基因转染技术

五、主要应用
1 、用于建造疾病的动物模型和药物 、 筛选模型 2 、用于基因治疗 3 、用于异种器官移植 4 、用于改良动植物品种和生产性能 5 、用于生产药用蛋白和保健蛋白 6 、用于生产人抗体
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2.分子生物学方法 、 外源基因是否真的转入靶细胞必须用 分子杂交方法进行证实。常用的方法 有原位杂交、Southern杂交。其中主 要问题是探针的选择。
四、外源基因的表达和检测
在筛选出转化子后还需要鉴定转导 、 细胞中外源基因的表达状况。其中包 括对目的基因和标记基因的鉴定。常 用方法有原位杂交、Northern杂交、 免疫组织化学染色等，原位及 Northern杂交是检测外源基因转录出 的mRNA,后者则是检测外源基因翻 译出的蛋白质。
分子生物学技术在药理中的应用
基因转染技术
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主要内容
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概
述
基因运载系统 转染的基本过程 外源基因的表达和检测 主要应用
一 、 概述
基因转染的定义： 基因转染的定义：将具生物功能的核酸转移 或运送到细胞内并使核酸在细胞内维持其生 物功能。 物功能。 将特定的遗传信息传递到真核细胞中， 将特定的遗传信息传递到真核细胞中，这种 能力不但革新了生物学和医学中许多基本问 题的研究， 题的研究，也推动了诊断和治疗方面的分子 技术发展，并使基因治疗成为可能。 技术发展，并使基因治疗成为可能。目前基 因转移技术已广泛用于基因的结构和功能分 基因表达与调控、 析、基因表达与调控、基因治疗与转基因动 物等研究。 物等研究。 基因转染技术： 基因转染技术：将纯化的含有靶基因的质粒 DNA送入细胞内，并在细胞内表达。 送入细胞内， 送入细胞内 并在细胞内表达。
、
7、微粒子轰击法（基因枪） 、微粒子轰击法（基因枪）
在真空状态下，利用粒子加速器将外面 包裹了外源基因DNA的金颗粒或钨粉微 颗粒进行加速，打入完整的细胞中，从 而使外源基因DNA得以在靶细胞中稳定 转化并有可能获得表达。实验结果表明， 用这种方法靶基因可在皮肤、肌肉、肝、 胰、胃和乳腺等细胞中表达。
、
8、 DEAE-葡聚糖和polybrene聚阳 、 、 离子法
带正电的DEAE-葡聚糖或polybrene多 聚体复合物和带负电的DNA分子使得 DNA DNA可以结合在细胞表面。通过使用 DMSO或甘油获得的渗透休克将DNA复 合体导入。DEAE－葡聚糖仅限于瞬时 转染。
9、精子载体法 、
、 用精子和NDA（吡啶核甘酸辅酶 ）-剂 孵育，可捕获得DNA。通过受精过程， 将外源性基因导入受精卵，大大简化了 转基因动物的制备过程。 这项转染方 法是近年来才发展出来应用在鱼类转殖 的最新技术，它最大有点就是简单方便。
转染与分析
植物基因转染应用过程
（一）靶细胞的准备 被用于作靶基因转染的细胞，其生长状 态如何，将直接决定了基因转染效率。 、 如为贴壁生长的细胞，一般要求在转染 前一日，必需应用胰酶处理成单细胞悬 液，重新接种于培养皿或瓶，细胞密度 以铺满培养器皿的60%为宜，转染当日， 在转染前4小时换一将近新鲜培养液。 对于悬浮细胞，也需在转染前4小时换 一次新鲜培养液。
将氯化钙、DNA和磷酸盐缓冲液混合， 形成磷酸钙微沉淀 ，附着于细胞膜并 经过细胞内吞作用进入细胞质。 该方法的转化效率通常很低。
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3、脂质体染法 、
脂质体能在体内或体外提供运载外源性 遗传物质进入细胞的载体。脂质体介导 的基因转移的最大优势在于能在活体内 应用。
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图1. 阳离子脂质体介导的转染
（二）靶基因质粒DNA的准备 靶基因质粒 的准备 用于转染的质粒DNA必须无蛋白质，无 必须无蛋白质， 用于转染的质粒 必须无蛋白质 RNA和其它化学物质的污染， 和其它化学物质的污染， 和其它化学物质的污染 、 OD260/280比值应在 以上。DNA的 比值应在1.8以上 比值应在 以上。 的 质量和纯度能影响某些细胞系的转染效 可以通过CsCl梯度法或标准柱层 率，可以通过 梯度法或标准柱层 析法进行纯化。 析法进行纯化。
、
聚阳离子受体介导的转染过程
5、显微注射法
、
在显微镜下，将DNA经同细胞玻璃针直 接注入细胞，该法适合于各种培养生长 的细胞，但需要一定的设备和操作技巧。
6、电穿孔法 、
电穿孔通过将细胞暴露在短暂的高场强 电脉冲中转导分子。即 利用脉冲场将 DNA导入培养细胞。电脉冲和场强的优 化对于成功的转染很重要。
（二）基因转移的病毒的方法 病毒作为基因转移是基因递送良好的工 病毒载体的优点有：（ ：（1） 具，病毒载体的优点有：（ ）在转化 、 的细胞中传播重组的DNA分子作为稳定 的细胞中传播重组的 分子作为稳定 的遗传成分；（ ）可能将有缺陷的或 的遗传成分；（2） ；（ 突变的基因置于病毒调节信号的控制下 以进行研究；（ ；（3） 以进行研究；（ ）能将克隆的基因作 为病毒微染色体的一部分 ，并能进行 分离；（ ；（4）转移效率较高。 分离；（ ）转移效率较高。其主要缺 点是病毒载体对外源基因的最大容纳量 只有2500bp。目前常用的病毒载体有 只有 。 下列几种。 下列几种。
受体介导的基因转移
直接注射法 磷酸钙共沉淀法 脂质体染法
分类
显微注射法 电穿孔法
微粒子轰击法 DEAE-葡聚糖和 polybrene聚阳离子法 精子载体法
1、直接注射法 、
将含有DNA的溶液直接注射到肌肉，以 引起邻近的细胞摄入DNA链进行表达， 在肌细胞中，基因表达可持续数月。
、
2、磷酸钙共沉淀法 、
（2） 基因缺陷型受体细胞的选择性 以基因缺陷型细胞作为靶细胞，将正常 、 基因导入基因缺陷型靶细胞后，使用选 择性培养基进行筛选。 （3） 基因共转染技术 将目的基因表达 载体DNA和标记基因表达载体DNA混合 后共同转移到靶细胞中，分别使用标记 基因和目的基因对应的选择剂进行两次 筛选，最后得到复合转导的转化子。
4、受体介导的基因转移 、
依靠受体介导的细胞内吞途径以转移外 源基因。受体介导的基因转移方法是在 质粒DNA和某种特异的多肽（配体）之 间形成复合体，而这种多肽能为细胞表 面的受体所识别。如若将DNA在体内运 送至肝内，可以选将DNA和能与肝细胞 受体特异结合的去唾液酸糖蛋白质偶
、
联，以便通过细胞内吞过程而被摄入， 这种DNA大部分被肝脏所摄取。应用该 、 方法转移的外源基因在活体内的表达持 续时间较短，在评估实际应用前境上还 在一些问题。
基因转染方法
方法分类
转染
通过生化或者 物理方法将目的 基因导入真核细 胞中 。
感染
通过病毒介导 ，用基因组中携 带有克隆目的片 断的病毒来感染 靶细胞。
二 、 基因运载系统
将某一特定的靶基因传递到靶细 胞，需要应用某一基因运载系统， 目前将这一系统概括为两大类： 非病毒方法和病毒方法
（一）非病毒方法
在目前的技术状态下，基因转染效率很难 、 达到100﹪。故必须首先将转导细胞和未转 导的细胞加以区分。这样的新技术发展很 快，常用的转导细胞筛选方法： 1.利用基因表达产物筛选法 （1） 标记基因筛选法 在载体上引入一个标记 基因，或同时导入标记基因，在转染后的 适当时间选用合适剂量的选择培养基，筛 选标记基因表型，那些已导入外源基因的 细胞将存活下来。
2、DNA病毒载体 、 病毒载体
主要有腺病毒相关病毒载体，疱疹病毒 载体。这一类是利用病毒载体介导的基 因转移，以其高转染率和良好的靶向性 成为肿瘤基因治疗的有效方法。对DNA 病毒载体的研究是当前基因治疗研究中 的重点领域。
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病毒载体转染过程
三、转染的基本过程
靶细胞的准备
靶基因质粒DNA的准备 的准备 条件应参考所使用的试 剂和方法进行优化。 剂和方法进行优化。靶基因被导入细胞 、 一般在转染后48小时 小时， 后，一般在转染后 小时，靶基因即在 细胞内表达。根据不同的实验目的，48 细胞内表达。根据不同的实验目的， 小时后即可进行靶基因表达的检测等实 如若建立稳定的细胞系， 验。如若建立稳定的细胞系，则可对靶 细胞进行筛选， 细胞进行筛选，根据不同基因载体中所 含有的抗性标志选用相应的药物， 含有的抗性标志选用相应的药物，最常 用的真核表达基因载体的标志物有潮霉 素（hygromycin）和新霉素 ） （neomycin ）
1、逆转录病毒载体 、
、 逆转录病毒为RNA病毒，它们的基因组 编码在一条单链RNA上，病毒进入细胞 通过逆转录作用，病毒RNA即转变为双 链DNA分子，DNA进入细胞核并整合在 细胞染色体中，这种整合的病毒称为原 病毒。在原病毒的两端各有一长末端重 复序列（LTR）,LTR内侧还有为复制所 必需的其他顺序，包括包装信号。目前 常用的逆转病毒载体有CMV和SV。