[课件]第08章 核酸药物与基因治疗PPT
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基因治疗PPT课件
善疾病的一种治疗手段。
基因治疗是治疗基因突变性疾病的一项根本 性措施，同时它为非基因突变性疾病提供了一 个新的治疗手段。
二、基因治疗的策略
两个基本策略: 原位矫正病变基因 基因取代或基因干预
(一)原位矫正病变基因(纠正异常碱基)
图11-1 镰形红细胞贫血病人的Hb为HbS(由β 珠蛋白基因点突变引起)
2.基因表达持续时间短； 3.许多问题仍需求助病毒或病毒 成分解决。
3.免疫原性低，急性毒性小，对
受试者比较安全；
4.可具有特异靶向性，并能转移 至非分裂期细胞并有效表达；
5.制备方便且重复性好，具有完 全人工合成和大规模生产可行性， 因此较简单和廉价。
（一）脂质体介导的转移方法
1.方法 用一定比例的磷脂酰胆碱和磷脂酰丝氨酸→共 溶于氯仿→制备成双层磷脂的封闭囊泡→超声波处理→ 将待转移外源基因DNA包入→制备成脂质体/质粒 DNA复合物→利用其能与细胞膜融合的特性，可将质 粒DNA转入细胞中。 2.优点 脂质体作为载体可以携带各种DNA片段，且 在转移途中保护基因不被核酸酶降解。 3.缺点 转移效率低、制备麻烦、商品较贵。
一.病毒载体——转基因的生物学方法
逆转录病毒载体
（一）逆转录病毒的生活（命）周期 （二）逆转录病毒的基因组结构 (三) 逆转录病毒载体结构功能特点 (四) 重组逆转录病毒载体结构 （五）重组逆转录病毒的制备 （六）重组逆转录病毒基因转移系统 （七）逆转录病毒载体介导基因转移的安全性问题
（一）逆转录病毒的生活（命）周期
（六）重组逆转录病毒基因转移系统
1．逆转录病毒介导基因转移的靶组织细胞
靶细胞的最基本要求: 细胞表面具有逆转录病毒相应的受体
最常用作基因治疗的靶有： 骨髓干细胞、成纤维细胞、淋巴细胞、 肝细胞、血管内皮细胞和肌细胞，还包 括所有的肿瘤细胞
基因治疗是治疗基因突变性疾病的一项根本 性措施，同时它为非基因突变性疾病提供了一 个新的治疗手段。
二、基因治疗的策略
两个基本策略: 原位矫正病变基因 基因取代或基因干预
(一)原位矫正病变基因(纠正异常碱基)
图11-1 镰形红细胞贫血病人的Hb为HbS(由β 珠蛋白基因点突变引起)
2.基因表达持续时间短； 3.许多问题仍需求助病毒或病毒 成分解决。
3.免疫原性低，急性毒性小，对
受试者比较安全；
4.可具有特异靶向性，并能转移 至非分裂期细胞并有效表达；
5.制备方便且重复性好，具有完 全人工合成和大规模生产可行性， 因此较简单和廉价。
（一）脂质体介导的转移方法
1.方法 用一定比例的磷脂酰胆碱和磷脂酰丝氨酸→共 溶于氯仿→制备成双层磷脂的封闭囊泡→超声波处理→ 将待转移外源基因DNA包入→制备成脂质体/质粒 DNA复合物→利用其能与细胞膜融合的特性，可将质 粒DNA转入细胞中。 2.优点 脂质体作为载体可以携带各种DNA片段，且 在转移途中保护基因不被核酸酶降解。 3.缺点 转移效率低、制备麻烦、商品较贵。
一.病毒载体——转基因的生物学方法
逆转录病毒载体
（一）逆转录病毒的生活（命）周期 （二）逆转录病毒的基因组结构 (三) 逆转录病毒载体结构功能特点 (四) 重组逆转录病毒载体结构 （五）重组逆转录病毒的制备 （六）重组逆转录病毒基因转移系统 （七）逆转录病毒载体介导基因转移的安全性问题
（一）逆转录病毒的生活（命）周期
（六）重组逆转录病毒基因转移系统
1．逆转录病毒介导基因转移的靶组织细胞
靶细胞的最基本要求: 细胞表面具有逆转录病毒相应的受体
最常用作基因治疗的靶有： 骨髓干细胞、成纤维细胞、淋巴细胞、 肝细胞、血管内皮细胞和肌细胞，还包 括所有的肿瘤细胞
基因治疗PPT课件
(一) 直接策略：
• 针对致病基因
(二) 间接策略：
• 导入与致病基因无直接联系的治疗基因
(一)直接策略
1. 基因矫正（gene correction） 2. 基因置换（gene replacement） 3. 基因增补（gene augmentation）
又称为补偿性基因治疗 4. 基因失活（gene inactivation）
1990年9月14日，世界首例基因治疗：SCID
感染性疾病的基因治疗
• 引入治疗基因来抑制病原繁殖
• 方法: 1. Anti-sense 2. Ribozyme RNA
肿瘤基因治疗临床试验方案
黑色素瘤 83 前列腺癌 44
基因治疗
Gene therapy
传统治疗方法
1. 药物治疗 2. 手术治疗 3. 放射治疗 4. 理疗
• 新的生物治疗： • 基因治疗(gene therapy)
基因治疗
一、概念 二、策略 三、基本流程 四、应用与展望
一、基因治疗的概念
• Gene therapy is a medical intervention based on modification of genetic materials in living cells.
(3) 药物增敏基因治疗
• 将外源基因插入肿瘤细胞后，改变肿瘤细胞对 药物的敏感性。
• 如将钙调素基因转入癌细胞，利用其对癌细胞 MDR的逆转作用，使癌细胞对化疗药物的敏感 性明显提高。
3. 其它策略
(1) 特异性细胞杀伤 (2) 多基因转染
特异性细胞杀伤
• 指利用重组DNA技术将生物来源的细胞毒素基 因与一些特异受体的配体基因融合，构建融合 基因，导入高度表达该受体的肿瘤细胞，以特 异性杀伤该肿瘤细胞。
• 针对致病基因
(二) 间接策略：
• 导入与致病基因无直接联系的治疗基因
(一)直接策略
1. 基因矫正（gene correction） 2. 基因置换（gene replacement） 3. 基因增补（gene augmentation）
又称为补偿性基因治疗 4. 基因失活（gene inactivation）
1990年9月14日，世界首例基因治疗：SCID
感染性疾病的基因治疗
• 引入治疗基因来抑制病原繁殖
• 方法: 1. Anti-sense 2. Ribozyme RNA
肿瘤基因治疗临床试验方案
黑色素瘤 83 前列腺癌 44
基因治疗
Gene therapy
传统治疗方法
1. 药物治疗 2. 手术治疗 3. 放射治疗 4. 理疗
• 新的生物治疗： • 基因治疗(gene therapy)
基因治疗
一、概念 二、策略 三、基本流程 四、应用与展望
一、基因治疗的概念
• Gene therapy is a medical intervention based on modification of genetic materials in living cells.
(3) 药物增敏基因治疗
• 将外源基因插入肿瘤细胞后，改变肿瘤细胞对 药物的敏感性。
• 如将钙调素基因转入癌细胞，利用其对癌细胞 MDR的逆转作用，使癌细胞对化疗药物的敏感 性明显提高。
3. 其它策略
(1) 特异性细胞杀伤 (2) 多基因转染
特异性细胞杀伤
• 指利用重组DNA技术将生物来源的细胞毒素基 因与一些特异受体的配体基因融合，构建融合 基因，导入高度表达该受体的肿瘤细胞，以特 异性杀伤该肿瘤细胞。
核酸类药物课件课件
第17页，此课件共93页哦
DNA、RNA在生物细胞内都与蛋白质结合成核蛋白 。 DNA·蛋白在低浓度盐溶液中几乎不溶解，随着盐浓度 的增加溶解度也增加，至1mol/L氯化钠中的溶解度很大， 比纯水高2倍。
相反，RNA·蛋白在盐溶液中的溶解度受盐浓度的影响 较小，在0.14mol/L氯化钠中溶解度较大。因此，在 提取时，常用此法分离这两种核蛋白。
(Puromycin) 尿苷类：有尿苷、氮杂尿苷(Azauridine)、碘苷、氟苷、溴
苷 胞苷类：有环胞苷(Cyclo-C)、氟环胞苷(AAFC)、氮杂胞
苷(Azacyti-dine) 肌苷类：有肌苷、肌苷二醛(IDA)、异丙肌苷(Inosiplex)
脱氧核苷类：有氮杂脱氧胞苷(5-Aza-2’-deoxycytidine)、脱氧
第9页，此课件共93页哦
依据核酸类药物及其衍生物的性质和功能分两类： 一类为具有天然结构的核酸类物质，缺乏这类物质会使
机体代谢失调，发生病态，提供这类物质，有助于改善
机体的物质代谢和能量平衡，加速受损组织的修复. 临床上已广泛应用于放射病、血小板减少症、白细
胞减少症、慢性肝炎、心血管疾病等。 属于这一类的核酸药物有ATP、辅酶A、脱氧核苷酸、
就能形成杂合的双螺旋体，甚至可以在DNA和RNA之间 形成杂合螺旋体。
当两种不同来源的DNA分子杂交时，形成双螺旋的倾向愈 强，说明它们分子之间碱基顺序的互补性愈强。可以利用
分子杂交方法来分离纯化DNA基因，研究基因转录和调 控等。
第25页，此课件共93页哦
三、核酸的颜色反应
DNA和RNA经酸水解后，嘌呤易脱下形成无嘌呤的醛 基化合物，或水解得到核糖和脱氧核糖，这些物质与 某些酚类、苯胺类化合物结合成有色物质，可用来作 定性分析或根据颜色的深浅作定量测定。
DNA、RNA在生物细胞内都与蛋白质结合成核蛋白 。 DNA·蛋白在低浓度盐溶液中几乎不溶解，随着盐浓度 的增加溶解度也增加，至1mol/L氯化钠中的溶解度很大， 比纯水高2倍。
相反，RNA·蛋白在盐溶液中的溶解度受盐浓度的影响 较小，在0.14mol/L氯化钠中溶解度较大。因此，在 提取时，常用此法分离这两种核蛋白。
(Puromycin) 尿苷类：有尿苷、氮杂尿苷(Azauridine)、碘苷、氟苷、溴
苷 胞苷类：有环胞苷(Cyclo-C)、氟环胞苷(AAFC)、氮杂胞
苷(Azacyti-dine) 肌苷类：有肌苷、肌苷二醛(IDA)、异丙肌苷(Inosiplex)
脱氧核苷类：有氮杂脱氧胞苷(5-Aza-2’-deoxycytidine)、脱氧
第9页，此课件共93页哦
依据核酸类药物及其衍生物的性质和功能分两类： 一类为具有天然结构的核酸类物质，缺乏这类物质会使
机体代谢失调，发生病态，提供这类物质，有助于改善
机体的物质代谢和能量平衡，加速受损组织的修复. 临床上已广泛应用于放射病、血小板减少症、白细
胞减少症、慢性肝炎、心血管疾病等。 属于这一类的核酸药物有ATP、辅酶A、脱氧核苷酸、
就能形成杂合的双螺旋体，甚至可以在DNA和RNA之间 形成杂合螺旋体。
当两种不同来源的DNA分子杂交时，形成双螺旋的倾向愈 强，说明它们分子之间碱基顺序的互补性愈强。可以利用
分子杂交方法来分离纯化DNA基因，研究基因转录和调 控等。
第25页，此课件共93页哦
三、核酸的颜色反应
DNA和RNA经酸水解后，嘌呤易脱下形成无嘌呤的醛 基化合物，或水解得到核糖和脱氧核糖，这些物质与 某些酚类、苯胺类化合物结合成有色物质，可用来作 定性分析或根据颜色的深浅作定量测定。
核酸与核苷类药物参考PPT
•1
• 核酸是一种多聚体大分子，它的组成单元是核苷 酸，将核苷酸中的磷酸基团去掉，剩余部分称核 苷，核苷进一步分解可生成戊糖和碱基。
胰核酸酶
胰、肠核苷酸酶
核苷酶
•2
嘌呤核苷酸
AMP 嘧啶核苷酸的结构
GMP
•3
核酸类药物分类 ——具有天然结构的核酸类物质
• 如：ATP、GTP、CTP、UTP、IMP、CoA、CoI(NAD+) 、 CoII(NADP+) 。
第一节 概述
一、基本概念 • 核酸与核苷类药物是指具有药用价值的核酸、核苷酸、
核苷或者碱基 • 天然的、类似物、衍生物及其聚合物 • 作用：
➢影响生物的蛋白质合成和脂肪、糖类的代谢 ➢恢复正常代谢或干扰某些异常代谢 • 用途：放射病、血小板减少症、白细胞减少症、急慢性 肝炎、心血管疾病和肌肉萎缩、肿瘤、病毒病
• 主要有叠氮胸苷、阿糖腺苷、阿糖胞苷、聚肌胞等。
O
O
O
HN
O
N
HO
O
C F3
HN
O
N
HO
O
C H3
HN
O
N
HO O
I H2N HO
O N
NN O
OH 三氟代胸 苷
N3 叠氮 胸 苷
OH
NH
H2 N
N
N
N O
无 环鸟 苷
OH
NH
N
H2 N
N
N O
OH
H
丙氧 鸟 苷
OH 5 '- 碘 脱 氧 尿 苷
CH2O H CH2O H
OH
NH
N
H2 N HO
N
N
O OH
• 核酸是一种多聚体大分子，它的组成单元是核苷 酸，将核苷酸中的磷酸基团去掉，剩余部分称核 苷，核苷进一步分解可生成戊糖和碱基。
胰核酸酶
胰、肠核苷酸酶
核苷酶
•2
嘌呤核苷酸
AMP 嘧啶核苷酸的结构
GMP
•3
核酸类药物分类 ——具有天然结构的核酸类物质
• 如：ATP、GTP、CTP、UTP、IMP、CoA、CoI(NAD+) 、 CoII(NADP+) 。
第一节 概述
一、基本概念 • 核酸与核苷类药物是指具有药用价值的核酸、核苷酸、
核苷或者碱基 • 天然的、类似物、衍生物及其聚合物 • 作用：
➢影响生物的蛋白质合成和脂肪、糖类的代谢 ➢恢复正常代谢或干扰某些异常代谢 • 用途：放射病、血小板减少症、白细胞减少症、急慢性 肝炎、心血管疾病和肌肉萎缩、肿瘤、病毒病
• 主要有叠氮胸苷、阿糖腺苷、阿糖胞苷、聚肌胞等。
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C F3
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I H2N HO
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NN O
OH 三氟代胸 苷
N3 叠氮 胸 苷
OH
NH
H2 N
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无 环鸟 苷
OH
NH
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H2 N
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N O
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丙氧 鸟 苷
OH 5 '- 碘 脱 氧 尿 苷
CH2O H CH2O H
OH
NH
N
H2 N HO
N
N
O OH
核酸类药物分析ppt课件
2
3
4
核酸、核苷酸类药物是指具有药用价值的核酸、核苷酸、 核苷和碱基以及它们的类似物或衍生物。 按照化学结构和组成可分成四类： ①核酸碱基及其衍生物，如硫鸟嘌呤、氟尿嘧啶、阿昔洛韦等； ②核苷及其衍生物，如肌苷、利巴韦林、阿糖胞苷； ③核苷酸及其衍生物，如三磷酸腺苷二钠、胞磷胆碱钠、环磷 腺苷； ④多核苷酸，如寡聚核苷酸、核糖核酸Ⅰ、核糖核酸Ⅱ、抗肿 瘤免疫核糖核酸等。
《中国药典》从２００５年版开始改用阳离子交换色 谱法对利巴韦林进行含量测定，结果有明显改善。
29
利巴韦林的含量测定。 色谱条件与系统适用性试验 用磺化交联的苯乙烯－
二乙烯基共聚物的氢型阳离子交换树脂为填充剂；以水（用 稀硫酸调节ｐＨ值至２.５±０.１） 为流动相；检测 波长为２０７ｎｍ。理论板数按利巴韦林峰计算不低于２０ ００。 离子交换色谱常使用水缓冲溶液作流动相，有时也通过加入 适量有机溶剂如甲醇或乙醇来提高分离度或改善样品的溶解 度。
（２）二苯胺反应 脱氧核糖核酸、脱氧核苷酸或脱氧核苷与酸共热水解产
生的脱氧核糖在乙醛存在下与二苯胺反应，生成蓝色化合物， 在５９５ｎｍ波长处有最大吸收。
核糖核酸、核糖核苷酸无此反应。
蓝色 595nm
11
２磷酸盐的鉴别 核酸、核苷酸类药物在酸性条件下加热水解产生的磷酸与过量
的钼酸铵［（ＮＨ４）３ＭｏＯ４］反应，生成磷钼酸铵放冷析 出黄色沉淀。此反应为磷酸盐的一般鉴别试验。
收波长的吸光度来测定含量，也可用带紫外检测器的ＨＰ ＬＣ法定量。
核酸类原料药的杂质较少时，可用非水碱量法或紫外 分光光度法定量；杂质较多时则需采用具有分离、分析能 力的高效液相色谱法。
22
（一）非水碱量法 １原理
核苷或碱基衍生物、类似物等药物的碱性较弱，在水溶 液中用酸滴定时没有明显的突跃，难以获得满意的测定结果。 而在冰醋酸溶剂中，弱碱性基团的相对碱强度得到显著增加， 可被高氯酸滴定液定量滴定，根据消耗的高氯酸滴定液体积 即可计算该类药物的含量。
3
4
核酸、核苷酸类药物是指具有药用价值的核酸、核苷酸、 核苷和碱基以及它们的类似物或衍生物。 按照化学结构和组成可分成四类： ①核酸碱基及其衍生物，如硫鸟嘌呤、氟尿嘧啶、阿昔洛韦等； ②核苷及其衍生物，如肌苷、利巴韦林、阿糖胞苷； ③核苷酸及其衍生物，如三磷酸腺苷二钠、胞磷胆碱钠、环磷 腺苷； ④多核苷酸，如寡聚核苷酸、核糖核酸Ⅰ、核糖核酸Ⅱ、抗肿 瘤免疫核糖核酸等。
《中国药典》从２００５年版开始改用阳离子交换色 谱法对利巴韦林进行含量测定，结果有明显改善。
29
利巴韦林的含量测定。 色谱条件与系统适用性试验 用磺化交联的苯乙烯－
二乙烯基共聚物的氢型阳离子交换树脂为填充剂；以水（用 稀硫酸调节ｐＨ值至２.５±０.１） 为流动相；检测 波长为２０７ｎｍ。理论板数按利巴韦林峰计算不低于２０ ００。 离子交换色谱常使用水缓冲溶液作流动相，有时也通过加入 适量有机溶剂如甲醇或乙醇来提高分离度或改善样品的溶解 度。
（２）二苯胺反应 脱氧核糖核酸、脱氧核苷酸或脱氧核苷与酸共热水解产
生的脱氧核糖在乙醛存在下与二苯胺反应，生成蓝色化合物， 在５９５ｎｍ波长处有最大吸收。
核糖核酸、核糖核苷酸无此反应。
蓝色 595nm
11
２磷酸盐的鉴别 核酸、核苷酸类药物在酸性条件下加热水解产生的磷酸与过量
的钼酸铵［（ＮＨ４）３ＭｏＯ４］反应，生成磷钼酸铵放冷析 出黄色沉淀。此反应为磷酸盐的一般鉴别试验。
收波长的吸光度来测定含量，也可用带紫外检测器的ＨＰ ＬＣ法定量。
核酸类原料药的杂质较少时，可用非水碱量法或紫外 分光光度法定量；杂质较多时则需采用具有分离、分析能 力的高效液相色谱法。
22
（一）非水碱量法 １原理
核苷或碱基衍生物、类似物等药物的碱性较弱，在水溶 液中用酸滴定时没有明显的突跃，难以获得满意的测定结果。 而在冰醋酸溶剂中，弱碱性基团的相对碱强度得到显著增加， 可被高氯酸滴定液定量滴定，根据消耗的高氯酸滴定液体积 即可计算该类药物的含量。
《基因治疗》PPT课件
DNA复合物 3. 多聚物/DNA复合物 4. 其它方法
1. 裸DNA
• 方法：直接注射或基因枪轰击 • 溶液类型对基因表达有影响：
重组DNA可贮存于5%-30%的蔗糖溶液中 也可用生理盐水或PBS
2. 脂质体/DNA复合物
形成高效包装DNA的人造膜，与细胞膜极为相似。 形成脂质双层包围水溶液的脂质微球，与细胞融合后被
重症综合性免疫缺乏症（SCID）
腺苷脱氨酶（ADA）缺乏症是常染色体隐性遗传的 致死性疾病，患者由于ADA缺乏导致脱苷腺氨酸增多， 改变了甲基化能力，致使淋巴细胞受损，从而导致 免疫缺陷
1990年，首次将ADA转基因T淋巴细胞注射到 人体骨髓组织（患有－－腺苷脱氨酶（ADA） 缺乏症的4岁儿童） ，治疗SCID
细胞内吞。
人工脂质体膜具有如下特点
1. 无毒性和免疫原性 2. 可生物降解，不会在体内堆积 3. 可制成球状(0.03-50 m)，包容大小不同的生物分子 4. 可带有不同的电荷 5. 具有不同的膜脂流动性、稳定性、及温度敏感性，能适
应不同的生理要求
3. 多聚物/DNA复合物
• 阳离子多聚体 • DNA带负电 • 细胞表面带负电
（一）基因治疗的病毒载体
• 应该具有的基本条件： I. 携带外源基因并能组装成病毒颗粒 II. 介导外源基因的转移和表达 III. 对机体没有致病能力
病毒载体的产生
➢ 充分了解载体病毒的基因组结构和功能（编码区/非编 码区、结构蛋白/非结构蛋白、必须基因/非必须基因 、包装容量等）
➢ 外源基因插入病毒基因组的非必须区 • 致病基因（裂解细胞、癌基因使细胞转化）删除 • 插入外源基因长度受限删除非必须基因/必须基因（
2．种系细胞的基因治疗：在生殖细胞（精子、卵子 或未分化的受精卵）中引入正常基因或修复缺陷基因 以校正遗传缺陷。引入的外源基因（整合到基因组） 能遗传给后代。
1. 裸DNA
• 方法：直接注射或基因枪轰击 • 溶液类型对基因表达有影响：
重组DNA可贮存于5%-30%的蔗糖溶液中 也可用生理盐水或PBS
2. 脂质体/DNA复合物
形成高效包装DNA的人造膜，与细胞膜极为相似。 形成脂质双层包围水溶液的脂质微球，与细胞融合后被
重症综合性免疫缺乏症（SCID）
腺苷脱氨酶（ADA）缺乏症是常染色体隐性遗传的 致死性疾病，患者由于ADA缺乏导致脱苷腺氨酸增多， 改变了甲基化能力，致使淋巴细胞受损，从而导致 免疫缺陷
1990年，首次将ADA转基因T淋巴细胞注射到 人体骨髓组织（患有－－腺苷脱氨酶（ADA） 缺乏症的4岁儿童） ，治疗SCID
细胞内吞。
人工脂质体膜具有如下特点
1. 无毒性和免疫原性 2. 可生物降解，不会在体内堆积 3. 可制成球状(0.03-50 m)，包容大小不同的生物分子 4. 可带有不同的电荷 5. 具有不同的膜脂流动性、稳定性、及温度敏感性，能适
应不同的生理要求
3. 多聚物/DNA复合物
• 阳离子多聚体 • DNA带负电 • 细胞表面带负电
（一）基因治疗的病毒载体
• 应该具有的基本条件： I. 携带外源基因并能组装成病毒颗粒 II. 介导外源基因的转移和表达 III. 对机体没有致病能力
病毒载体的产生
➢ 充分了解载体病毒的基因组结构和功能（编码区/非编 码区、结构蛋白/非结构蛋白、必须基因/非必须基因 、包装容量等）
➢ 外源基因插入病毒基因组的非必须区 • 致病基因（裂解细胞、癌基因使细胞转化）删除 • 插入外源基因长度受限删除非必须基因/必须基因（
2．种系细胞的基因治疗：在生殖细胞（精子、卵子 或未分化的受精卵）中引入正常基因或修复缺陷基因 以校正遗传缺陷。引入的外源基因（整合到基因组） 能遗传给后代。
2024版《生物化学》课件第八章核苷酸
《生物化学》课件第八章核苷酸目录•核苷酸概述与结构•核酸的理化性质与合成•DNA复制与修复机制•RNA转录后加工与修饰•核酸降解与代谢途径•核苷酸在生物技术应用中的研究进展01核苷酸概述与结构核苷酸定义及作用01核苷酸是核酸的基本组成单位，由磷酸、五碳糖和含氮碱基三部分组成。
02在生物体内，核苷酸具有多种生物学功能，如作为遗传信息的携带者、参与蛋白质合成、作为能量储存和转移分子等。
结构组成与分类核苷酸的结构包括磷酸基团、五碳糖和含氮碱基。
其中，五碳糖包括核糖和脱氧核糖两种，含氮碱基包括嘌呤和嘧啶两类。
根据五碳糖的不同，核苷酸可分为核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸两类。
根据含氮碱基的不同，核苷酸又可分为腺嘌呤核苷酸、鸟嘌呤核苷酸、胞嘧啶核苷酸和尿嘧啶核苷酸等。
核苷酸通过不同的排列组合方式，构成了生物体的遗传物质DNA 和RNA ，从而实现了遗传信息的传递和表达。
遗传信息的携带者在蛋白质合成过程中，mRNA 作为模板指导氨基酸的排列顺序，tRNA 则携带特定的氨基酸到核糖体上进行合成。
参与蛋白质合成ATP 是生物体内最重要的能量储存和转移分子，通过水解或合成反应释放或储存能量，从而维持生物体的正常生理功能。
能量储存和转移分子环核苷酸如cAMP 和cGMP 等作为第二信使参与细胞信号传导过程，调节细胞的代谢、生长和分化等。
细胞信号传导生物学意义及功能02核酸的理化性质与合成溶解性核酸可溶于水，微溶于乙醇，不溶于有机溶剂。
紫外吸收核酸在240-290nm波长范围内有强烈的紫外吸收，其最大吸收值在260nm附近。
变性、复性与杂交核酸在加热、极端pH、有机溶剂等条件下可发生变性，解离成单链；去除变性条件后，互补单链可重新结合，称为复性；不同来源的核酸单链只要序列互补也可复性，称为杂交。
酸碱性核酸在酸碱环境下可发生水解，生成磷酸、戊糖和含氮碱基。
核酸的理化性质核酸的合成途径DNA的生物合成包括DNA的复制和逆转录过程，其中DNA复制是以亲代DNA为模板合成子代DNA的过程，逆转录则是以RNA为模板合成cDNA的过程。
基因治疗PPT课件
3
❖ 黑色箭头所示：从患者体内分离细胞，在实验室中修饰后回输给患者（回体基因治疗） ❖ 灰色箭头所示：细胞在患者体内进行修饰（体内基因治疗）
4
基因治疗特点
❖ 普通的医疗方法对绝大多数遗传病都束手无策，即使治疗也是 治标不治本；基因治疗在基因水平上进行操作，能从源头上解 决疾病的发生。目前在没有治疗方法或疗效不佳的领域基因治 疗将大有作为
基因治疗
北京大学眼科中心 北京大学第三医院
1
目录
第一部分 基因治疗概述 第二部分 基因治疗载体选择 第三部分 基因治疗的发展历程 第四部分 临床基因治疗
2 2
一、基因治疗概述
❖ 1993年FDA定义： 基于修饰活细胞遗传物质而进行的医学干预
❖ 包括以下两方面： ➢ 患者体内分离细胞，进行体外修饰，随后再注入患者体内 ➢ 基因治疗产品直接注入患者体内，使细胞发生遗传学改变
10
❖ 反转录病毒含三个转录单位，还有一个顺式作用元件，在载体中，三个转录单位 被治疗基因替代，最大克隆的容量是8kb。重组体在特定细胞中包装，该细胞可提 供必需的三个转录单位，但不含完整的反转录病毒基因组。
11
腺病毒（AV）
❖ 双链DNA病毒，线性双链DNA基因组在细胞核内作为附加体 存在而不整合
26
首例基因治疗死亡病例
❖ 18岁的 Gelsinger成为第一例基因治疗死亡病例（1999年9月 17日）。患者患有鸟氨酸氨甲酰基转移酶缺陷，1999年在宾 西法尼亚大学接受以编码OTC基因的腺病毒基因治疗。为获得 足够的有功能的基因，通过肝动脉注射了大剂量的病毒载体。
❖ 半个世纪以来，分子生物以空前的速度迅猛发展，极大的推动了 基因工程技术和基因治疗的发展。
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❖ 黑色箭头所示：从患者体内分离细胞，在实验室中修饰后回输给患者（回体基因治疗） ❖ 灰色箭头所示：细胞在患者体内进行修饰（体内基因治疗）
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基因治疗特点
❖ 普通的医疗方法对绝大多数遗传病都束手无策，即使治疗也是 治标不治本；基因治疗在基因水平上进行操作，能从源头上解 决疾病的发生。目前在没有治疗方法或疗效不佳的领域基因治 疗将大有作为
基因治疗
北京大学眼科中心 北京大学第三医院
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目录
第一部分 基因治疗概述 第二部分 基因治疗载体选择 第三部分 基因治疗的发展历程 第四部分 临床基因治疗
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一、基因治疗概述
❖ 1993年FDA定义： 基于修饰活细胞遗传物质而进行的医学干预
❖ 包括以下两方面： ➢ 患者体内分离细胞，进行体外修饰，随后再注入患者体内 ➢ 基因治疗产品直接注入患者体内，使细胞发生遗传学改变
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❖ 反转录病毒含三个转录单位，还有一个顺式作用元件，在载体中，三个转录单位 被治疗基因替代，最大克隆的容量是8kb。重组体在特定细胞中包装，该细胞可提 供必需的三个转录单位，但不含完整的反转录病毒基因组。
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腺病毒（AV）
❖ 双链DNA病毒，线性双链DNA基因组在细胞核内作为附加体 存在而不整合
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首例基因治疗死亡病例
❖ 18岁的 Gelsinger成为第一例基因治疗死亡病例（1999年9月 17日）。患者患有鸟氨酸氨甲酰基转移酶缺陷，1999年在宾 西法尼亚大学接受以编码OTC基因的腺病毒基因治疗。为获得 足够的有功能的基因，通过肝动脉注射了大剂量的病毒载体。
❖ 半个世纪以来，分子生物以空前的速度迅猛发展，极大的推动了 基因工程技术和基因治疗的发展。
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二、基因工程的基本步骤
目的基因获得 表达载体构建与鉴定 基因的导入 整合与表达的鉴定
核酸药物
表达产物的提取、纯化与鉴定
基因工程药物
第二节 基因工程中的方法学
一、基因工程的基本技术
（一）核酸的提取纯化
1. RNA提取纯化技术；
2. DNA提取纯化技术；
3. plasmid提取纯化技术。
（二）核酸电泳技术
第08章 核酸药物与 基因治疗
第一节 基因工程原理简介
一、基因工程的定义
本义：根据人们的意愿，利用工程设计的方法，在体外将
克隆获得的目的基因与适当的载体进行切割和连接，构建成正 确的重组表达载体，再应用物理的、化学的或生物学的方法将 该表达载体导入到细菌、动植物细胞或受精卵中，使目的基因 在宿主体内以瞬时方式或稳定方式进行表达，借此研究目的基 因的结构与功能，或赋予宿主以新的遗传性状，或获得该基因 的表达产物。这一过程就是基因工程。 广义：转基因动物；克隆；基因打靶；基因组计划等均属 于基因工程的范畴。
三、基因工程中的工具
（一）载体
1.质粒(plasmid) 2.粘粒(cosmid) 3.λ 噬菌体(λ phage)
（二）工具酶
1.限制性内切酶 2.外切酶 3.连接酶 4.聚合酶: klenow I 5.核酸酶
（三）宿主菌 DH5, JM101, JM109; DE3等
四、获得目的基因的方法基因（基因组和cDNA），化学合
成，PCR 等方法。还有DD-PCR以组 基因或构建与鉴定
1. DNA（载体和目的片段）的酶切与回收。
2. 目的片段与载体的连接。二者的摩尔比应满足以下
比例：粘端：3~5:1；钝端：6~8:1 3. 转化与重组质粒的筛选、鉴定。 1）初步鉴定：抗性；α-互补；快速鉴定；原位杂交； PCR。 2）酶切鉴定：大小和方向。 3）测序鉴定：双脱氧测序法。
六、基因导入技术
（一）细菌
1.氯化钙； 2.电穿孔技术。 Nhomakorabea（二）细胞
1.脂质体； 3.电穿孔； 5.Virus Vector。 2.磷酸钙； 4.显微注射；
（二）真核表达系统：传代细胞；酵母；生物反应器等。
1. 传代细胞：如CHO、BHK、Vero、MDCK等；
2. 酵母：毕赤（甲醇）酵母。 3. 生物反应器：如乳腺、血液、尿液、鸡蛋、昆虫等。 世界上第一个动物（山羊）乳腺生物反应器产品—重组人 抗凝血酶Ⅲ（商品名ATryn ）于2006年获准上市。由全球最著 名的动物乳腺生物反应器研发企业——美国Genzyme转基因公 司研制成功。
公司
Abgenix Abgenix PPL Therapeutics Genzyme Transgenics Genzyme Transgenics Pharming PPL Therapeutics PPL Therapeutics PPL Therapeutics PPL Therapeutics Genzyme Transgenics Genzyme Transgenics Genzyme Transgenics PPL Therapeutics PLL Therapeutics Genzyme Transgenics
1. 琼脂糖凝胶电泳 2. SDS-PAGE
（三）感受态细胞的制备与转化
真核细胞总RNA的电泳结果：
核酸电泳技术
1. 琼脂糖凝胶电泳
1 2 3 4 5
2. SDS-PAGE
2000 1000 750 500
200 100
1 DL2000 marker 2 BamHI和EcoRI双切 3 BamHI单切 4 HindⅢ单切 5 重组质粒pVAX1/ABPS1
（三）受精卵
1.显微注射； 2.电穿孔技术； 3.精子载体； 4.ESC； 5.Virus Vector（ RT-V or Lentivirus-V）。
七、常用表达系统
（一）原核表达系统：包涵体；分泌型。
已成功的基因工程产品绝大部分是利用原核系统生产的， 如IFN、IL、TNF、G-CSF、GM-CSF等。
Genzyme Transgenics,Nexia Biotechnologies,PPL therapeutics
纤维蛋白原表面蛋白B,原胶原重组抗体 小鼠
凝血因子Ⅷ，蛋白C, 血红蛋白 PPLTherapeutics CT,IGF-1,IL-2,EPO,GH,细胞外SOD, a2-葡糖苷酶,糖原样肽 α 1-抗胰蛋白酶, 凝血因子Ⅷ,Ⅸ, 兔 兔 绵羊 猪
二、一些重要技术原理介绍
重点：DNA双脱氧测序技术，核酸探针技术，
PCR技术等。（参见第5章）
（一）DNA双脱氧测序
（二）核酸杂交技术 （三）PCR技术
（四）目的基因的改造技术
1. 引物介导的基因定点突变技术
2. 盒式突变(cassette mutagenesis) 3. Genes Shuffling
表1. 部分已表达的蛋白质 重组蛋白
LA,α -LA, 单抗, 溶菌酶, Genetic
动物
牛
生产公司
Advanced Cell Technology,
GH, INS, HSA
Pharming ATⅢ,tPA,单抗,GH,α 1-抗胰蛋白酶
牛
山羊
Savings and Clone, Infigen,
Abgenix,Medarex
Alexion,Biotransplant, Pharming, PPLTherapeutics Pharming, PPLTherapeutics PPL Therapeutics PPL Therapeutics
NATURE Biotechnology, October,2000 IGF-1 ,纤维蛋白原 绵羊
国外公司已开发的部分转基因动物产品
Development status of a selected list of proteins produced by transgenic animals 蛋白/肽
ABX-IL8 mAb ABX-EGF mAb a-1-抗胰蛋白酶 a-1蛋白酶抑制剂 β- IFN 胶原 II 因子 VII 因子 XI 纤维蛋白原 胰高血素样肽-1 人 GH HAS MSP-1 (疟疾苗) 蛋白 C 降钙素 (salmon) tPA