 够保证工艺水平及产品质量稳定。
• 历经多次新药申报，比较熟悉新药审 评程序和规定，积累了较丰富的申报 经验，能够比较顺利的解决有关问题。
细胞扩增
主细胞库
细胞扩增
工作细胞库
细胞来源于ATCC
质量控制 质量控制
建毒种库
原始种子批
病毒扩增
主种子批
病毒扩增
工作种子批
鉴定检 测
质量控 制
质量控 制
原液工艺流程、参数及技术指标
细胞种子
重组腺病 毒种子
细胞罐扩增
5L罐细胞培养，病毒扩增： DO60%,37℃,pH7.2, 耗糖40g/d接种病毒，MOI为20
0 123 456 78
贮存时间（周）
处方1 处方2 处方3 处方4
从以上结果可以看出，处方Ⅰ为最优，处方Ⅱ次之，处方 Ⅲ最差，处方Ⅳ较差。于是将处方确定为处方Ⅰ。
质量标准及检测方法
检测项目 外观
（含可见异物） pH 值 装量
鉴别试验
病毒颗粒数
比滴度 （IU/ Vp） HPLC纯度 小鼠效力试验 293细胞DNA
罐细胞染毒
毒种制备
罐病毒培养
纯化
细胞罐葡萄糖消耗监控曲线图
日糖耗(g)
图2 六罐实验日糖耗曲线 70
60 50
40
30
20 10
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
培养天数(天)
B0704日糖耗(g) B0802日糖耗(g)
B0705日糖耗(g) B0803日糖耗(g)
罐 收获物
6000RPM离 心20min 500K膜超滤浓缩10倍
超滤浓缩液 SOURCE 30Q 阴离子交换柱层析
层析收集液 Sepharose 6 Fast Flow 分子筛层析
原液
H30产量
（3批平均）
460ml 1.1×1015 VP
回收率
（3批平均）
53%
细胞罐工艺
细胞复苏培养
罐细胞培养
管理制度
• 建立了300多个SOP、SMP等标准程 序和规章管理制度，按照GMP要求 严格规范管理。
研发中心工艺平台
• 研发中心工艺产业化平台是通用型腺病毒载体药 物生产工艺和质量标准研究的药学技术平台，中 试生产工艺水平达到了国内同行业先进水平，可 以在产量及质量上满足腺病毒载体药物临床前和 临床用样品制备的要求。
品种
治疗性重组 HBV腺病毒疫 苗
代号
CHB3
研究单位
源兴
治疗性HIV腺病 H30
毒载体疫苗
源兴
研究时间
2004年3月至 2005年11月
2005年12月 至2007年8月
治疗性重组腺 病毒EB病毒潜 伏膜抗原疫苗
LMP2
CDC病毒病所委托 源兴承担药学研究
2007年9月至 2008年10月
新药申报三方面研究内容
• 本工艺拥有自主知识产权，可作为腺病毒载体新 药研发及生产的技术基础。
• 5L细胞罐收获物经纯化后产量能达到E15VP/批， 注射液制剂工艺达到了小容量水针1万支/批的生 产能力。
• 产品纯度大于98%，比滴度大于3.3%，各项质检 结果都能达到FDA对腺病毒类生物制品的质量标 准要求。
研发中心已完成申报临床所需药学研究的 品种