小鼠胚胎成纤维细胞的分离和培养
iPS细胞制备技术
iPS细胞制备技术随着对iPS细胞重编程机制研究的不断深入，iPS细胞的制备体系不断完善，目前iPS细胞的制备方法多种多样，但以Yamanaka的“四因子”诱导体系较为经典，本书在此简要阐述此制备方法。
一、小鼠iPS细胞制备【实验步骤】1.建立小鼠胎儿成纤维细胞系（1）脱颈处死13.5天孕鼠，分离出子宫并用PBS浸洗。
（2）用手术镊将胚胎从胎盘和周围膜系组织分离开，去除头、性腺和内脏组织。
（3）将胚胎转移至一个新100mm皿进行PBS清洗，剪刀剪碎组织，放于含有0.1%胰酶/0.1mmol/L EDTA溶液的50ml离心管，于37℃消化20分钟，重新加酶，再次消化。
（4）加入等体积FP溶液（含10%FBS，50U&50mg/ml青霉素和链霉素的DMEM）中止消化，吹打数次以帮助组织破碎。
（5）室温（20～25℃）放置5分钟以沉降大块组织，取上悬液体于离心管进行离心，1200r/min×5min，弃上悬液并用新鲜液体重悬。
（6）计数细胞，并调节细胞浓度至1×106/ml。
一般约1×107细胞/胚胎，1×107细胞/100mm皿于37℃，5%CO2培养24小时。
（7）次日，PBS清洗去除未贴壁细胞，待细胞铺满皿底，换掉FP液，用PBS清洗一次，1ml 0.05%胰酶/0.53mmol/L EDTA消化5分钟，加入9ml FP液并吹打成细胞悬液，传代按1∶4进行（用于iPS 诱导的MEFs代次最好选用3代以内）。
2.饲养层细胞准备（1）复苏 SNL 细胞1）由液氮罐中取出SNL冻存管，迅速放入37℃水浴锅中，并晃动冻存管直到融化。
2）乙醇擦拭冻存管盖及冻存管壁，将管内冻存悬液转移入预先准备的SNL液体中，800r/min×5min，弃去上液。
3）重新加入10ml SNL液体重悬细胞，转入明胶铺被的100mm皿中，于37℃，5%CO2培养至细胞80%～90%汇合。
一种小鼠或大鼠真皮成纤维细胞的分离培养方法
一种小鼠或大鼠真皮成纤维细胞的分离培养方法真皮成纤维细胞是一种重要的细胞类型，其在生物医学研究、组织工程和再生医学等领域具有广泛的应用前景。
以下是一种常用的小鼠或大鼠真皮成纤维细胞的分离培养方法：1. 实验前准备：- 小鼠或大鼠- 麻醉剂，如异氟醚等- 消毒剂- 必需的培养基和培养液2. 小鼠/大鼠的取材：- 麻醉小鼠或大鼠，确保其在实验过程中不会感到疼痛或不适。
- 消毒动物的表面，以减少细菌或其他微生物的污染。
- 取下小鼠/大鼠的皮肤。
使用消毒剪刀和镊子将皮肤切割成小块，以便后续的分离过程。
3. 细胞的分离和培养：- 将皮肤块转移到含有酶解消化液（如胰蛋白酶）的培养皿中，并在37°C的恒温搅拌器上进行酶解（通常为1-2小时）。
- 将酶解后的皮肤块过滤，移至新的培养皿中，加入培养基和培养液，如DMEM/F12或RPMI-1640，并添加10%胎牛血清。
- 将培养皿放在37°C的细胞培养箱中，保持适当的温度、湿度和CO2浓度。
- 培养皿中的细胞会开始生长和扩增。
定期更换培养基，并进行细胞的孵育以保持其正常生长。
4. 细胞的传代：- 当细胞密度达到80-90%时，使用胰蛋白酶或胰蛋白酶-EDTA溶液将培养皿中的细胞与培养皿底部松散的连接断开。
- 将细胞计数，并根据需要的细胞数量进行传代。
一般情况下，将细胞按照1:3或1:4的比例重新分装到新的培养皿中。
- 重复上述步骤，直到获得足够数量且健康的细胞。
这种方法能够有效地分离和培养小鼠或大鼠真皮成纤维细胞，为相关研究提供了重要的细胞资源。
通过优化培养条件和细胞的传代方法，可以获得高质量和稳定的细胞群体，以支持各种实验或应用的需要。
小鼠胚胎成纤维细胞原代培养实验具体步骤及方法
小鼠胚胎成纤维细胞原代培养实验具体方法及步骤将小鼠的胚胎成纤维细胞（MEF）从机体中取出，经胰酶、螯合剂（常用EDTA）处理，分散成单细胞，置MEF生长培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖。
一、实验材料准备1. 动物孕期14至16天的孕鼠(小鼠)。
2. 试剂无Ca2+和Mg2+的PBS(D-PBS)、0.05%胰酶、0.53 mmol/L EDTA溶液、MEF生长培养基(高糖DMEM加10%FBS)。
3. 器械眼科直剪3把、眼科直镊3把、眼科弯镊2把、玻璃平皿3套、200目尼龙滤网、50 ml 和15 ml离心管和手术刀片。
以上物品均需要高压灭菌消毒处理。
二、具体操作1. 处死孕鼠，全身置于75%酒精里浸泡，然后在超净台中用剪刀和镊子将孕鼠皮肤剪开，用另外一组剪刀、镊子剪开腹部肌层，露出子宫，最后用第三组剪刀和镊子将子宫小心取出放在盛有D-PBS的玻璃平皿中，冲洗去血。
2. 用两把弯镊子将胚胎外的胞膜小心去除，然后夹掉头和内脏，将其余胚胎转移到一个装有30 ml D-PBS的50 ml离心管中，轻轻颠倒两次，倒掉D-PBS，再重复此步骤一次，注意要留少许D-PBS，然后将胚胎转移到另一装有D-PBS的平皿中，并用手术刀片将其细细切碎。
3. 用200 ul的移液枪反复、快速地吹打平皿中的液体，转移至15 ml离心管中，于4℃1500 rpm离心5分钟，倒掉上清，以10 ml胰酶重悬沉淀，放在37℃水浴中消化30分钟，且每隔五分钟轻轻晃动，使之充分消化。
4. 将上层细胞悬液倒入一个装有10 ml MEF生长培养基的50 ml离心管中，用200目的尼龙网过滤后，以1 500 rpm离心5分钟收集细胞，再用30 ml MEF生长培养基洗涤两次。
5. 细胞沉淀用15 ml MEF生长培养基重悬后进行细胞计数(一般8只14天的胎鼠可获得2-3x107细胞)。
6. 3x106细胞悬浮于15 ml MEF生长培养基中，接种到200 ml培养瓶中。
动物克隆 第三章胚胎干细胞分离培养
第三章胚胎干细胞分离培养1981年，Evens等首次发现小鼠胚胎干细胞(embryonic stem cells，ESCs)在体外具有稳定增殖并维持未分化状态及分化全能性潜能的特性，并成功建立小鼠ESCs系[1]。
由于ESCs独特的生物学特性，ESCs方面的研究迅速成为生命科学研究领域的热点之一，1999年－2000年连续两年被评为世界十大科技新闻。
ESCs已成为分子遗传学、发育生物学、细胞工程、组织工程等研究的重要工具，在研究细胞分化机制、临床治疗、转基因等方面有着重要的意义。
随着对干细胞研究的不断深入，人们将逐渐掌握和利用干细胞，还将推动相关学科的发展。
文章综述了ESCs的研究概况、体外分离培养、生物学特性、鉴定方法、影响ESCs分离培养的因素、存在问题以及应用前景等。
1 胚胎干细胞研究概况ESCs的研究最早要追溯到畸胎瘤细胞的发现，但真正意义上的开始却是1981年Evens等首先从延缓着床的胚泡分离培养到小鼠的ESCs，并建立小鼠的ESCs系，之后ESCs研究迅速发展，已在大鼠、仓鼠、猪、牛、水貂、兔、山羊、绵羊、恒河猴和人等多种哺乳动物上建立了类ESCs系[2]。
近几年来，ESCs研究在ESCs来源与培养方法、探索建立和维持ESCs系的条件、定向诱导分化、遗传操作、疾病动物模型的治疗等方面取得了一定的进展。
研究人员利用体细胞核移植技术进行胚胎重建，从克隆胚胎中成功得到小鼠、兔和人等多种哺乳动物ESCs[3-5]；利用孤雌激活技术建立小鼠和非人灵长类孤雌激活胚胎源的ESCs系[6]，这些为ESCs的分离克隆开辟了新的途径。
利用定向诱导分化技术成功将ESCs分化为造血细胞、内皮细胞、肝细胞、脂肪细胞、软骨细胞、神经细胞、胰岛细胞、心肌细胞、成骨细胞，甚至滋养层细胞和生殖细胞等所有3 个胚层的细胞类型[7-13]。
试验表明，人ESCs 能有效治疗心肌梗死、糖尿病、中风等疾病。
国内在ESCs方面的研究起步较晚，但发展迅速，在相关领域做了大量的研究。
细胞的原代培养
细胞原代培养【实验目的】1.理解细胞原代培养原理2.熟悉细胞原代培养方法与过程3.了解细胞原代培养的应用4.独立进行细胞原代培养操作【实验原理】1、原代培养实验原理细胞培养是生物学和医学研究中最常用的手段之一，可分为原代培养和传代培养两种。
原代培养是直接从生物体获取组织或器官的一部分进行培养，即组织直接从机体获取后,通过组织块长出单层细胞,或者用酶消化或机械方法将组织分散成单个细胞开始培养,在首次传代前的培养可认为是原代培养。
由于培养的细胞刚刚从活体组织分离出来，故更接近于生物体内的生活状态。
这一方法可为研究生物体细胞的生长，代谢，繁殖提供有力的手段。
同时也为以后传代培养创造条件。
原代培养的过程指动物的组织或器官从机体取出后，经机械法或各种酶类（常用胰蛋白酶）和鳌合剂（常用EDTA)处理，使之分散成单个细胞,加入适量培养基，置于合适的培养容器中，在无菌、适当温度和一定条件下，使之生存、生长和繁殖的过程。
原代培养的方法有：a.组织块法:在平皿中用弯头剪把组织尽量剪碎，每个组织块小于1mm3大小。
用Hanks液洗涤2—3次，自然沉淀。
用吸管吸去上清液。
将组织块贴于培养瓶进行培养。
b.酶消化法:将1mm3大小的组织块放入1个三角瓶内加入10—30ml的0.125%的胰蛋白酶。
370C磁棒搅拌消化20－30分钟。
然后终止消化。
用几层无菌纱布过滤。
取过滤液，离心800rpm 5—10分钟收集细胞。
弃上清，加入带有双抗的培养基，放入培养瓶培养。
【实验仪器、材料、试剂及用品】1.仪器：荧光显微镜，CO2培养箱2.材料：孕鼠3.试剂：(1) 培养液：为DMEM，添加10％新生牛血清(NBS)、青霉素100 u／ ml 、链霉素100ug／ml。
(2)消化液：为0.125％胰蛋白酶—0.02％EDTA 混合消化液。
4.用品：镊子，剪刀，培养瓶，试管，移液管，巴斯德吸管，废液缸，75％酒精棉球，酒精灯、小指管。
【实验步骤】(一)小鼠胚胎的准备:1.取怀孕16～18d的母鼠，断颈处死，置于75%的酒精中。
成年小鼠心肌成纤维细胞的分离和原代培养
成年小鼠心肌成纤维细胞的分离和原代培养物品准备：6-8周成年小鼠、眼科剪、眼科镊、75%酒精、PBS缓冲液、细胞培养皿、细胞培养瓶、15ml细胞离心管、恒温水平摇床、低速水平离心机、倒置显微镜、DMEM/F12细胞培养基、胎牛血清、胶原酶II、胰蛋白酶等。
操作步骤：（1）取出2只成年小鼠心脏，并将它们置于含有冰冷的PBS的培养皿中。
（2）将心脏置于无菌细胞培养皿中，并在无菌条件下进行操作。
使用剪刀将心脏切成10块，使用解剖刀将它们缩小至1mm的尺寸。
（3）将组织小块移到盛有PBS的无菌细胞培养皿中，清洗后弃去PBS。
（4）加入2ml消化缓冲液并在37℃恒速水平摇床下消化组织5分钟。
注意：摇床速度应调整至80r，以使所有组织片流动并且不会坐在底部，但不应太强以至不能破坏细胞。
消化酶（胶原酶II: 1mg/ml，胰酶: 0.75mg/ml）（5）将混合物放置1分钟，使组织沉淀并丢弃含有碎片和血细胞的上清液。
（6）加入2ml消化缓冲液并在37℃恒速水平摇床下消化组织30分钟。
（7）将混合物放置１分钟使组织沉淀到底部，并用移液管收集上清液。
不要收集倾向于漂浮的组织碎片。
（8）将上清放入含有2ml成纤维细胞培养基的15ml细胞离心管中。
（9）800r，离心5min。
（10）将细胞重悬于3-4ml培养基中。
（11）重复步骤6-10，直到所有组织溶解（通常7-10次）。
（12）将细胞悬液平铺到细胞培养皿瓶中，并在37℃下在具有5%二氧化碳的细胞培养箱中培养２小时。
（13）２ｈ后显微镜下观察细胞汇合。
此时成纤维细胞类似于小圆点。
（14）收集并丢弃上清液。
用2.5ml温热的PBS洗涤３次，并用10ml 新鲜的成纤维细胞培养基补充。
在37℃和5%二氧化碳的细胞培养箱中培养。
3T3-L1脂肪前体细胞
细胞名称3T3-L1小鼠胚胎成纤维细胞，也称3T3-L1脂肪前体细胞
细胞描述3T3-L1是从Swiss-3T3小鼠胚胎中分离克隆的细胞株，该细胞有接触性抑制生长特征且能向脂肪样细胞分化，高血清培养液可促
进细胞脂肪积累等
动物种别小鼠
组织来源胚胎
细胞形态成纤维细胞（长梭形）
培养条件高糖DMEM培养液，含10%胎牛血清和1%青链霉素
High glucose DMEM medium with 10% fetal bovine serum, 100
IU/ml penicillin and 100 g/ml streptomycin in the humidified
atmosphere with 5% CO2 and 95% O2 at 37℃
细胞传代以50 ml细胞培养瓶为例说明：
1．无菌PBS轻轻洗涤细胞1或2次（每次约4 ml PBS）；
2．倒掉PBS后再加入4ml PBS，将细胞培养瓶翻转；
3．加入0.25%胰酶和0.02%EDTA的溶液约1ml，拧紧细胞培养瓶盖，轻轻混匀；
4．在镜下观察细胞形态，当细胞稍稍变圆，轻轻并立即翻转培养瓶，终止消化（消化时间与细胞状态有关）；
5．倒掉胰酶加入适当培养液，轻轻吹打瓶壁，使细胞脱落分散；
6．细胞悬液一分为二，继续传代培养（避免密度过高导致细胞分化）。
昆明种小鼠胚胎干细胞的分离、培养与鉴定
ｒｕｄｃｌ ，ｔｅｎ ｃ ｕ ｅ ｒｅａｄｔ ｔ ａｋ ｄ Ｋ ｏｉｖ ｔｉｉｇ ｏ ｎ ａ ｄｉ ｏ ｎ ｅ ｓ ｈ ｕｌ ｓｗ ｒ ｌ ｇ ｇ ｌ ｐｃｅ ．Ａ Ｐｐ ｓｉ ｓ ｎｎ ｌ ｙｗ ｓｒ ｄｓ ｅ ｅａ ｎ ｉ ｙ ｈ ｔｅ ａ ｃｏ ｅ ｈ—ｂｏ ｎｏ ｌｅ ｉｒｂａｔ ｅ ｓ ｒ ｉｅｅｔ ｔ ｒｗ ｒ ｕ ，ｆ ｏ ｌ Ｈ ｆ ｒ ｉ ｅ ｂ ｂ ｓｃ ｏ ｄ ｎ ａｄ
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昆 明 种 小 鼠胚 胎 干 细 胞 的 分 离 、 养 与 鉴 定 培
陈 明玉（ 大连铁 路 卫生 学校 辽 宁 大连 １６ ０ ） １０ １
ｃＨ ｅ ｉ ｔ ｅ ｏ ｒ ｏｏｅｓ ｎｉ ｖｒ ｓｅｓ ｎｃｌ ｒ， Ｓｃｌ ｉｓ ａ ｒ ｉｐｅｅ ｒｏ ｏｉｓ（ Ｂ ） ａｄＥ ｓ ｈｗ ｄｏｔａｄ ｅ ｓｗ ｒ ｌ Ｈｗｏ ｌｒ ｓ。Ｉ ｉｏｓ ｐｎｉ ｕｔ ｅ Ｅ ｏｏ ｅ ｎｆ ｍ ｓ ｌ ｍｂｙｉ ｂｄｅ Ｅ ｓ ， Ｂ ｏ ｅ ｕｗ ｅ ｇ ｙ ｈ ｃ ｌ ｎ ｔ ｕ ｏ ｕ ｎ ｃ ｏ ｍ ｄ ｎ ｓ ｒ
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小氯歴於成纤维细胞的分离和培养、实验材料1. 主要仪器役备(1) 倒置显微镜(Olympus, Japan)(2) CO2培养箔(BB16HF,上海力申科学仪器有限公司)(3) 100ml 的玻璃焙养瓶(江苏海门市大路塑料实验仪彖厂)(4) 6孔培养板(COSTA, R 每孔直径为3.5cm)(5) Eppendroff 管(6) 1ml,2ml,5ml 的玻璃摘管各30支；10ml 尖底禽心管和直径为8cm 的平皿(7) 雳心机(8) 5ml 冻存管(9) 两套小亂用解刘器械(包括眼科剪和眼科＜)2. 主要试利配制(1) MEF(mouse embryo fibroblast ,小亂軀於成纤维细胞)培养液---- 低糖DMEM 母液1) 用一个1000ml 的大烧杯加入1000ml 无蔺无内毒素的超纯木(购自福州新北生化工业有限公 司)； 2) 将一小软低DMEM(GIBCO/BRL,Cat.No.31600-034)全部加入上述水中，同时轻轻搅拌，幷冲 洗 包装袋的内面以冼下所有的粉未。
3) 每升培养基中添加3.7gNaHCO3。
4) 搅拌直至完全涿鮮。
5) 用1NHCI 或1NNaOH 调培养基的pH 至比最终的工作液的PH 低0.2-0.3 ,调好PH 后，将彖器•密 封01该实验中用1NHCI 调PH 至7.3 )o6) 立即用0.22um 的滤彖过德除菌，装入需压过的盐木瓶中，4°C 保(1存个月内用完)。
----------------- MEF 培 养液取100ml 上述配好的低穗DMEM 液体，加入10000IU 青霉素钠(6.25mg )和10mg 链霉素，溶鮮后再次 调节PH 至7.3,经0.22um 的滤黑过滤至壽压过的血请瓶中，再添加 10ml 分装好的新 生牛血请(Newborn Calf Serum, GIBCO/BRL,需 56°C, 30min 夭涪过)，4°C 保存至使用。
⑵ PBS疫500ml 超纯水中依次溶入NaCIKCINa 2HPO4.12HO 2KH2PO4 于121 °C 壽压夭苗30min 或经0.22um 的滤器过滤除菌再分裝入100ml 洁净灭菌的盐水瓶 中, 再放入4°C 冰箔中保存备用。
(3) 0.25%胰養自酶一0.02%EDTA 混金请化液4 100ml 超纯水中分别溶鮮4.0g 0.1g 1.445g 0.1g胰養自酶干粉仃rypsin, Sigma,T4799) 0.25gEDTA 0.02gNaCI 0.7gNa2HPO4.12HO2 0.024gKH2PO4 0.024gKCI 0.037gTris 0.3gD■葡萄糖酚红0.1g于4°C过夜，使之充分涿鮮，用1mol/IHCI调PH至7.6, 0.22um的滤器过滤除菌，在一10〜30°C 下冻存备用O(4) 0.1%的朗胶木涿液称朗胶0.1 g (Sigma, G—9391)涿于100ml超纯木中，先加热涿鮮，再分装入20ml的血请瓶中于121°C 壽压灭菌45min,于4°C保存。
(5) 10ug/ml的丝裂霉素C工作液1) 0.5mg/ml的丝裂霉素C母液疫盛有2mg丝裂霉素C的小瓶中加入4ml需压夭茵的PBS,用需压夭窗的尖嘴0昆匀。
即得0.5mg/ml的丝裂霉素C母液。
注：此步应农胶卷暗盒内操作，然后于4°C避光保存。
2) 10ug/ml的丝裂霉素C工作液在24.5ml的MEF培养液中加入0.5ml的0.5mg/ml的丝裂霉素C母液，并经0.22um的滤器过滤至25ml 血请瓶中。
用前临时配制，并A 37°C的CO2培养箔中预温.30min.。
(6) 冻存液取2 X 1.5ml Eppendroff管，每管均加入0.9ml DME(M低糖型)培养液和0.1ml二甲基亚矶(DMSO, AR 纯，中国医药集团上海化学试利公司)，置4°C冰箔中预冷60min o3.动杨：性成熟期即大于8周龄昆朗种小勺亂，领自福建医科丸哮实睑动物中心。
、实验步骤1. 获取小亂軀於⑴将8周龄的昆自早亂和12周蛉的昆勺g按1:1比例金笼。
(2) 次可嚴10:00前观寨¥魚阴遒口，有乳自色或蛋黄色胶冻状物(阴遒栓)即爱为怀孕0.5夭。
(3) 实验肘断硕处死孕13.5天的母亂，置于蜡盘上。
(4) 75%酒精谄毒后，用普通剪刀和镶子剪开下腹皮肤，并用两把弯头止血钳夹住切口处的皮朕向头尾两側李拉即剥发。
(5) 用眼科弯锁和眼科弯剪打开腹腔，暴療出子玄。
(6) 用眼科住一側子言，分需子言糸朕，服科弯剪剪断子言角和子言颈，将整个子言分禽下来 (注意勿使子富滑落到腹腔外，避免污染)。
(7) 将子玄置于无菌滤绒上去除血迹。
(8) 在超净台内将子玄移入预先盛有PBS的平皿中，洗涤数次。
(9) 将子言移入另一盛有PBS的平皿中，用服科弯剪沿子言糸朕打开子言，取出带有於朕的於亂，并用两把服科钱子剔除於朕，取出於魚(一般有12只)。
(10) 将■於亂移入另一盛有PBS的平皿中，用眼科剪和眼科饮去除於亂的头、叨肢和内脏，得魚歴躯干。
(11) 将魚歴躯干移至另一盛有PBS的平皿中，用PBS洗涤两次至无肉眼可见的血色。
2. 小亂胆於成纤维细胞的原代培养(组织块培养法)(1) 将干净的舗軀躯干移至青霉素小瓶内(毎6个亂軀躯干装1瓶)，用眼科直剪充分剪碎，剪成约1mm3 以下的碎块(需剪约200 T)o(2) 用5ml的刻度吸管每瓶加入约3ml的PBS,混匀后连同舗軀碎块一起移至一尖底禽心管中。
(3) 室温下静置5min,用刻度哌管吸去上请液，霧下亂軀组织碎块。
(4) 向装有魚軀碎块的禽心管内加入1ml0.25%胰蛋自酶一0.02%EDTA混合葡化液，轻轻吹吸30秒(可见组织块变得较为粘稠)。
(5) 再加入1 mIMEF培养液终止谄化，室温下静置5min o(6) 吸去上请液，留下舗軀组织碎块沉淀。
(7) 毎个禽心管内加入5mlMEF培养液悬浮亂歴组织块，并接种到100ml的螺口的培养瓶中(接种时应用谪管将组织块混匀)。
(8) 做好标记(如培养目期，细胞名称，编号)，将装有氯軀组织碎块的培养瓶放入37°C, 5%CO2, 100%RH的焙养箔中培养。
(9) 培养的头两天不要晃动培养瓶，第三夭可以观痙，可见组织碎块附着于培养瓶底，周囲细胞呈放射状生长，此时有多种细胞类型，有的是呈梭形的成纤维细胞，有的是星圖形的上皮细胞。
如果细胞己全部长满则可谄化传代，如果未全部长满则可3/4换液或全量换液。
3. 小亂胚於成纤维细胞的传代培养：(1) 用滴管吸弃焙养瓶中的培养液和未贴壁生长的组织块。
(2) 毎瓶用厲管加入约3ml的PBS,轻轻前后晃动焙养瓶，洗涤细胞一遍，哌弃PBSo(3) 毎瓶用厲管加入约2ml的0.25%肢蛋仓酶一0.02%EDTA混合荫化液，能盖住培养瓶底，•室温下静置作用30秒，吸弃葡化液。
(4) 疫倒置镜下观寨，当细胞雯圆时即可加入4—5mllMEF培养液终止淸化，并用摘管吸堆养液用力吹打整个瓶底(约30T)o(5) 将培养物全部吸置尖底禽心管内，特置5min,将上层细胞悬液吸置另一禽心管内。
(6) 1000r/min ( 80-1富心机为80g)需心5min,吸弃上请液。
(7) 毎瓶加入3mlMEF培养液悬浮细胞沉淀块，并分装至3个100ml的培养瓶中。
(8) 毎个培养瓶再补加4ml的MEF培养液，并吹打混匀细胞(吹打肘勿产生气泡) 。
(9) 将创请化传代的细胞疫倒置镜下观痙，可见细胞呈大小不一的圆形。
(10) 将装有谄化后细胞的焙养瓶放入37°C, 5%CO2, 100% RH的培养箔中培养。
(11) 约2天后，细胞可贴壁长满，继续按1:3葡化传代(操作同前，省略步骤5中的静置和换管)。
4. 饲养层制备(1) 朋胶预包彼培养板：取1个6孔焙养板(COSTAR毎，孔直径为3.5cm),先紫外照射30min,毎孔用5ml id度滴管加入3ml的0.1%朋胶水涿液，使其能覆盖孔的底部，室温下静置2h以上，用前吸弃朋胶木涿液，并用2ml的PBS洗涤一遍。
(2) 丝裂霉素C作用2小时：将3瓶细胞生长连成一片的第3代MEF的焙养液吸弃，每瓶加入3ml10ug/ml的丝裂霉素C工作液，再放入37°C、5%CO2. RH100%的培养箔中焙养2h。
(3) 2小时后，吸弃培养瓶中的丝裂霉素C工作液，用预温的PBS洗涤细胞5次，毎次3ml(加样时厲管靠疫培养瓶的上壁或御壁，勿直接冲冲击底壁的细胞)。
(4) 荫化：毎瓶中加入2ml0.25%胰蛋勺酶一0.02%EDTA谄化液，室温下作用10秒，立即浹弃谄化液，加入3mlMEF培养液终止荫化，并吹打壁底细胞(应注意逐瓶操作，避免荫化肘间过长而使细胞丢夬过多)O(5) 需心：将所有细胞悬液分吸至2个10ml尖底禽心管内，1000r/min需心5min,弃上请，得细胞沉淀块，往一个富心管的沉淀块内加入3ml的M EF培养液混悬细胞，再吸至另一富心管中混悬沉淀块O(6) 计数并调整密度：吸出混悬后的细胞悬液50ul用血细胞计数板计数混合后细胞悬液的密度，然后将细胞悬液吸至一焙养瓶或血请瓶中，补加适量的MEF培养液调整细胞•密度为3x105个/ml o(7) 接种：毎孔加3 ml密度为3X1CP个/ml的细胞悬液(因为培养孔的直径为 3.5cm,故其底面积S=Tn2=3.14x1.75 2=9.42 cm2,根据接种的细胞数为1x10 5 4^/cm2,所以每孔可加3 ml密度为3x105 个/ml的细胞悬液)o(8) 培养：将接种好经丝裂霉素C作用过MEF的6孔板放入37°C、5%CO2. RH(相对渥度)100%的培养4q中培养。
5.饲养层细胞的冻存和复苏实验'(1)冻存1) 细胞：镜松，将处于对数生长期的小亂軀於成纤维细胞用于冻存实验。
弃旧培养液，后以PBS 或新鮮培养液漂冼细胞一次。
2) 请化：常规0.25%胰蛋自酶- 0.02%EDTA葡化制备单细胞悬液。
3) 需心重悬：80g富心10min,弃上请，以冻存液悬浮细胞，分装到冻存管中。
4) 冻存：细胞逐级阵温.冷冻：40C冰箔40min -200C冰箔40min -800C冰箔保存备用。
(2)复苏培养1) 冻融：从低温冰箔中取出冻存细胞，置于37°C水浴锅内，不肘振摇冻存管，使细胞快速融化。
2) 洗涤：转移冻存管内细胞于离心管中，80g禽心5min,弃上请，沉淀用含新鮮DME(M低糖型)重新悬浮，制备单细胞悬液。