基因治疗PPT课件
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基因治疗PPT课件
善疾病的一种治疗手段。
基因治疗是治疗基因突变性疾病的一项根本 性措施，同时它为非基因突变性疾病提供了一 个新的治疗手段。
二、基因治疗的策略
两个基本策略: 原位矫正病变基因 基因取代或基因干预
(一)原位矫正病变基因(纠正异常碱基)
图11-1 镰形红细胞贫血病人的Hb为HbS(由β 珠蛋白基因点突变引起)
2.基因表达持续时间短； 3.许多问题仍需求助病毒或病毒 成分解决。
3.免疫原性低，急性毒性小，对
受试者比较安全；
4.可具有特异靶向性，并能转移 至非分裂期细胞并有效表达；
5.制备方便且重复性好，具有完 全人工合成和大规模生产可行性， 因此较简单和廉价。
（一）脂质体介导的转移方法
1.方法 用一定比例的磷脂酰胆碱和磷脂酰丝氨酸→共 溶于氯仿→制备成双层磷脂的封闭囊泡→超声波处理→ 将待转移外源基因DNA包入→制备成脂质体/质粒 DNA复合物→利用其能与细胞膜融合的特性，可将质 粒DNA转入细胞中。 2.优点 脂质体作为载体可以携带各种DNA片段，且 在转移途中保护基因不被核酸酶降解。 3.缺点 转移效率低、制备麻烦、商品较贵。
一.病毒载体——转基因的生物学方法
逆转录病毒载体
（一）逆转录病毒的生活（命）周期 （二）逆转录病毒的基因组结构 (三) 逆转录病毒载体结构功能特点 (四) 重组逆转录病毒载体结构 （五）重组逆转录病毒的制备 （六）重组逆转录病毒基因转移系统 （七）逆转录病毒载体介导基因转移的安全性问题
（一）逆转录病毒的生活（命）周期
（六）重组逆转录病毒基因转移系统
1．逆转录病毒介导基因转移的靶组织细胞
靶细胞的最基本要求: 细胞表面具有逆转录病毒相应的受体
最常用作基因治疗的靶有： 骨髓干细胞、成纤维细胞、淋巴细胞、 肝细胞、血管内皮细胞和肌细胞，还包 括所有的肿瘤细胞
基因治疗是治疗基因突变性疾病的一项根本 性措施，同时它为非基因突变性疾病提供了一 个新的治疗手段。
二、基因治疗的策略
两个基本策略: 原位矫正病变基因 基因取代或基因干预
(一)原位矫正病变基因(纠正异常碱基)
图11-1 镰形红细胞贫血病人的Hb为HbS(由β 珠蛋白基因点突变引起)
2.基因表达持续时间短； 3.许多问题仍需求助病毒或病毒 成分解决。
3.免疫原性低，急性毒性小，对
受试者比较安全；
4.可具有特异靶向性，并能转移 至非分裂期细胞并有效表达；
5.制备方便且重复性好，具有完 全人工合成和大规模生产可行性， 因此较简单和廉价。
（一）脂质体介导的转移方法
1.方法 用一定比例的磷脂酰胆碱和磷脂酰丝氨酸→共 溶于氯仿→制备成双层磷脂的封闭囊泡→超声波处理→ 将待转移外源基因DNA包入→制备成脂质体/质粒 DNA复合物→利用其能与细胞膜融合的特性，可将质 粒DNA转入细胞中。 2.优点 脂质体作为载体可以携带各种DNA片段，且 在转移途中保护基因不被核酸酶降解。 3.缺点 转移效率低、制备麻烦、商品较贵。
一.病毒载体——转基因的生物学方法
逆转录病毒载体
（一）逆转录病毒的生活（命）周期 （二）逆转录病毒的基因组结构 (三) 逆转录病毒载体结构功能特点 (四) 重组逆转录病毒载体结构 （五）重组逆转录病毒的制备 （六）重组逆转录病毒基因转移系统 （七）逆转录病毒载体介导基因转移的安全性问题
（一）逆转录病毒的生活（命）周期
（六）重组逆转录病毒基因转移系统
1．逆转录病毒介导基因转移的靶组织细胞
靶细胞的最基本要求: 细胞表面具有逆转录病毒相应的受体
最常用作基因治疗的靶有： 骨髓干细胞、成纤维细胞、淋巴细胞、 肝细胞、血管内皮细胞和肌细胞，还包 括所有的肿瘤细胞
基因治疗PPT课件
(一) 直接策略：
• 针对致病基因
(二) 间接策略：
• 导入与致病基因无直接联系的治疗基因
(一)直接策略
1. 基因矫正（gene correction） 2. 基因置换（gene replacement） 3. 基因增补（gene augmentation）
又称为补偿性基因治疗 4. 基因失活（gene inactivation）
1990年9月14日，世界首例基因治疗：SCID
感染性疾病的基因治疗
• 引入治疗基因来抑制病原繁殖
• 方法: 1. Anti-sense 2. Ribozyme RNA
肿瘤基因治疗临床试验方案
黑色素瘤 83 前列腺癌 44
基因治疗
Gene therapy
传统治疗方法
1. 药物治疗 2. 手术治疗 3. 放射治疗 4. 理疗
• 新的生物治疗： • 基因治疗(gene therapy)
基因治疗
一、概念 二、策略 三、基本流程 四、应用与展望
一、基因治疗的概念
• Gene therapy is a medical intervention based on modification of genetic materials in living cells.
(3) 药物增敏基因治疗
• 将外源基因插入肿瘤细胞后，改变肿瘤细胞对 药物的敏感性。
• 如将钙调素基因转入癌细胞，利用其对癌细胞 MDR的逆转作用，使癌细胞对化疗药物的敏感 性明显提高。
3. 其它策略
(1) 特异性细胞杀伤 (2) 多基因转染
特异性细胞杀伤
• 指利用重组DNA技术将生物来源的细胞毒素基 因与一些特异受体的配体基因融合，构建融合 基因，导入高度表达该受体的肿瘤细胞，以特 异性杀伤该肿瘤细胞。
• 针对致病基因
(二) 间接策略：
• 导入与致病基因无直接联系的治疗基因
(一)直接策略
1. 基因矫正（gene correction） 2. 基因置换（gene replacement） 3. 基因增补（gene augmentation）
又称为补偿性基因治疗 4. 基因失活（gene inactivation）
1990年9月14日，世界首例基因治疗：SCID
感染性疾病的基因治疗
• 引入治疗基因来抑制病原繁殖
• 方法: 1. Anti-sense 2. Ribozyme RNA
肿瘤基因治疗临床试验方案
黑色素瘤 83 前列腺癌 44
基因治疗
Gene therapy
传统治疗方法
1. 药物治疗 2. 手术治疗 3. 放射治疗 4. 理疗
• 新的生物治疗： • 基因治疗(gene therapy)
基因治疗
一、概念 二、策略 三、基本流程 四、应用与展望
一、基因治疗的概念
• Gene therapy is a medical intervention based on modification of genetic materials in living cells.
(3) 药物增敏基因治疗
• 将外源基因插入肿瘤细胞后，改变肿瘤细胞对 药物的敏感性。
• 如将钙调素基因转入癌细胞，利用其对癌细胞 MDR的逆转作用，使癌细胞对化疗药物的敏感 性明显提高。
3. 其它策略
(1) 特异性细胞杀伤 (2) 多基因转染
特异性细胞杀伤
• 指利用重组DNA技术将生物来源的细胞毒素基 因与一些特异受体的配体基因融合，构建融合 基因，导入高度表达该受体的肿瘤细胞，以特 异性杀伤该肿瘤细胞。
基因治疗概述课件
演讲人
目录
01. 基因治疗的基本概念 02. 基因治疗的发展历程 03. 基因治疗的技术方法 04. 基因治疗的伦理与法规
基因治疗的定义
基因治疗：通过改 变基因表达或功能 来治疗疾病的方法
基因治疗的类型： 基因添加、基因删
除、基因编辑等
基因治疗的应用： 遗传病、癌症、病
毒感染等
基因治疗的挑战： 安全性、有效性、
基因治疗的起源
01
1972年，Paul Berg首次成功将 外源基因导入细 菌
02
1974年， Werner Arber和 Hamilton Smith 发现限制性内切 酶，为基因编辑 提供了工具
03
1978年，Walter Gilbert和Allan Maxam发明 DNA测序技术， 为基因治疗提供 了基础
基因治疗载体
01 病毒载体：如腺病毒、腺相关 病毒、慢病毒等
02 非病毒载体：如质粒DNA、 RNA、脂质体等
03 基因编辑技术：如 C R I S P R / C a s 9 、 TA L E N 等
04 基因沉默技术：如RNA干扰、 反义RNA等
基因治疗的伦理问题
基因编辑技术的 安全性和可靠性
基因治疗的应用
遗传病治疗：通过基因编辑 技术，修复或替换致病基因， 治疗遗传病
癌症治疗：利用基因编辑技术， 对癌细胞进行基因改造，使其 失去生长和扩散能力
病毒感染治疗：通过基因编辑 技术，对病毒进行基因改造， 使其失去感染和复制能力
基因编辑技术：通过基因编辑 技术，对基因进行编辑和改造， 实现基因治疗的目的
等问题
基因治疗需要 进一步研究和 发展，以实现 更广泛的应用
基因编辑技术
CRISPR/Cas9技术：一种新型的基因编辑技术， 具有高效、精确、简便等特点。
目录
01. 基因治疗的基本概念 02. 基因治疗的发展历程 03. 基因治疗的技术方法 04. 基因治疗的伦理与法规
基因治疗的定义
基因治疗：通过改 变基因表达或功能 来治疗疾病的方法
基因治疗的类型： 基因添加、基因删
除、基因编辑等
基因治疗的应用： 遗传病、癌症、病
毒感染等
基因治疗的挑战： 安全性、有效性、
基因治疗的起源
01
1972年，Paul Berg首次成功将 外源基因导入细 菌
02
1974年， Werner Arber和 Hamilton Smith 发现限制性内切 酶，为基因编辑 提供了工具
03
1978年，Walter Gilbert和Allan Maxam发明 DNA测序技术， 为基因治疗提供 了基础
基因治疗载体
01 病毒载体：如腺病毒、腺相关 病毒、慢病毒等
02 非病毒载体：如质粒DNA、 RNA、脂质体等
03 基因编辑技术：如 C R I S P R / C a s 9 、 TA L E N 等
04 基因沉默技术：如RNA干扰、 反义RNA等
基因治疗的伦理问题
基因编辑技术的 安全性和可靠性
基因治疗的应用
遗传病治疗：通过基因编辑 技术，修复或替换致病基因， 治疗遗传病
癌症治疗：利用基因编辑技术， 对癌细胞进行基因改造，使其 失去生长和扩散能力
病毒感染治疗：通过基因编辑 技术，对病毒进行基因改造， 使其失去感染和复制能力
基因编辑技术：通过基因编辑 技术，对基因进行编辑和改造， 实现基因治疗的目的
等问题
基因治疗需要 进一步研究和 发展，以实现 更广泛的应用
基因编辑技术
CRISPR/Cas9技术：一种新型的基因编辑技术， 具有高效、精确、简便等特点。
《基因治疗》课件
丙型肝炎的基因治疗主要集中在利用基因工程技术，将编 码抗病毒蛋白的基因导入肝细胞，以清除体内的丙型肝炎 病毒。
神经性疾病基因治疗案例
01
总结词
神经性疾病基因治疗案例主要通过调节神经细胞内的基因表达，改善神
经系统的功能，以达到治疗神经性疾病的目的。
02
帕金森病
帕金森病是一种常见的神经系统疾病，其基因治疗策略包括利用基因工
伦理与法律问题
01
02
03
伦理问题
基因治疗涉及到人类基因 的改变，可能引发一系列 伦理问题，如人类尊严、 基因优化的道德界限等。
法律问题
基因治疗技术的监管和法 律地位不明确，可能引发 法律纠纷和社会问题。
解决途径
建立完善的伦理指南和监 管机制，加强国际合作与 交流，共同探讨制定相关 伦理和法律规范。
04 基因治疗的挑战与前景
CHAPTER
技术挑战与解决方案
技术难题
未来展望
基因治疗技术仍面临许多技术挑战， 如精确靶向、基因导入效率、安全性 等。
随着技术的不断进步，基因治疗将有 望成为更多疾病的根治手段，为人类 健康带来更多福祉。
解决方案
通过不断的研究和技术创新，开发更 高效的基因导入载体、优化基因编辑 技术等手段，逐步克服技术难题。
详细描述
感染性疾病基因治疗涉及对免疫系统的调控，如增强巨噬细胞和自然杀伤细胞的功能，提高人体对病 原体的抵抗力。此外，基因治疗还可用于预防和治疗病毒性、细菌性和真菌性感染。
神经性疾病基因治疗
总结词
神经性疾病基因治疗旨在通过基因工 程技术，调节神经细胞的活性，改善 神经性疾病的症状。
详细描述
神经性疾病基因治疗针对帕金森病、 阿尔茨海默病、亨廷顿氏病等神经性 疾病，通过调节神经递质、神经营养 因子等基因的表达，改善症状并提高 患者的生活质量。
神经性疾病基因治疗案例
01
总结词
神经性疾病基因治疗案例主要通过调节神经细胞内的基因表达，改善神
经系统的功能，以达到治疗神经性疾病的目的。
02
帕金森病
帕金森病是一种常见的神经系统疾病，其基因治疗策略包括利用基因工
伦理与法律问题
01
02
03
伦理问题
基因治疗涉及到人类基因 的改变，可能引发一系列 伦理问题，如人类尊严、 基因优化的道德界限等。
法律问题
基因治疗技术的监管和法 律地位不明确，可能引发 法律纠纷和社会问题。
解决途径
建立完善的伦理指南和监 管机制，加强国际合作与 交流，共同探讨制定相关 伦理和法律规范。
04 基因治疗的挑战与前景
CHAPTER
技术挑战与解决方案
技术难题
未来展望
基因治疗技术仍面临许多技术挑战， 如精确靶向、基因导入效率、安全性 等。
随着技术的不断进步，基因治疗将有 望成为更多疾病的根治手段，为人类 健康带来更多福祉。
解决方案
通过不断的研究和技术创新，开发更 高效的基因导入载体、优化基因编辑 技术等手段，逐步克服技术难题。
详细描述
感染性疾病基因治疗涉及对免疫系统的调控，如增强巨噬细胞和自然杀伤细胞的功能，提高人体对病 原体的抵抗力。此外，基因治疗还可用于预防和治疗病毒性、细菌性和真菌性感染。
神经性疾病基因治疗
总结词
神经性疾病基因治疗旨在通过基因工 程技术，调节神经细胞的活性，改善 神经性疾病的症状。
详细描述
神经性疾病基因治疗针对帕金森病、 阿尔茨海默病、亨廷顿氏病等神经性 疾病，通过调节神经递质、神经营养 因子等基因的表达，改善症状并提高 患者的生活质量。
2.8 基因治疗 PPT课件
第八节 基因治疗与基因诊断
一、基因治疗的概念
◆基因治疗（gene therapy）——就是向有功能 缺陷的细胞补充相应功能基因，以纠正或补偿 其基因缺陷，从而达到治疗的目的。
Gene Therapy Principles
AAV
Nucleus
Adenovirus
Therapeutic Protein
• 致病基因（裂解细胞、癌基因使细胞转化）删除
• 插入外源基因长度受限删除非必须基因/必须基因 （由辅助病毒或宿主细胞提供该基因的功能）
◆反转录病毒(Retrovirus, RV)载体
优点：基因转移的效率 高，细胞宿主范围较广 泛，DNA整合效率高于 其它病毒载体等。 缺点：只感染分裂状态 的细胞，载体容量小（ ≤8kb），目的基因在 未分化的细胞中常丢失 ，随机整合潜在致癌的 危险。
◆腺病毒(AV)载体
优点： I. 安全，不整合到染色体上 II. 不需要宿主细胞的分裂增殖就能进入细胞 缺点：
I. 免疫原性较强
II. 不能整合到宿主细胞基因组使得外源基因 表达持续时间有限
III.插入外源DNA的能力也有限（≤7kb）。
◆疱疹病毒（HSV）载体
优点： I. 嗜神经组织 II. 能插入较长外源基因（20kb或略长些 缺点：
形成高效包装DNA的人造膜，与细胞膜极为相似。 形成脂质双层包围水溶液的脂质微球，与细胞融合后被 细胞内吞。
人工脂质体膜具有如下特点
1. 2. 3. 4. 5. 无毒性和免疫原性 可生物降解，不会在体内堆积 可制成球状(0.03-50 m)，包容大小不同的生物分子 可带有不同的电荷 具有不同的膜脂流动性、稳定性、及温度敏感性，能适 应不同的生理要求
重症综合性免疫缺乏症（SCID）
一、基因治疗的概念
◆基因治疗（gene therapy）——就是向有功能 缺陷的细胞补充相应功能基因，以纠正或补偿 其基因缺陷，从而达到治疗的目的。
Gene Therapy Principles
AAV
Nucleus
Adenovirus
Therapeutic Protein
• 致病基因（裂解细胞、癌基因使细胞转化）删除
• 插入外源基因长度受限删除非必须基因/必须基因 （由辅助病毒或宿主细胞提供该基因的功能）
◆反转录病毒(Retrovirus, RV)载体
优点：基因转移的效率 高，细胞宿主范围较广 泛，DNA整合效率高于 其它病毒载体等。 缺点：只感染分裂状态 的细胞，载体容量小（ ≤8kb），目的基因在 未分化的细胞中常丢失 ，随机整合潜在致癌的 危险。
◆腺病毒(AV)载体
优点： I. 安全，不整合到染色体上 II. 不需要宿主细胞的分裂增殖就能进入细胞 缺点：
I. 免疫原性较强
II. 不能整合到宿主细胞基因组使得外源基因 表达持续时间有限
III.插入外源DNA的能力也有限（≤7kb）。
◆疱疹病毒（HSV）载体
优点： I. 嗜神经组织 II. 能插入较长外源基因（20kb或略长些 缺点：
形成高效包装DNA的人造膜，与细胞膜极为相似。 形成脂质双层包围水溶液的脂质微球，与细胞融合后被 细胞内吞。
人工脂质体膜具有如下特点
1. 2. 3. 4. 5. 无毒性和免疫原性 可生物降解，不会在体内堆积 可制成球状(0.03-50 m)，包容大小不同的生物分子 可带有不同的电荷 具有不同的膜脂流动性、稳定性、及温度敏感性，能适 应不同的生理要求
重症综合性免疫缺乏症（SCID）
《基因治疗》PPT课件
DNA复合物 3. 多聚物/DNA复合物 4. 其它方法
1. 裸DNA
• 方法：直接注射或基因枪轰击 • 溶液类型对基因表达有影响：
重组DNA可贮存于5%-30%的蔗糖溶液中 也可用生理盐水或PBS
2. 脂质体/DNA复合物
形成高效包装DNA的人造膜，与细胞膜极为相似。 形成脂质双层包围水溶液的脂质微球，与细胞融合后被
重症综合性免疫缺乏症（SCID）
腺苷脱氨酶（ADA）缺乏症是常染色体隐性遗传的 致死性疾病，患者由于ADA缺乏导致脱苷腺氨酸增多， 改变了甲基化能力，致使淋巴细胞受损，从而导致 免疫缺陷
1990年，首次将ADA转基因T淋巴细胞注射到 人体骨髓组织（患有－－腺苷脱氨酶（ADA） 缺乏症的4岁儿童） ，治疗SCID
细胞内吞。
人工脂质体膜具有如下特点
1. 无毒性和免疫原性 2. 可生物降解，不会在体内堆积 3. 可制成球状(0.03-50 m)，包容大小不同的生物分子 4. 可带有不同的电荷 5. 具有不同的膜脂流动性、稳定性、及温度敏感性，能适
应不同的生理要求
3. 多聚物/DNA复合物
• 阳离子多聚体 • DNA带负电 • 细胞表面带负电
（一）基因治疗的病毒载体
• 应该具有的基本条件： I. 携带外源基因并能组装成病毒颗粒 II. 介导外源基因的转移和表达 III. 对机体没有致病能力
病毒载体的产生
➢ 充分了解载体病毒的基因组结构和功能（编码区/非编 码区、结构蛋白/非结构蛋白、必须基因/非必须基因 、包装容量等）
➢ 外源基因插入病毒基因组的非必须区 • 致病基因（裂解细胞、癌基因使细胞转化）删除 • 插入外源基因长度受限删除非必须基因/必须基因（
2．种系细胞的基因治疗：在生殖细胞（精子、卵子 或未分化的受精卵）中引入正常基因或修复缺陷基因 以校正遗传缺陷。引入的外源基因（整合到基因组） 能遗传给后代。
1. 裸DNA
• 方法：直接注射或基因枪轰击 • 溶液类型对基因表达有影响：
重组DNA可贮存于5%-30%的蔗糖溶液中 也可用生理盐水或PBS
2. 脂质体/DNA复合物
形成高效包装DNA的人造膜，与细胞膜极为相似。 形成脂质双层包围水溶液的脂质微球，与细胞融合后被
重症综合性免疫缺乏症（SCID）
腺苷脱氨酶（ADA）缺乏症是常染色体隐性遗传的 致死性疾病，患者由于ADA缺乏导致脱苷腺氨酸增多， 改变了甲基化能力，致使淋巴细胞受损，从而导致 免疫缺陷
1990年，首次将ADA转基因T淋巴细胞注射到 人体骨髓组织（患有－－腺苷脱氨酶（ADA） 缺乏症的4岁儿童） ，治疗SCID
细胞内吞。
人工脂质体膜具有如下特点
1. 无毒性和免疫原性 2. 可生物降解，不会在体内堆积 3. 可制成球状(0.03-50 m)，包容大小不同的生物分子 4. 可带有不同的电荷 5. 具有不同的膜脂流动性、稳定性、及温度敏感性，能适
应不同的生理要求
3. 多聚物/DNA复合物
• 阳离子多聚体 • DNA带负电 • 细胞表面带负电
（一）基因治疗的病毒载体
• 应该具有的基本条件： I. 携带外源基因并能组装成病毒颗粒 II. 介导外源基因的转移和表达 III. 对机体没有致病能力
病毒载体的产生
➢ 充分了解载体病毒的基因组结构和功能（编码区/非编 码区、结构蛋白/非结构蛋白、必须基因/非必须基因 、包装容量等）
➢ 外源基因插入病毒基因组的非必须区 • 致病基因（裂解细胞、癌基因使细胞转化）删除 • 插入外源基因长度受限删除非必须基因/必须基因（
2．种系细胞的基因治疗：在生殖细胞（精子、卵子 或未分化的受精卵）中引入正常基因或修复缺陷基因 以校正遗传缺陷。引入的外源基因（整合到基因组） 能遗传给后代。
基因治疗PPT课件
3
❖ 黑色箭头所示：从患者体内分离细胞，在实验室中修饰后回输给患者（回体基因治疗） ❖ 灰色箭头所示：细胞在患者体内进行修饰（体内基因治疗）
4
基因治疗特点
❖ 普通的医疗方法对绝大多数遗传病都束手无策，即使治疗也是 治标不治本；基因治疗在基因水平上进行操作，能从源头上解 决疾病的发生。目前在没有治疗方法或疗效不佳的领域基因治 疗将大有作为
基因治疗
北京大学眼科中心 北京大学第三医院
1
目录
第一部分 基因治疗概述 第二部分 基因治疗载体选择 第三部分 基因治疗的发展历程 第四部分 临床基因治疗
2 2
一、基因治疗概述
❖ 1993年FDA定义： 基于修饰活细胞遗传物质而进行的医学干预
❖ 包括以下两方面： ➢ 患者体内分离细胞，进行体外修饰，随后再注入患者体内 ➢ 基因治疗产品直接注入患者体内，使细胞发生遗传学改变
10
❖ 反转录病毒含三个转录单位，还有一个顺式作用元件，在载体中，三个转录单位 被治疗基因替代，最大克隆的容量是8kb。重组体在特定细胞中包装，该细胞可提 供必需的三个转录单位，但不含完整的反转录病毒基因组。
11
腺病毒（AV）
❖ 双链DNA病毒，线性双链DNA基因组在细胞核内作为附加体 存在而不整合
26
首例基因治疗死亡病例
❖ 18岁的 Gelsinger成为第一例基因治疗死亡病例（1999年9月 17日）。患者患有鸟氨酸氨甲酰基转移酶缺陷，1999年在宾 西法尼亚大学接受以编码OTC基因的腺病毒基因治疗。为获得 足够的有功能的基因，通过肝动脉注射了大剂量的病毒载体。
❖ 半个世纪以来，分子生物以空前的速度迅猛发展，极大的推动了 基因工程技术和基因治疗的发展。
23
❖ 黑色箭头所示：从患者体内分离细胞，在实验室中修饰后回输给患者（回体基因治疗） ❖ 灰色箭头所示：细胞在患者体内进行修饰（体内基因治疗）
4
基因治疗特点
❖ 普通的医疗方法对绝大多数遗传病都束手无策，即使治疗也是 治标不治本；基因治疗在基因水平上进行操作，能从源头上解 决疾病的发生。目前在没有治疗方法或疗效不佳的领域基因治 疗将大有作为
基因治疗
北京大学眼科中心 北京大学第三医院
1
目录
第一部分 基因治疗概述 第二部分 基因治疗载体选择 第三部分 基因治疗的发展历程 第四部分 临床基因治疗
2 2
一、基因治疗概述
❖ 1993年FDA定义： 基于修饰活细胞遗传物质而进行的医学干预
❖ 包括以下两方面： ➢ 患者体内分离细胞，进行体外修饰，随后再注入患者体内 ➢ 基因治疗产品直接注入患者体内，使细胞发生遗传学改变
10
❖ 反转录病毒含三个转录单位，还有一个顺式作用元件，在载体中，三个转录单位 被治疗基因替代，最大克隆的容量是8kb。重组体在特定细胞中包装，该细胞可提 供必需的三个转录单位，但不含完整的反转录病毒基因组。
11
腺病毒（AV）
❖ 双链DNA病毒，线性双链DNA基因组在细胞核内作为附加体 存在而不整合
26
首例基因治疗死亡病例
❖ 18岁的 Gelsinger成为第一例基因治疗死亡病例（1999年9月 17日）。患者患有鸟氨酸氨甲酰基转移酶缺陷，1999年在宾 西法尼亚大学接受以编码OTC基因的腺病毒基因治疗。为获得 足够的有功能的基因，通过肝动脉注射了大剂量的病毒载体。
❖ 半个世纪以来，分子生物以空前的速度迅猛发展，极大的推动了 基因工程技术和基因治疗的发展。
23
基因治疗.ppt
四、基因治疗的途径
第一节 基因治疗的概念及其策略
四、基因治疗的途径
1. ex vivo法，是将受体细胞在体外培养，转入外源基因， 经过适当的选择系统，把重组的受体细胞回输到患者体 内，让外源基因表达以改善患者症状。
2.in vivo法，直接将外源DAN注射到机体内，使其在体 内表达发挥治疗作用。in vivo法比ex vivo法更简单、直 接和经济，疗效也比较确切，常用的体内基因直接转移 手段有病毒介导，脂质体介导和基因直接注射等。
第一节 基因治疗的概念及其策略
二、基因治疗的前提条件
1、发病机制在DNA水平上已经清楚 ； 2、要转移的基因已经克隆分离，其表达产物有详尽 的了解 ； 3、该基因正常表达的组织可在体外进行遗传操作。
第一节 基因治疗的概念及其策略
三、基因治疗的总体策略
（1）基因置换（gene replacement） 用正常基因在原位替换致病基因，使细胞DNA完全恢复正常状态；
第一节 基因治疗的概念及其策略
六、 基因治疗的现状与展望
1990年9月，美国批准世界上首个基因治疗方案，腺 苷酸脱氢酶（ADA）基因对两位因ADA基因缺陷而导 致严重免疫缺损的女孩进行治疗，获得了令人满意的 结果。迄今报道已有数千例经基因治疗的患者，病种 主要是恶性肿瘤，艾滋病、肺囊性纤维化等。
第二节 基因治疗的载体
肿瘤的基因治疗
肿瘤的发生是由于某些元癌基因的激活、抑癌基因 的失活及凋亡相关基因的改变从而 导致细胞增殖分 化和凋亡失调。针对肿瘤发生的遗传学背景，将外 源性目的基因引入肿瘤细胞或其他体细胞内以纠正 过度活化的基因或补偿缺陷的基因，从而达到治疗 肿瘤的目的，即为肿瘤的基因治疗。
肿瘤的基因治疗
针对抑癌基因的基因治疗 针对癌基因的治疗 肿瘤免疫基因治疗
第一节 基因治疗的概念及其策略
四、基因治疗的途径
1. ex vivo法，是将受体细胞在体外培养，转入外源基因， 经过适当的选择系统，把重组的受体细胞回输到患者体 内，让外源基因表达以改善患者症状。
2.in vivo法，直接将外源DAN注射到机体内，使其在体 内表达发挥治疗作用。in vivo法比ex vivo法更简单、直 接和经济，疗效也比较确切，常用的体内基因直接转移 手段有病毒介导，脂质体介导和基因直接注射等。
第一节 基因治疗的概念及其策略
二、基因治疗的前提条件
1、发病机制在DNA水平上已经清楚 ； 2、要转移的基因已经克隆分离，其表达产物有详尽 的了解 ； 3、该基因正常表达的组织可在体外进行遗传操作。
第一节 基因治疗的概念及其策略
三、基因治疗的总体策略
（1）基因置换（gene replacement） 用正常基因在原位替换致病基因，使细胞DNA完全恢复正常状态；
第一节 基因治疗的概念及其策略
六、 基因治疗的现状与展望
1990年9月，美国批准世界上首个基因治疗方案，腺 苷酸脱氢酶（ADA）基因对两位因ADA基因缺陷而导 致严重免疫缺损的女孩进行治疗，获得了令人满意的 结果。迄今报道已有数千例经基因治疗的患者，病种 主要是恶性肿瘤，艾滋病、肺囊性纤维化等。
第二节 基因治疗的载体
肿瘤的基因治疗
肿瘤的发生是由于某些元癌基因的激活、抑癌基因 的失活及凋亡相关基因的改变从而 导致细胞增殖分 化和凋亡失调。针对肿瘤发生的遗传学背景，将外 源性目的基因引入肿瘤细胞或其他体细胞内以纠正 过度活化的基因或补偿缺陷的基因，从而达到治疗 肿瘤的目的，即为肿瘤的基因治疗。
肿瘤的基因治疗
针对抑癌基因的基因治疗 针对癌基因的治疗 肿瘤免疫基因治疗
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象外科移植手术，切除病变部分，换上正 常健康基因，这在目前还难以做到
(二)基因取代或基因干预
基因置换 (gene replacement)
通过体内基因同源重组,原位替换病变细胞内的致病基因
基因增补 (gene augmentation)
不除去异常基因，向靶细胞导入外源基因通过非定点 整合，使其表达产物，从而弥补缺陷基因的功能
体细胞——目前常用体细胞有：
①淋巴细胞 ②骨髓细胞 ③内皮细胞 ④皮肤纤维细胞 ⑤肝细胞 ⑥肌细胞
附:选择靶细胞依据 ①疾病累及的主要部位。 ②靶细胞来源的难易程度。 ③体外培养的成活率和存活时间。 ④接受正常基因的能力。 ⑤新的正常基因能否在靶细胞能否
正常表达和持续时间。
⑦角化细胞(keratinoyte)
第二节
基因治疗的 基本原理
基因治疗的基本程序(基本原理或基本步骤)：
治疗性基因的选择
基因载体的选择 病毒载体 非病毒载体
载体与治疗基因 将重组DNA导入靶细胞,检测目 重组及筛选鉴定 的基因和标记基因的表达产物
靶细胞的选择 体细胞 生殖细胞
基因治疗的基本程序(基本原理或基本步骤)：
基因转移 间接体内疗法 直接体内疗法
1.吸附——病毒衣壳糖蛋白与细胞膜受体特异性结合，吸 附在膜受体上。
2.入胞——病毒核酸进入host细胞，逆转录，整合到 host DNA 中去，转录、复制
3.病毒颗粒成熟——病毒核酸和病毒蛋白装配成成熟 病毒颗粒
4.病毒颗粒的释放——释放的子病毒又可感染其它细 胞，每个细胞可以释放105子病毒。
图11-2 Rous肉瘤病毒毒粒结构示意图
一.病毒载体——转基因的生物学方法
逆转录病毒载体
（一）逆转录病毒的生活（命）周期 （二）逆转录病毒的基因组结构 (三) 逆转录病毒载体结构功能特点 (四) 重组逆转录病毒载体结构 （五）重组逆转录病毒的制备 （六）重组逆转录病毒基因转移系统 （七）逆转录病毒载体介导基因转移的安全性问题
（一）逆转录病毒的生活（命）周期
⑧多种肿瘤细胞
四、基因治疗的途径
1.间接体内疗法（ex vivo） 体外将治疗基因→靶细胞内,再将经基因修饰靶
细胞→病人,使这种外源基因(细胞)在体内表达， 从而达到基因治疗目的.(目前多采用这种疗法)。 2.体内法(in vivo)
外源基因→直接导入体内有关组织器官→进入相 应组织器官进行表达→从而达到基因治疗目的。
(真核) 真核
√ √ √
第三节 基因转移技术
转移基因方法
生物学方法
非生物学方法
①逆转录病毒载体
①磷酸钙共沉淀法
②腺病毒载体
②质粒DNA/脂质体法
③腺相关病毒载体
③射法
以逆转录病毒法最为常用，以磷酸钙法最为便宜（经济），以注射 法最为简捷，最值得研究和推广应用（笑话，也最危险。）
2．基因组结构
图11-3 逆转录病毒基因组的基本结构
(三) 逆转录病毒载体结构功能特点
保留病毒的LTR ,ψ ,去除病毒的结构基因,加上 一个抗性标记基因
LTR
Neo
ψ Ampr
LTR oriE
(四) 重组逆转录病毒载体结构
保留病毒的LTR ,ψ ,用目的基因和抗性标记基 因置换了病毒的结构基因
转导细胞的筛 选与鉴定
利用标记基因和目的基因的表达产物 利用核酸分子杂交
回输体内
考核疗效和安全性
基因治疗与基因工程的比较
基因工程
1. 目的基因
应用或研究基因
2. 载 体
(原核或真核)
3. 靶 细 胞
原、真核
4. DNA体外重组
√
5. 重组DNA导入宿主细胞 √
6. 后处理
√
基因治疗 标志基因+治疗基因
基因干预 (gene interference)
在转录或翻译水平阻断某些基因的异常表达。包括反义 RNA、核酶、三链DNA及干扰RNA技术
三、基因治疗中的靶细胞
生殖细胞: 优点——治本 困难——①生殖(学)生物学问题，极其复杂且不清楚。 ②伦理学问题
名人精子库”，“美女卵子库”，总是别人的 “种”，不好办，即使这个问题解决，恐怕未必 然，爱因斯坦生了个弱智女，马克思后代在开出 租车（不是说开出租车不好，特此声明）
基因治疗
第一节 概 述
人类疾病的发生，往往涉及到内源基因的突变 （如遗传病）和外源基因的入侵（如感染性疾病）。 机体对外来侵袭抵御体现在以下4个层次：
1.整体水平，诸如动物的打斗撕咬；
2.细胞水平，如Mφ 对“异已”吞噬作用； 3.分子水平，如抗原抗体反应，人可以产生106
抗体分子，对付外来侵袭；
（二）逆转录病毒的基因组结构
1.一般特征 (1)正链RNA病毒 即与mRNA极性相同（5‘→3’），反之为(一)； (2)5‘有m7Gppp帽，3‘有poly（A）尾； (3)病毒进入细胞后，经本身逆转录成双链cDNA分子→细胞核并 整合到宿主染色体,这种整合病毒DNA称为前病毒(provirus)(不 管是源于RNA还是DNA)(并非所有逆转录病毒都致癌)。
LTR
Neo Target gene LTR
ψ Ampr
oriE
常用逆转录病毒载体的结构示意图
（五）重组逆转录病毒的制备
1．包装细胞 (1)包装细胞定义 是将缺失了包装信号及相关序列的缺陷型逆转 录病毒（辅助病毒）导入哺乳细胞内而制备成的 一种特殊的细胞系，这种细胞因携带有逆转录病 毒基因组而大量产生病毒包装蛋白，而辅助病毒 自身缺乏包装信号（ψ 序列）而不能包装,不产生 病毒颗粒。
善疾病的一种治疗手段。
基因治疗是治疗基因突变性疾病的一项根本 性措施，同时它为非基因突变性疾病提供了一 个新的治疗手段。
二、基因治疗的策略
两个基本策略: 原位矫正病变基因 基因取代或基因干预
(一)原位矫正病变基因(纠正异常碱基)
图11-1 镰形红细胞贫血病人的Hb为HbS(由β 珠蛋白基因点突变引起)
4.基因水平，对付外源基因入侵，在原核生物
中有一种限制性核酸内切酶可将外源基因水解掉。
对于内源基因突变: 至今未找到令人满意的治疗方法。 基因治疗仅仅处于初始阶段。 全世界接受基因治疗者106人，受试者600人
一、基因治疗的概念
定义：
广义地说，基因治疗是应用基因或基因产物， 治疗疾病的一种方法。从狭义地说，基因治疗 是把外界的正常基因或治疗基因，通过载体转 移到人体的靶细胞，进行基因修饰和表达，改
(二)基因取代或基因干预
基因置换 (gene replacement)
通过体内基因同源重组,原位替换病变细胞内的致病基因
基因增补 (gene augmentation)
不除去异常基因，向靶细胞导入外源基因通过非定点 整合，使其表达产物，从而弥补缺陷基因的功能
体细胞——目前常用体细胞有：
①淋巴细胞 ②骨髓细胞 ③内皮细胞 ④皮肤纤维细胞 ⑤肝细胞 ⑥肌细胞
附:选择靶细胞依据 ①疾病累及的主要部位。 ②靶细胞来源的难易程度。 ③体外培养的成活率和存活时间。 ④接受正常基因的能力。 ⑤新的正常基因能否在靶细胞能否
正常表达和持续时间。
⑦角化细胞(keratinoyte)
第二节
基因治疗的 基本原理
基因治疗的基本程序(基本原理或基本步骤)：
治疗性基因的选择
基因载体的选择 病毒载体 非病毒载体
载体与治疗基因 将重组DNA导入靶细胞,检测目 重组及筛选鉴定 的基因和标记基因的表达产物
靶细胞的选择 体细胞 生殖细胞
基因治疗的基本程序(基本原理或基本步骤)：
基因转移 间接体内疗法 直接体内疗法
1.吸附——病毒衣壳糖蛋白与细胞膜受体特异性结合，吸 附在膜受体上。
2.入胞——病毒核酸进入host细胞，逆转录，整合到 host DNA 中去，转录、复制
3.病毒颗粒成熟——病毒核酸和病毒蛋白装配成成熟 病毒颗粒
4.病毒颗粒的释放——释放的子病毒又可感染其它细 胞，每个细胞可以释放105子病毒。
图11-2 Rous肉瘤病毒毒粒结构示意图
一.病毒载体——转基因的生物学方法
逆转录病毒载体
（一）逆转录病毒的生活（命）周期 （二）逆转录病毒的基因组结构 (三) 逆转录病毒载体结构功能特点 (四) 重组逆转录病毒载体结构 （五）重组逆转录病毒的制备 （六）重组逆转录病毒基因转移系统 （七）逆转录病毒载体介导基因转移的安全性问题
（一）逆转录病毒的生活（命）周期
⑧多种肿瘤细胞
四、基因治疗的途径
1.间接体内疗法（ex vivo） 体外将治疗基因→靶细胞内,再将经基因修饰靶
细胞→病人,使这种外源基因(细胞)在体内表达， 从而达到基因治疗目的.(目前多采用这种疗法)。 2.体内法(in vivo)
外源基因→直接导入体内有关组织器官→进入相 应组织器官进行表达→从而达到基因治疗目的。
(真核) 真核
√ √ √
第三节 基因转移技术
转移基因方法
生物学方法
非生物学方法
①逆转录病毒载体
①磷酸钙共沉淀法
②腺病毒载体
②质粒DNA/脂质体法
③腺相关病毒载体
③射法
以逆转录病毒法最为常用，以磷酸钙法最为便宜（经济），以注射 法最为简捷，最值得研究和推广应用（笑话，也最危险。）
2．基因组结构
图11-3 逆转录病毒基因组的基本结构
(三) 逆转录病毒载体结构功能特点
保留病毒的LTR ,ψ ,去除病毒的结构基因,加上 一个抗性标记基因
LTR
Neo
ψ Ampr
LTR oriE
(四) 重组逆转录病毒载体结构
保留病毒的LTR ,ψ ,用目的基因和抗性标记基 因置换了病毒的结构基因
转导细胞的筛 选与鉴定
利用标记基因和目的基因的表达产物 利用核酸分子杂交
回输体内
考核疗效和安全性
基因治疗与基因工程的比较
基因工程
1. 目的基因
应用或研究基因
2. 载 体
(原核或真核)
3. 靶 细 胞
原、真核
4. DNA体外重组
√
5. 重组DNA导入宿主细胞 √
6. 后处理
√
基因治疗 标志基因+治疗基因
基因干预 (gene interference)
在转录或翻译水平阻断某些基因的异常表达。包括反义 RNA、核酶、三链DNA及干扰RNA技术
三、基因治疗中的靶细胞
生殖细胞: 优点——治本 困难——①生殖(学)生物学问题，极其复杂且不清楚。 ②伦理学问题
名人精子库”，“美女卵子库”，总是别人的 “种”，不好办，即使这个问题解决，恐怕未必 然，爱因斯坦生了个弱智女，马克思后代在开出 租车（不是说开出租车不好，特此声明）
基因治疗
第一节 概 述
人类疾病的发生，往往涉及到内源基因的突变 （如遗传病）和外源基因的入侵（如感染性疾病）。 机体对外来侵袭抵御体现在以下4个层次：
1.整体水平，诸如动物的打斗撕咬；
2.细胞水平，如Mφ 对“异已”吞噬作用； 3.分子水平，如抗原抗体反应，人可以产生106
抗体分子，对付外来侵袭；
（二）逆转录病毒的基因组结构
1.一般特征 (1)正链RNA病毒 即与mRNA极性相同（5‘→3’），反之为(一)； (2)5‘有m7Gppp帽，3‘有poly（A）尾； (3)病毒进入细胞后，经本身逆转录成双链cDNA分子→细胞核并 整合到宿主染色体,这种整合病毒DNA称为前病毒(provirus)(不 管是源于RNA还是DNA)(并非所有逆转录病毒都致癌)。
LTR
Neo Target gene LTR
ψ Ampr
oriE
常用逆转录病毒载体的结构示意图
（五）重组逆转录病毒的制备
1．包装细胞 (1)包装细胞定义 是将缺失了包装信号及相关序列的缺陷型逆转 录病毒（辅助病毒）导入哺乳细胞内而制备成的 一种特殊的细胞系，这种细胞因携带有逆转录病 毒基因组而大量产生病毒包装蛋白，而辅助病毒 自身缺乏包装信号（ψ 序列）而不能包装,不产生 病毒颗粒。
善疾病的一种治疗手段。
基因治疗是治疗基因突变性疾病的一项根本 性措施，同时它为非基因突变性疾病提供了一 个新的治疗手段。
二、基因治疗的策略
两个基本策略: 原位矫正病变基因 基因取代或基因干预
(一)原位矫正病变基因(纠正异常碱基)
图11-1 镰形红细胞贫血病人的Hb为HbS(由β 珠蛋白基因点突变引起)
4.基因水平，对付外源基因入侵，在原核生物
中有一种限制性核酸内切酶可将外源基因水解掉。
对于内源基因突变: 至今未找到令人满意的治疗方法。 基因治疗仅仅处于初始阶段。 全世界接受基因治疗者106人，受试者600人
一、基因治疗的概念
定义：
广义地说，基因治疗是应用基因或基因产物， 治疗疾病的一种方法。从狭义地说，基因治疗 是把外界的正常基因或治疗基因，通过载体转 移到人体的靶细胞，进行基因修饰和表达，改