乳腺癌细胞培养
乳腺癌细胞原代培养及对六种抗癌药物的体外敏感性研究的开题报告
乳腺癌细胞原代培养及对六种抗癌药物的体外敏感性研究的开题报告一、研究背景与意义乳腺癌是世界性常见肿瘤，其发病率和死亡率逐年增加，给人们的生命、健康和家庭带来了巨大威胁。
目前，乳腺癌的早期诊断、治疗和临床应用的研究已成为医学界的热点，因此，研究乳腺癌细胞的体外培养及抗癌药物对其的敏感性，具有重要的临床意义。
二、研究目的本研究旨在通过乳腺癌细胞原代培养的方法，构建体外的乳腺癌模型，通过对其对六种抗癌药物的敏感性评价，为肿瘤的科学研究及临床治疗提供参考依据。
三、研究内容1. 乳腺癌组织切片制备及细胞原代培养技术的优选；2. 体外诱导乳腺癌模型的构建与鉴定；3. 采用MTT法对该模型对六种抗癌药物（如紫杉醇、多西紫杉醇、卡铂、氟尿嘧啶、多柿酸钠和替吉奥）的体外敏感性进行测定；4. 对实验结果进行数据统计、分析和表达。
四、研究方法1. 人乳腺癌组织块的采集：收集手术中取出的恶性肿瘤组织块；2. 细胞原代培养：采用组织切片法与酶消化法将肿瘤组织分离为单个细胞，接种紫杉醇、多西紫杉醇、卡铂、氟尿嘧啶、多柿酸钠和替吉奥等六种抗癌药物，将其接种至体外诱导乳腺癌模型的培养基中；3. 体外诱导乳腺癌模型的构建与鉴定：根据细胞培养特征，诱导细胞形成球体、乳头状突出物等形状，确立肿瘤细胞典型形态和生化指标；4. 采用MTT法对该模型对六种抗癌药物的体外敏感性进行测定；5. 对实验结果进行数据统计、分析和表达。
五、研究预期结果本研究将为乳腺癌细胞原代培养及其对六种抗癌药物的敏感性评价提供有效的实验方法和技术路线，同时，通过对体外诱导乳腺癌模型的构建及对其抗癌药物的敏感性评估，为乳腺癌的早期诊断和临床治疗的发展提供理论依据和实验数据参考。
人乳腺癌细胞;MCF7贴壁培养
北京索莱宝科技有限公司
人乳腺癌细胞；MCF7贴壁培养
细胞名称：人乳腺癌细胞；MCF7
形态特性：上皮细胞
生长特性：贴壁生长
培养条件：高糖DMEM，10%FBS
传代方法：1:3传代
冻存条件：细胞冻存液
特征特性：MCF-7细胞保留了多个分化了的乳腺上皮的特性，包括：能通过胞质雌激素受体加工雌二醇并能形成圆形复合物（domes）。
该细胞含有Tx-4癌基因。
肿瘤坏死因子α（TNF alpha）可以抑制MCF-7细胞的生长。
抗雌激素处理细胞能调变IGFBP’S的分泌。
细胞处理方法：
1.细胞在培养瓶中培养至状态良好后灌满培养基运输，获得细胞后用酒精棉球擦拭瓶口消毒，然后在超
净台中操作。
2.如细胞生长至70%-80%，将瓶中的培养基移入无菌瓶中留作培养使用，保留5-8mL培养基在37℃、5%
的CO2的温箱中继续培养。
细胞培养至90%-100%后，按要求消化传代。
3.弃去培养基，用无菌PBS或者其他缓冲液清洗细胞2次，加入适量胰蛋白酶消化（EDTA胰酶），待细胞
完全脱壁后加培养基吹打混匀，分瓶培养。
注意：
我们使用自产培养基及进口血清培养细胞，在您拿回细胞后，如想更换其它品牌培养基，请依照逐次替换的原则，先保留培养瓶中的培养基，多日多次代逐步更换，以减轻对细胞的刺激。
第1页，共1页。
一种3D乳腺癌细胞的体外快速培养方法[发明专利]
![一种3D乳腺癌细胞的体外快速培养方法[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/119df788d0f34693daef5ef7ba0d4a7302766cc4.png)
专利名称：一种3D乳腺癌细胞的体外快速培养方法专利类型：发明专利
发明人：焦春伟,谢意珍,梁慧嘉,陈家明,邓初夏
申请号：CN202210155316.2
申请日：20220221
公开号：CN114525251A
公开日：
20220524
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明属于细胞培养技术领域，公开了一种3D乳腺癌细胞的体外快速培养方法。
将液氮储存的MCF‑7细胞经解冻后加入完全培养基混匀，然后转移到培养皿中放入二氧化碳培养箱培养；将培养后的细胞用PBS溶液清洗，加入消化液消化，使细胞脱落后加入完全培养基离心，去上清液，再加入3D培养基，转移到超低吸附细胞培养板上放入二氧化碳培养箱培养至显微镜下观察到形成大小均一，细胞间间隔不明显，紧密的MCF‑7细胞球，3D乳腺癌细胞的体外培养成功。
本发明培养方法基于肿瘤细胞培养技术，采用商品化的超低吸附细胞培养板，寻找到了显著提高3D乳腺癌细胞培养效率、操作简单且成本较低的技术途径。
申请人：广东粤微食用菌技术有限公司
地址：510663 广东省广州市黄埔区(广州高新技术产业开发区)神舟路792号
国籍：CN
代理机构：广州弘邦专利商标事务所有限公司
代理人：程长文
更多信息请下载全文后查看。
MAD-MB-231细胞培养
1.2 方法
1.2.1 细胞培养
人乳腺癌MDA-MB-231细胞在含有10%太牛血清的RPMI-1640培养液中，于37℃
、5%CO2培养箱中常规培养，用含0.02%EDTA的胰酶消化传代。
实验分组如下：
对照组：细胞中加入含有0.1%DMSO培养液
实验组：细胞用不同浓度芹菜素（20、40、80、160µmol/L及半数IC5038.1µmol/L）处理。
1.2.2芹菜素对MDA-MB-231细胞增殖的影响
1.取处于对数期生长期的MDA-MB-231细胞常规消化，用含10%胎牛血清的RPMI 1640完全培养基配置成5.0×104个/mL细胞悬液。
2.每孔接种100℃µL细胞悬液，每浓度设6个平行样，在37、5%CO2培养箱中培养过夜。
3.吸出培养液，每孔加入含有0、20、4、80、160µmol/L的芹菜素RPMI 1640培养液200µL，在37、5%培养箱个、分别培养24h，48h、72h后加入MTT（5g L-1）20µL，继续培养4H 后吸出上清，每孔加入DMSO150微升，震荡溶解10分，待结晶完全溶解后，在酶联免疫测定仪上选择波长570nm处，以试剂对照组调零，测定各孔吸收值OD
4.细胞存活率=实验组OD/对照组OD×100%
生长抑制率=（1-实验组OD/对照组OD）×100%
IC50值用Logit法计算：
IgIC50=xm*I（p-pm-pn）/4)，设xm=ig最大剂量，I=IG(最大剂量/相邻剂量)，P：阳性反应率之和，pm：最大阳性反应率，pn:最小阳性反应率。
1.2.3光镜形态学观察
1.。
MCF-7ADR培养1
1、MCF-7 是一种很好养的人乳腺癌细胞，培养基用DMEM或RPMI1640均可， 10－15％的小牛血清就能长得很好。
一般两到三天传一代。
传代也很常规。
吸出培养基，加入0.25％的胰酶1ml，轻轻晃动培养瓶，使胰酶流遍瓶壁，以去除残余的培养基。
再加入2ml胰酶（25ml 培养瓶）静置消化2－5min，待细胞缩起变圆，将胰酶吸出加入培养基3ml吹打成单细胞悬液分瓶即可。
我一般都不用缓冲液冲洗，而直接用胰酶冲洗一下以去除剩余血清的作用，感觉效果还不错。
因为MCF-7消化较快，一般不放到培养箱中消化，以免消化太过。
需要注意的是MCF-7生长较快如不及时传代可出现整瓶细胞浮起，一般都来不及抢救。
2、MCF-7/ Adr 耐药细胞在培养时逐步加入至终浓度为8µmol/ L的阿霉素以维持抗药性, 实验前2周无药培养。
乳腺癌细胞培养上清液促进人脂肪间充质干细胞迁移和增殖的机制探讨
细胞与分子生物学乳腺癌细胞培养上清液促进人脂肪间充质干细胞迁移和增殖的机制探讨刘丹阳1，王璐璐2，何军2，姜杨2，李永涛2，张晓东2，李鹏辉2，沈雷2△摘要:目的探讨MDA-MB-231乳腺癌细胞培养上清液对人脂肪间充质干细胞（hAdMSC）迁移、增殖和凋亡的影响及分子机制。
方法将MDA-MB-231细胞上清液和不含胎牛血清的RPMI-1640培养基以1∶4的体积比混匀后培养的hAdMSC为MDA-MB-231上清液组。
向MDA-MB-231上清液组添加10µmol/L Reparixin（CXCR1/2抑制剂）为CXCR1/2抑制剂组；向MDA-MB-231上清液组添加10nmol/L GSK690693（Akt抑制剂）为Akt抑制剂组。
无任何刺激进行培养的hAdMSC为对照组。
细胞划痕实验检测各组hAdMSC的迁移能力，CCK-8实验检测各组hAdMSC增殖情况，Annexin V-FITC/PI双标记流式细胞凋亡实验检测各组hAdMSC凋亡率，Western blot检测各组hAdMSC的mTOR/磷酸化mTOR（p-mTOR）和Akt/磷酸化Akt（p-Akt）蛋白表达。
结果与对照组相比，MDA-MB-231上清液组hAdMSC的24h和48h细胞划痕闭合面积、细胞增殖水平以及p-Akt和p-mTOR蛋白相对表达量均增加，细胞凋亡率降低（P＜0.05）；与MDA-MB-231上清液组相比，Akt抑制剂组和CXCR1/2抑制剂组hAdMSC的48h细胞划痕闭合面积、细胞增殖水平以及p-Akt和p-mTOR蛋白相对表达量均降低，细胞凋亡率均增加（P＜0.05）。
结论MDA-MB-231乳腺癌细胞培养上清液通过激活Akt-mTOR信号通路促进hAdMSC迁移和增殖，抑制hAdMSC凋亡，其中IL-8-CXCR1/2轴发挥关键作用。
关键词：乳腺肿瘤；细胞迁移；细胞增殖；肿瘤微环境；脂肪间充质干细胞中图分类号：R737.9文献标志码：A DOI：10.11958/20230255The mechanism of breast cancer cell culture supernatant promoting migration andproliferation of human adipose mesenchymal stem cellsLIU Danyang1,WANG Lulu2,HE Jun2,JIANG Yang2,LI Yongtao2,ZHANG Xiaodong2,LI Penghui2,SHEN Lei2△1Department of Histology and Embryology,2Medical Research Center,Qiqihar Medical College,Qiqihar161006,China△Corresponding Author E-mail:Abstract:Objective To explore the effect of MDA-MB-231breast cancer cell culture supernatant on migration, proliferation and apoptosis of human adipose mesenchymal stem cell(hAdMSC)and its molecular mechanism.Methods hAdMSC cultured from MDA-MB-231cell supernatant and RPMI-1640medium without fetal bovine serum were mixed at a volume ratio of1∶4to form the MDA-MB-231supernatant group.CXCR1/2inhibitor group was added with10µmol/L Reparixin(CXCR1/2inhibitor)to the MDA-MB-231supernatant group.The Akt inhibitor group was added with10nmol/L GSK690693(Akt inhibitor)to the MDA-MB-231supernatant group.hAdMSC cultured without any stimulation was used as the control group.The migration ability of hAdMSC in each group was detected by cell scratch assay.hAdMSC proliferation was detected by CCK-8assay.Annexin V-FITC/PI double labeled flow cytometry was used to detect hAdMSC apoptosis rate in each group.The protein expression levels of mTOR/phosphorylated mTOR(p-mTOR)and Akt/phosphorylated Akt(p-Akt)in hAdMSC of each group were detected by Western blot assay.Results Compared with the control group,the24h and48h scratch closure area,cell proliferation level and relative expression levels of p-Akt,p-mTOR protein of hAdMSC were increased in the MDA-MB-231supernatant group,and the apoptosis rate was decreased(P＜0.05).Compared with the MDA-MB-231supernatant group,the48h cell scratch closure area,cell proliferation level and relative expression levels of p-Akt,p-mTOR proteins of hAdMSC were decreased in the Akt inhibitor group and the CXCR1/2inhibitor group,and the apoptosis rate was increased(P＜0.05).Conclusion MDA-MB-231breast cancer cell culture supernatant promotes hAdMSC migration and proliferation and inhibits hAdMSC apoptosis by activating Akt-mTOR signaling pathway,in which IL-8-CXCR1/2axis plays a key role.Key words:breast neoplasms;cell migration;cell proliferation;tumor microenvironment;adipose derived mesenchymal stem cells基金项目：黑龙江省教育厅科学技术研究项目资助（2020-KYYWF-0010）；齐齐哈尔市科技计划联合引导项目（LHYD-2021002）作者单位：1齐齐哈尔医学院组织胚胎学教研室（邮编161006），2基础医学科研中心作者简介：刘丹阳（1982），女，讲师，主要从事肿瘤微环境与肿瘤生物学方面研究。
常见几个乳腺癌细胞的表达的基因及培养
常见几个乳腺癌细胞的表达的基因及培养展开全文三连一下，了解更多精彩内容乳腺癌(mammary carcinoma)是女性最常见的恶性肿瘤之一。
因地理环境、生活习惯的不同...40%～50%的乳腺癌含有孕激素受体（PR），这类乳腺癌称为PR阳性乳腺癌。
实验常用的乳腺癌细胞有:MCF-7，MCF-10A，MDA-MB-231，MDA-MB-435，MDA-MB-435S，MDA-MB-436，MDA-MB-453，MDA-MB-468，MDA-MB-157，MDA-MB-361，SK-BR-3，SUM159PT，T-47D，ZR-75-30，ZR-75-1，Hs 578T，HCC1937，HCC 38，HBL100，BT-549，BT-474，BT-20，Bcap-37，DU4475等等。
不同的细胞株所表达的基因都会不同，以下，是我们整理的这些常见的细胞所表达的基因，也是我们公司可以提供的乳腺癌的细胞种类，乳腺癌研究方面的老师记得收藏哦：部分细胞形态细胞名称来源/形态培养基细胞表达BT-20腺癌细胞浸润性导管癌乳腺/上皮细胞样培养基：90%MEM 10%FBSG/A完全培养基：MEM完全培养基（货号：MD0301）气相：37℃, 5% CO2ER(-); PR(-);TP53 WT贴壁生长；该细胞表达WNT3和WNT78。
TNFalpha抑制该细胞生长。
该细胞雌激素受体阴性，但表达5＇外显子缺失的雌激素mRNA。
BT-474导管癌细胞乳腺;乳房/导管；上皮细胞样培养基：90%1640 10% FBSG/A完全培养基：1640完全培养ER( ); PR( );HER2( )；TP53浸润性导管癌 基（货号：MD0201）气相：空气95% ; 37℃, 5%CO2BT-549 导管癌细胞 乳腺；乳房/上皮细胞 培养基：90%1640 10% FBS G/A 完全培养基：1640完全培养基（货号：MD0201）气相：空气95% ; 37℃, 5%CO2ER(-); PR(-);TP53 WTHBL100胸腔积液 培养基：DMEM 基础培养基 , 90%；胎牛血清，10%。
乳腺癌细胞三维培养模型构建及其药物敏感性研究
乳腺癌细胞三维培养模型构建及其药物敏感性研究姜昊声;曹燕;吴绍秋;刘冰妍;贾一平;王振磊;尚鸣异【摘要】目的：观察乳腺癌MCF-7细胞在3D与2D培养模式下对阿霉素的敏感性。
方法应用模板印制凝胶微孔支架技术建立体外3D细胞培养模型，通过倒置显微镜等方法观察3D细胞球的生长特性；采用AlamarBlue法获得不同培养模式下药物阿霉素作用的细胞抑制率；采用流式细胞术比较2D培养和3D培养细胞周期、细胞凋亡的差异。
结果3D与2D培养相比，G1／G0期胞增多，S期、G2／M期细胞减少，细胞周期受阻滞，具有统计学差异（P＜0．05）；活细胞减少，早期凋亡、晚期凋亡、坏死细胞比例增大（ P＜0．05）。
阿霉素作用3 d后，3D培养细胞的IC50值为23．77μg／ml [95％CI 15．80～35．77]，2D培养细胞的IC50值为0．46μg／ml （95％ CI 0．28～0．75），MCRI为51．7。
结论3D 培养MCF-7细胞在细胞周期、细胞凋亡等方面与2D培养细胞存在明显差异，可能是导致乳腺癌多细胞耐药的重要原因。
%Objective To observe the changesof sensitivity to doxorubicin on breast adenocarcinoma MCF -7 cells cul-tured as 3 dimensional model or monolayer .Methods MCF-7 cells were cultured as 3 dimensional model using agarose scaffolds with highly ordered micro-wells.The spheroid growth characterization was observedby invert microscope .The sensitivity to doxoru-bicin on MCF-7 spheroidsor monolayers was determined by AlamarBlue assay respectively .Cell cycle and apoptotic rate were de-tected by flow cytometry.Results For 3D spheroid culture,the proportion of cells in G0 ~G1 phase was higher,while the propor-tion of cells in S phase and G2-M phase were lower than the2D culture(P<0.05).The cell viability declined in 3D culture than the 2Dcontrol,and the proportion of cells in the early-apoptotic,late-apoptotic phase increased significantly (P<0.05).After 3 days of DOX treatment,the IC50 value obtained for spheroid culture was 23.77μg/ml [95%CI15.80~35.77],relative to 0.46μg/ml (95%CI 0.28~0.75) for the monolayer culture .The MCRI value was 51.7.Conclusion There are significant differ-ences in cell cycle and apoptotic rate between MCF-7 spheroids and monolayer ,which may be the important causes of the multi-cellular resistance of breast carcinoma .【期刊名称】《实用癌症杂志》【年(卷),期】2016(031)006【总页数】4页(P871-874)【关键词】乳腺癌;肿瘤多细胞球;3D培养;阿霉素;抗药性【作者】姜昊声;曹燕;吴绍秋;刘冰妍;贾一平;王振磊;尚鸣异【作者单位】200072 上海交通大学医学院附属同仁医院;200072 上海交通大学医学院附属同仁医院;200072 上海交通大学医学院附属同仁医院;200072 上海交通大学医学院附属同仁医院;200072 上海交通大学医学院附属同仁医院;200072 上海交通大学医学院附属同仁医院;200072 上海交通大学医学院附属同仁医院【正文语种】中文【中图分类】R737.9近年来，3D细胞培养在药物研究和生物学研究中的应用越来越广泛。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
MCF-7是一种很好养的人乳腺癌细胞，培养基用DMEM或RPMI1640均可，10- 15%的小牛血清就能长得很好。
一般两到三天传一代。
传代也很常规。
吸出培养基，加入0.25%的胰酶1ml，轻轻晃动培养瓶，使胰酶流遍瓶壁，以去除残余的培养基。
再加入2ml胰酶(25ml 培养瓶)静置消化2—5min，待细胞缩起变圆，将胰酶吸出加入培养基3ml吹打成单细胞悬液分瓶即可。
我一般都不用缓冲液冲洗，而直接用胰酶冲洗一下以去除剩余血清的作用，感觉效果还不错。
因为MCF-7消化较快，一般不放到培养箱中消化，以免消化太过。
需要注意的是MCF-7生长较快如不及时传代可出现整瓶细胞浮起，一般都来不及抢救。
MDA-MB-231人乳腺癌细胞细胞中文名称人乳腺癌细胞细胞英文名称MDA-MB-231物种人细胞形态特征上皮样细胞生长特性贴壁生长细胞特种特性MDA-MB-231是从一名51岁的白人女性乳腺癌患者的胸水中分离建立的。
该细胞表达表皮生长因子EGF受体、TGF-a受体和WNT7BS基因培养基L15: Leibovitz Medium血清10%FBS细胞传代方法1:2~1:4 传代；每周2~3次细胞传代情况C5细胞冻存条件MDA-MB-231人乳腺癌细胞基础培养基+5%DMSO+20%FBS支原体检测阴性说明培养基：DMEM 90%, Fetal Bovine Serum 10%培养条件：37 C 5% CO2消化条件：0.25% (w/v) Trypsin-0.53mM EDTA 溶液，消化5-10min传代的比例：1 : 2~1: 4换液时间：2~3天换液一次冻存液比例：85%培养基，10%FBS, 5% (v/v) DMSO冻存密度：1-2 X 10 6/管，液氮保存MDA-MB-231人乳腺癌细胞复苏方法：取出冻存管后，投入37 C水浴中，震荡解冻2 min , 酒精消毒管壁外侧后，将其转入超净台中，将管内细胞转移至离心管中，加入 5 ml 37 C预热的培养基，并清洗冻存管一次，将离心管离心( 1000 rpm , 5 min),弃去上清液，再加入2 ml培养■基，转入培养瓶中培养。
产品名称：人正常乳腺细胞Hs 578Bst规格：70%密度的25cm2培养瓶的细胞一瓶特点：细胞代数为4-5代左右包装：内层无菌自封袋；专用防压泡沫盒；外层防压保温气泡袋；说明书细胞来源：ATCC、sciencell、ICLC货期：1-2周运输方式：快递运输售后：收到细胞后7天，如发现细胞有质量问题(如污染，死亡，快递运输等原因)时，应出具书面质量问题报告并及时传真或E-mail致销售人员，我们将尽快为您解决。
细胞培养常见问题分析细胞培养1、冷冻管应如何解冻？取出冷冻管后，须立即放入37 C水槽中快速解冻，轻摇冷冻管使其在1分钟内全部融化，并注意水面不可超过冷冻管盖沿，否则易发生污染情形。
另冷冻管由液氮桶中取出解冻时，必须注意安全，预防冷冻管之爆裂。
2、细胞冷冻管解冻培养时，是否应马上去除DMSO ?除少数特别注明对DMSO敏感之细胞外，绝大部分细胞株(包括悬浮性细胞)，在解冻之后，应直接放入含有10-15ml新鲜培养基之培养角瓶中，待隔天再置换新鲜培养基以去除DMSO即可，如此可避免大部分解冻后细胞无法生长或贴附之问题。
3、可否使用与原先培养条件不同之培养基？不能。
每一细胞株均有其特定使用且已适应之细胞培养基，若骤然使用和原先提供之培养条件不同之培养基，细胞大都无法立即适应，造成细胞无法存活。
4、可否使用与原先培养条件不同之血清种类？不能。
血清是细胞培养上一个极为重要的营养来源，所以血清的种类和品质对于细胞的生长会产生极大的影响。
来自不同物种的血清，在一些物质或分子的量或内容物上都有所不同，血清使用错误常会造成细胞无法存活。
5、何谓FBS, FCS, CS, HS ?FBS (fetal bovine serum )和FCS (fetal calf serum )是相同的意思，两者都是指胎牛血清，FCS乃错误的使用字眼，请不要再使用。
CS (calf serum )则是指小牛血清。
HS (horseserum )则是指马血清。
6、培养细胞时应使用5 %或10% CO2 ?或根本没有影响？一般培养基中大都使用HCO3-/CO32-/H+ 作为pH的缓冲系统，而培养基中NaHCO3的含量将决定细胞培养时应使用的CO2浓度。
当培养基中NaHCO3含量为每公升3.7 g时, 细胞培养时应使用10 % CO2 ;当培养基中NaHCO3 为每公升1.5 g时，则应使用5 % CO2 培养细胞。
7、何时须更换培养基？视细胞生长密度而定，或遵照细胞株基本数据上之更换时间，按时更换培养基即可。
&培养基中是否须添加抗生素？除于特殊筛选系统中外，一般正常培养状态下，培养基中不应添加任何抗生素。
9、附着性细胞继代时所使用之trypsi n-EDTA 浓度？应如何处理？一般使用之trypsin-EDTA 浓度为0.05% trypsin-0.53mMEDTA.4 Na 。
次开瓶后应立即少量分装于无菌试管中，保存于-20 C,避免反复冷冻解冻造成trypsin之活性降低，并可减少污染之机会。
10、悬浮性细胞应如何继代处理？一般仅需持续加入新鲜培养基于原培养角瓶中，稀释细胞浓度即可，若培养液太多时，可将培养角瓶口端稍微抬高，直到无法容纳为止。
分瓶时取出一部份含细胞之培养液至另一新的培养角瓶，加入新鲜培养基稀释至适当浓度，重复前述步骤即可。
11、欲将一般动物细胞离心下来，其离心速率应为多少转速？欲回收动物细胞，其离心速率一般为300xg (约1,000rpm ), 5 - 10分钟，过高之转速，将造成细胞死亡。
12、细胞之接种密度为何？依照细胞株基本数据上之接种密度或稀释分盘之比例接种即可。
细胞数太少或稀释的太多亦是造成细胞无法生长之一重要原因。
13、细胞冷冻培养基之成份为何？动物细胞冷冻保存时最常使用的冷冻培养基是含5 - 10 %DMSO (dimethyl sulfoxide )和90 - 95 % 原来细胞生长用之新鲜培养基均匀混合之。
注意：由于DMSO稀释时会放出大量热能，故不可将DMSO直接加入细胞液中，必须使用前先行配制完成。
14、DMSO 之等级和无菌过滤之方式为何？冷冻保存使用之DMSO 等级，必须为Tissue culture grade 之DMSO (如Sigma D2650 ),其本身即为无菌状况，次开瓶后应立即少量分装于无菌试管中，保存于4°C ,避免反复冷冻解冻造成DMSO之裂解而释出有害物质，并可减少污染之机会。
若要过滤DMSO，则须使用耐DMSO之Nylon材质滤膜。
15、冷冻保存细胞之方法？冷冻保存方法一：冷冻管置于4 C 30~60分钟T (-20 C 30分钟*) - 80 C 16~18小时(或隔夜) T液氮槽vaporphase长期储存。
冷冻保存方法二：冷冻管置于已设定程序之可程序降温机中每分钟降1-3 C至-80 C以下，再放入液氮槽vapor phase长期储存。
*-20 C不可超过1小时，以防止冰晶过大，造成细胞大量死亡，亦可跳过此步骤直接放入-80 C冰箱中，惟存活率稍微降低一些。
15、细胞欲冷冻保存时，细胞冷冻管内应有多少细胞浓度？冷冻管内细胞数目一般为1x106 cells/ml vial ，融合瘤细胞则以5x106 cells/ml vial 为宜。
16、应如何避免细胞污染？细胞污染的种类可分成细菌、酵母菌、霉菌、病毒和霉浆菌。
主要的污染原因为无菌操作技术不当、操作室环境不佳、污染之血清和污染之细胞等。
严格之无菌操作技术、清洁的环境、与品质良好之细胞来源和培养基配制是减低污染之方法。
17、如果细胞发生微生物污染时，应如何处理？加入相应抗生素。
直接灭菌后丢弃之。
18、支原体（mycoplasma ）污染的细胞，是否能以肉眼观察出异状？不能。
除极有经验之专家外，大多数遭受支原体污染的细胞株，无法以其外观分辨之。
19、支原体污染会对细胞培养有何影响？支原体污染几乎可影响所有细胞之生长参数，代谢及研究之任一数据。
故进行实验前，必须确认细胞为mycoplasma-free ，实验结果之数据方有意义。
20、CO2培养箱之水盘如何保持清洁？定期（至少每两周一次）以无菌蒸馏水或无菌去离子水更换之。
21、为何培养基保存于4 C冰箱中，颜色会偏暗红色，且pH值会越来越偏碱性？培养基保存于4 C冰箱中，培养基内之CO2会逐渐溢出，造成培养基越来越偏碱性。
而培养基中之酸碱指示剂（通常为phenol red ）的颜色也会随碱性增加而更偏暗红。
培养基偏碱之结果，将造成细胞生长停滞或死亡。
若培养基偏碱时，可以通入无菌过滤之CO2，以调整pH值。
22、各种细胞培养用的dish , flask是否均相同？不同厂牌的dish或flask，其所coating的polymer不同，制造程序亦不同，虽对大部分细胞没有太大之影响，惟少数细胞则可能因使用厂牌不同之dish或flask而有显著之生长差异。
23、购买之细胞冷冻管经解冻后，为何会发生细胞数目太少之情形？购买之细胞死亡或细胞存活率不佳可能原因？研究人员在细胞培养时出现存活率不佳，常见原因可归纳为：培养基使用错误或培养基品质不佳。
血清使用错误或血清的品质不佳。
解冻过程错误。
冷冻细胞解冻后，加以洗涤细胞和离心。
悬浮细胞误认为死细胞。
培养温度使用错误。
细胞置于-80 C太久。
24、收到之冷冻管瓶身破裂，瓶盖有裂纹，或瓶盖脱落之原因？冷冻管瓶盖裂纹，或瓶身破裂，可能是因为操作者夹取冷冻管时用力不当，造成冷冻管裂损，建议使用止血钳小心夹取。
另冷冻管瓶盖松动或松脱，乃因热胀冷缩之物理现象，冷冻管有可能因此而造成细胞污染，故冷冻管于放入和取出液氮桶时，均应立刻将冷冻管再一次扭紧。
25、如何选用特殊细胞系培养基？培养某一类型细胞没有固定的培养条件。
在MEM中培养的细胞，很可能在DMEM或M199中同样很容易生长。
总之，首选MEM做粘附细胞培养、RPMI-1640做悬浮细胞培养是一个好的开始，各种目的无血清培养首选AIM V （12005 ）培养基（SFM ）。
26、L-谷氨酰胺在细胞培养中重要吗？它在溶液中不稳定吗？L-谷氨酰胺在细胞培养时是重要的。
脱掉氨基后，L-谷氨酰胺可作为培养细胞的能量来源、参与蛋白质的合成和核酸代谢。
L-谷氨酰胺在溶液中经过一段时间后会降解，但是确切的降解率一直没有最终定论。
L-谷氨酰胺的降解导致氨的形成，而氨对于一些细胞具有毒性。
27、GlutaMAX-l是什么？培养细胞如何利用GlutaMAX-l ?这个二肽有多稳定？GlutaMAX-l二肽是一个L-谷氨酰胺的衍生物，其不稳定的alpha-氨基用L-丙氨酸来保护。