【实用文档】蛋白质测定的国标规定方法
蛋白质含量测定操作细则
蛋白质含量测定操作细则1．试剂与器材：1．1标准蛋白溶液（100μg/ml），经事先标定。
1．2酚试剂：酚试剂贮备液（购买国产或进口）经标准氢氧化钠液滴定，测定酸浓度，用注射用水稀释至1M，即为酚试剂。
1．3 2%酒石酸钠溶液：称取2克酒石酸钠，加注射用水溶解至100ml。
1．4 1%硫酸铜溶液：称取1克硫酸铜，加注射用水溶解至100ml。
1．5 4%碳酸钠溶液：称取4克碳酸钠，加注射用水溶解至100ml。
1．6 0.8%氢氧化钠溶液：称取0.8克氢氧化钠，加注射用水溶解至100ml。
1．7 碱性铜液（用时现配）取试剂1. 3、1. 4各0.5ml，试剂1. 5、1. 6各25ml，混匀。
1．8 分光光度计（有650nm波长）1．9 计算器：CASIO fx－3900 （能计算相关系数）1．10电子天平1．11试剂瓶、烧杯、量筒、玻璃棒、洗耳球、滤纸等1．12吸管、移液管、中试管、试管架2．操作：2．1标准曲线：精确量取标准蛋白液0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml分别加入试管中，补加注射用水至1ml，加碱性铜液5ml，混匀，放置10分钟后，快速加入酚试剂0.5ml，混匀，室温放置30分钟，于650nm波长比色，测定其OD值，计算相关系数。
2．2样品测定：精确量取适量样品（蛋白约为50μg）于试管内，补加注射用水至1ml，加碱性铜液5ml，混匀，放置10分钟后，快速加入酚试剂0.5ml，混匀，室温放置30分钟，于650nm 波长比色，测定其OD值，（显色后，若浑浊，经3000rpm离心后再比色）。
3．结果计算：3．1坐标法以蛋白浓度为横坐标，测定的OD值为纵坐标，作一标准曲线，根据样品的OD值从标准曲线上查出相应的结果（μg），进行计算。
查出的结果×稀释倍数蛋白含量（μg/ml）=取样量查出的结果×稀释倍数蛋白含量（μg/ml）=取样量×10×固总3．2计算器法：3．2．1按AC键，打开计算器开关。
2020年版中国药典,蛋白质含量测定法
2020年版我国药典中蛋白质含量测定法一、引言我国药典是我国药品标准的权威性规范，对药品的质量、安全和有效性进行了明确规定。
其中，蛋白质是药品的重要组成部分，其含量的准确测定对于药品的质量控制和临床应用至关重要。
为了确保药品质量的稳定性和可靠性，我国药典不断修订更新，2020年版我国药典中关于蛋白质含量测定法的规定也做出了相应的更新和修订。
二、2020年版我国药典中关于蛋白质含量测定法的主要内容2020年版我国药典中关于蛋白质含量测定法主要包括以下几个方面的规定：1. 适用范围：规定了蛋白质含量测定法适用于固体制剂和液体制剂中蛋白质的含量测定。
2. 试剂和仪器：详细列举了在进行蛋白质含量测定时所需的试剂和仪器，例如酚试剂、硫酸铜溶液、标准牛血清白蛋白等。
对于光度计和分光光度计的参数要求也进行了详细规定。
3. 样品处理：对于固体制剂和液体制剂中蛋白质含量的样品处理方法进行了详细规定，包括样品的称量、样品的溶解和稀释等步骤。
4. 测定步骤：规定了蛋白质含量的测定步骤，包括试样处理、标准曲线的绘制、吸光度的测定等。
5. 结果计算：明确了蛋白质含量的结果计算方法，对于各个步骤中可能出现的误差和处理方式进行了详细的说明。
三、2020年版我国药典中蛋白质含量测定法的现状与发展随着科学技术的不断进步和医药行业的不断发展，蛋白质含量测定方法也在不断完善和更新。
2020年版我国药典中关于蛋白质含量测定法的更新和修订，不仅是对已有方法的继续完善，也是在吸纳国际先进技术和理论的基础上进行的创新。
四、2020年版我国药典中蛋白质含量测定法的意义和价值2020年版我国药典中关于蛋白质含量测定法的规定，对于药品质量的保障和提升具有重要的意义和价值。
它不仅为药品生产企业提供了明确的技术指导和规范，也为监管部门提供了依据和依据，为药品质量的安全性和有效性保驾护航。
五、结语2020年版我国药典中蛋白质含量测定法的更新和修订，是对我国药品标准化建设的积极响应和重要举措。
培训：食品中蛋白质的测定GB_5009.5-2010
蛋白质概况
➢ 蛋白质是含氮的有机化合物，分子量很大。主要由C、H、 O、N、S五种元素组成。某些蛋白质中还含有微量的 P、 Cu、Fe、I 等。
蛋白质检测方法简介
➢ 目前国家标准中用于检测食品中蛋白质的方法共有三 种：
1、凯氏定氮法（适用于各种食品中蛋白质的测定） 2、乙酰丙酮分光光度法（适用于各种食品中蛋白质的测 定） 3、燃烧法（适用于蛋白质含量在10 g/100 g 以上的粮食、 豆类、奶粉、米粉、蛋白质粉等固体试样的筛选测定）
➢ 不适用于添加无机含氮物质、有机非蛋白质含氮物质 的食品测定。
蛋白质检测方法简介
➢ 4、近红外光谱技术是20世纪80年代后期迅速发展起来 的一项物理测试技术。近红外透射或反射光谱具有分 析样品用量少、分析速度快和结果稳定等优点，在食 品分析领域已经逐步得到了应用。
➢ 5、杜马斯燃烧法比凯氏定氮法还早，近年来杜马斯燃 烧法测定饲料、肥料等农产品中氮含量在我国也有了 应用。
第一法：凯氏定氮法
➢ 原理：食品与硫酸和硫酸铜、硫酸钾一同加热消化，使 蛋白质分解，分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵，然后碱 化蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后以硫酸或者盐酸标准滴 定溶液滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数，即为蛋白 质的含量。其反应方程式如下：
➢ 蛋白质+ H2SO4 → （NH4） 2SO4 ➢ （NH4）2SO4+NaOH=NH4OH+Na2SO4 ➢ NH4OH → H2O + NH3 → NH4OH ➢ NH3+(标准) H2SO4→（NH4）2SO4 ➢ (标准) H2SO4+NaOH→Na2SO4+H2O
食品中蛋白质含量的测定
•图 1 常量蒸馏装置 1—电炉；2—蒸汽发生瓶；3— 大气夹；4—螺旋夹；5—加碱漏斗；6—凯氏烧瓶； 7—氮素球；8—冷凝管；9—接收瓶；12—蒸汽发生器；3—大 气夹；4—螺旋夹；5—小玻璃杯； 6—反应室；7—冷 凝管；8—接收瓶
❖ 铰肉机：篦孔径不超过 4nm；组织捣碎机；粉碎机； 研 钵：玻璃或瓷质。
食品中蛋白质的测定方法
应用化学2班 来宏伟
09102100108
GB/T 14771—1993 中华人民共和国国家标准 食品中蛋白质的测定方法
Method for determination of protein content in foods
❖ 一. 主题内容与适用范围 : ❖ 本标准规定了用凯氏定氮法测定食品中蛋
3.1.2 液体试样：取 10～20±0.05mL 试样（使试 样中含氮 30～40mg），移入凯氏烧瓶中，蒸发至近 干。
4.2 消化 ：向凯氏烧瓶中依次加入硫酸铜0.4g、硫 酸钾10g、硫酸20mL 及数粒玻璃珠。将凯氏烧瓶斜 放（45°）在电炉上，缓慢加热。待起泡停 止，内 容物均匀后，升高温度，保持液面微沸。当溶液呈 蓝绿色透明时，继续加热 0.5～1h。取下凯氏烧瓶 冷却至约 40℃，缓慢加入适量水，摇匀。冷却至室 温。
❖ 凯氏定氮法测定出的食品中蛋白质含量为 粗蛋白含量
五.改进措施
❖ 1.消化过程用碱液吸收瓶,防止SO2排入大气 中造成的环境污染
4.3 蒸馏
4.3.1 常量蒸馏
❖ 向接收瓶内加入 50mL4%硼酸溶液及4滴甲基红 -次甲基蓝混合指示液。将接收瓶置于蒸馏装置的 冷凝管下口，使冷凝管下口浸入硼酸溶液中。 将盛有消化液的凯氏烧瓶连接在氮素球下，塑料 管下端浸入消化液中。沿漏斗向凯氏烧瓶中缓慢 加入 70mL40%氢氧化钠溶液（使漏斗底部始终留 有 少量碱液，封口）。加碱后烧瓶内的液体应为 碱性（黑褐色）。通入蒸汽，蒸馏 20min（始终 保持液面沸腾）。至少收集 80mL 蒸馏液。降低 接收瓶的位置，使冷凝管口离开液面，继续蒸馏 3min。用少量水冲洗冷凝管管口，洗液并入接收 瓶 内，取下接收瓶。
蛋白测定国标
食品安全国家标准食品中蛋白质的测定[ 关闭本页 ] 转载于：卫生部发布时间：2010-05-21T10:40:00食品安全国家标准食品中蛋白质的测定National food safety standardDetermination of protein in foods中华人民共和国国家标准GB 5009.5—2010前言本标准代替GB/T 5009.5-2003《食品中蛋白质的测定》、GB/T 14771-1993《食品中蛋白质的测定方法》和GB/T 5413.1-1997《婴幼儿配方食品和乳粉蛋白质的测定》。
本标准与GB/T 5009.5-2003相比主要修改如下：——在第一法中增加了自动蛋白质测定仪的方法；——增加了燃烧法，作为第三法；——修改了换算系数；——对计算结果的有效数字规定进行了修改；——增加pH计对滴定终点的判定。
本标准所代替标准的历次版本发布情况为：——GB/T 5009.5-1985、GB/T 5009.5-2003；——GB 5413.1-1985、GB/T 5413.1-1997 ；——GB/T 14771-1993。
食品安全国家标准食品中蛋白质的测定1 范围本标准规定了食品中蛋白质的测定方法。
本标准第一法和第二法适用于各种食品中蛋白质的测定，第三法适用于蛋白质含量在 10 g/100 g 以上的粮食、豆类、奶粉、米粉、蛋白质粉等固体试样的筛选测定。
本标准不适用于添加无机含氮物质、有机非蛋白质含氮物质的食品测定。
第一法凯氏定氮法2 规范性引用性文件本标准中引用的文件对于本标准的应用是必不可少的。
凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本标准。
凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本标准。
3 原理食品中的蛋白质在催化加热条件下被分解，产生的氨与硫酸结合生成硫酸铵。
碱化蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后以硫酸或盐酸标准滴定溶液滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数，即为蛋白质的含量。
食品中蛋白质的测定方法
食品中蛋白质的测定方法GB/T14771-931 本标准规定了用凯氏定氮法测定食品中蛋白质的方法。
本标准适用于肉禽制品、豆制品、水产品、调味品、谷物制品、发酵制品、糕点、植物蛋白饮料等食品中蛋白质的测定。
2 引用标准GB 601 化学试剂滴定分析（容量分析）用标准溶液的制备3 原理以硫酸铜为催化剂，用浓硫酸消化试样，使有机氮分解为氨，与硫酸生成硫酸铵。
然后加碱蒸馏使氨逸出，用硼酸溶液吸收，再用盐酸标准滴定溶液滴定。
根据盐酸标准滴定溶液的消耗量计算蛋白质的含量。
4 试剂和溶液：所有试剂均为分析纯；水为蒸馏水或同等纯度的水。
4．1 硫酸铜（GB 665）。
4．2 硫酸钾（HG 3—920）。
4．3 硫酸（GB 625）。
4．4 40%氢氧化钠溶液：称取40g氢氧化钠（GB 629）溶于60mL蒸馏水中。
4．5 4%硼酸溶液：称取4g硼酸（GB 628）溶于蒸馏水中稀释至100mL。
4．6 0.1mol/L盐酸标准滴定溶液：按GB 601规定的方法配制与标定。
4．7 95%乙醇（GB 679）。
4．8 甲基红-次甲基蓝混合指示液：将次甲基蓝乙醇溶液（1g/L）与甲基红乙醇溶液（1g/L）按1+2体积比混合。
5 仪器、设备实验室常规仪器及下列各项：5．1 凯氏烧瓶：500mL。
5．2 可调式电炉。
5．3 蒸汽蒸馏装置：见图1和图2。
6 试样的制备6．1 固体样品：取有代表性的样品至少200g，用研钵捣碎、研细；不易捣碎、研细的样品应切（剪）成细粒；干固体样品用粉碎机粉碎。
6．2 液体样品：取充分混匀的液体样品至少200g。
6．3 粉状样品：取有代表性的样品至少200g（如粉粒较大也应用研钵研细），混合均匀。
6．4 糊状样品：取有代表性的样品至少200g，混合均匀。
6．5 固液体样品：按固、液体比例，取有代表性的样品至少200g，用组织捣碎机捣碎，混合均匀。
6．6 肉制品：取去除不可食部分、具有代表性的样品至少200g，用铰肉机至少铰两次，混合均匀。
蛋白质含量测定法doc
附录蛋白质测定法第一法凯氏定氮法1 钨酸沉淀法本法系通过测定供试品的总氮含量以及经钨酸沉淀去除蛋白的供试品滤液中的非蛋白氮含量，计算出蛋白质的含量。
供试品溶液的制备（1)总氮测定溶液的制备精密量取供试品1ml，用生理氯化钠溶液准确稀释至每1ml含氮量约1mg。
（2)非蛋白氮测定溶液的制备精密量取供试品2ml，加水14ml、10%钨酸钠溶液2ml、硫酸溶液（1.86→100）2ml,摇匀，静置30分钟过滤，取滤液测定。
测定法精密量取总氮测定溶液1ml，置凯氏定氮瓶中，照氮测定法（附录Ⅵ A）测定供试品中总氮含量。
同时做空白对照。
精密量取非蛋白氮测定溶液5ml，置凯氏定氮瓶中，照氮测定法（附录Ⅵ A）测定供试品中非蛋白氮含量。
按下式计算CTN（mg/ml）=（VX1-V0）×c×14.01×n×2_________________________V1CNPN（mg/ml）=（VX2-V0）×c×14.01×n×2_________________________V2CPN（mg/ml）=CTN-CNPN供试品蛋白质含量（%,g/ml）=CPN×6.25×100_______________1000式中CTN为供试品溶液总氮含量，mg/ml;CNPN为供试品溶液非蛋白氮含量，mg/ml;VX1为供试品总氮测定溶液消耗酸滴定液的体积,ml;VX2为供试品非蛋白氮测定溶液消耗酸滴定液的体积，ml;V0为空白试验消耗酸滴定液的体积，ml;c为硫酸滴定液的浓度，mol/L；CPN为供试品蛋白氮含量，mg/ml;n为供试品的稀释倍数；V1为供试品总氮测定溶液的体积，ml；V2为供试品非氮测定溶液的体积，ml；14.01为氮的相对原子质量；6.25 为常数（1g氮相当于6.25g蛋白质）。
【附注】（1)供试品蛋白质含量如超过10%（g/ml），除蛋白质时应适当加大供试品稀释倍数，10%钨酸钠溶液及硫酸溶液用量相应地按比例增加，使溶液中的钨酸浓度仍保持1%。
蛋白质的测定
蛋白质含量测定方法，是生物化学研究中最常用、最基本的分析之一。
目前常用的方法有凯氏定氮法、双缩脲法(Biuret)、紫外吸收法、考马斯亮蓝法（Bradford）。
其中Bradford 法灵敏度最高，比紫外吸收法灵敏10～20 倍,比Biuret法灵敏100 倍以上。
凯氏定氮法虽然比较复杂，但较准确，往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质。
这4种方法并不能在任何条件下适用于任何形式的蛋白质，每种方法都有其优缺点，在选择方法时应考虑：⑴实验对测定所要求的灵敏度和精确度；⑵蛋白质的性质；⑶溶液中存在的干扰物质；⑷测定所要花费的时间。
1 凯氏定氮法1. 1 原理凯氏定氮法测定蛋白质分为样品消化、蒸馏、吸收和滴定4 个过程。
其原理是样品中含氮有机化合物与浓硫酸在催化剂作用下共热消化，含氮有机物分解产生氨,氨又与硫酸作用,变成硫酸铵。
然后加碱蒸馏放出氨, 氨用过量的硼酸溶液吸收,再用盐酸标准溶液滴定求出总氮量换算为蛋白质含量。
1. 2 特点凯氏定氮法是目前分析有机化合物含氮量常用的方法，是测定试样中总有机氮最准确和最简单的方法之一，被国际国内作为法定的标准检验方法。
凯氏定氮法样品的最佳消化条件为硫酸铜2.50 g, 硫酸钾0.10 g,浓硫酸4.00 mL；硫酸铜的用量为影响消化时间的主要因素,硫酸钾和浓硫酸用量为第二和第三主要因素；用此最佳条件做实验, 消化时间仅为12 min；与其他硫酸铜、硫酸钾、浓硫酸用量方法对比,该法所需消化时间最短,试剂用量减少,可降低实验成本,也降低了对环境的污染。
凯氏定氮法适用范围广泛，测定结果准确,重现性好，但操作复杂费时,试剂消耗量大。
若采用模块式消化炉代替传统的消化装置, 可同时测定几份样品，节省时间,提高了工作效率，适用于批量蛋白质的测定,具有准确、快速、简便、低耗、稳定的优点。
2 双缩脲法(Biuret )2. 1 原理双缩脲(NH3CONHCONH3)是两个分子脲经180 ℃左右加热,放出1 个分子氨后得到的产物。
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蛋白质测定的国标规定方法——凯
氏定氮法介绍
【GB/T 5009.5—1985】
食品中蛋白质的测定方法
本标准适用于各类食品中蛋白质的测定。
1 原理
蛋白质是含氮的有机化合物。
食品与硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵。
然后碱化蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后再以硫酸或盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数，即为蛋白质含量。
2 试剂
所有试剂均用不含氨的蒸馏水配制。
2.1 硫酸铜。
2.2 硫酸钾。
2.3 硫酸。
2.4 2%硼酸溶液。
2.5 混合指示液：1份0.1%甲基红乙醇溶液与5份0.1%溴甲酚绿乙醇溶液临用时混合。
也可用2份0.1%甲基红乙醇溶液与1份0.1%次甲基蓝乙醇溶液临用时混合。
2.6 40%氢氧化钠溶液。
2.7 0.05N硫酸标准溶液或0.05N盐酸标准溶液。
3 仪器
定氮蒸馏装置：如图所示。
（图略）
4 操作方法
4.1 样品处理：精密称取0.2～2.0g固体样品或2～5g半固体样品或吸取10～20ml液体样品(约相当氮30～40mg)，移入干燥的100ml或500ml定氮瓶中，加入0.2g硫酸铜，3g硫酸钾及20ml硫酸，稍摇匀后于瓶口放一小漏斗，将瓶以45°角斜支于有小孔的石棉网上。
小心加热，待内容物全部炭化，泡沫完全停止后，加强火力，并保持瓶内液体微沸，至液体呈蓝绿色澄清透明后，再继续加热0.5h。
取下放冷，小心加20ml水。
放冷后，移入100ml容量瓶中，并用少量水洗定氮瓶，洗液并入容量瓶中，再加水至刻度，混匀备用。
取与处理样品相同量的硫酸铜、硫酸钾、硫酸按同一方法做试剂空白试验。
4.2 按图装好定氮装置，于水蒸气发生瓶内装水至约2/3处，加甲基红指示液数滴及数毫升硫酸，以保持水呈酸性，加入数粒玻璃珠以防暴沸，用调压器控制，加热煮沸水蒸气发生瓶内的水。
4.3 向接收瓶内加入10ml 2%硼酸溶液及混合指示液1滴，并使冷凝管的下端插入液面下，吸取10.0ml样品消化稀释液由小玻杯流入反应室，并以10ml水洗涤小烧杯使流入反应室内，塞紧小玻杯的棒状玻塞。
将10ml 40%氢氧化钠溶液倒入小玻杯，提起玻塞使其缓缓流入反应室，
立即将玻塞盖紧，并加水于小玻杯以防漏气。
夹紧螺旋夹，开始蒸馏。
蒸气通入反应室使氨通过冷凝管而进入接收瓶内，蒸馏5min。
移动接受瓶，使冷凝管下端离开液面，再蒸馏1min。
然后用少量水冲洗冷凝管下端外部。
取下接收瓶，以0.05N硫酸或0.05N盐酸标准溶液滴定至灰色或蓝紫色为终点。
同时吸取10.0ml试剂空白消化液按4.3操作。
4.4 计算
式中：X——样品中蛋白质的含量，%；
V1——样品消耗硫酸或盐酸标准液的体积，ml；
V2——试剂空白消耗硫酸或盐酸标准液的体积，ml；
N——硫酸或盐酸标准溶液的当量浓度；
0.014——1N硫酸或盐酸标准溶液1ml相当于氮克数；
m——样品的质量(体积)，g(ml)；
F——氮换算为蛋白质的系数。
蛋白质中的氮含量一般为15～17.6%，按16%计算乘以6.25即为蛋白质，乳制品为6.38，面粉为5.70，玉米、高粱为6.24，花生为5.46，米为5.95，大豆及其制品为5.71，肉与肉制品为6.25，大麦、小米、燕麦、裸麦为5.83，芝麻、向日葵为5.30。
附加说明：
本标准由全国卫生标准技术委员会食品卫生标准分委员会提出，由卫生部食品卫生监督检验所归口。
本标准由卫生部食品卫生监督检验所负责起草。