谷氨酸棒杆菌发酵工艺控制
谷氨酸发酵 实验报告(1)
兰州大学生命科学学院发酵工程实验谷氨酸发酵实验摘要：谷氨酸棒杆菌在合适的培养基中经摇瓶培养能快速生长，为发酵实验准备菌种。
还原糖的消耗和谷氨酸的生成是衡量谷氨酸发酵是否正常的重要标志，所以在发酵过程中，要求每两个小时测定一次还原糖的含量，并据此作出发酵的糖耗曲线。
关键字：种子的制备、发酵罐、谷氨酸棒杆菌、PH的调节引言：了解发酵工业菌种制备工艺和质量控制，为发酵实验准备菌种。
了解发酵罐罐体构造和管道系统，掌握对发酵罐及其管道系统的灭菌方法。
了解发酵罐的操作，完成谷氨酸发酵的全过程。
还原糖的消耗和谷氨酸的生成是衡量谷氨酸发酵是否正常的重要标志，在发酵后期当还原糖降至1％以下时，表明谷氨酸发酵已经完成。
所以在发酵过程中，要定时测定还原糖的含量，要求每两个小时测定一次，并据此作出发酵的糖耗曲线。
掌握还原糖和总糖的测定原理，学习用比色法测定还原糖的方法。
学习使用茚三酮比色法检测发酵液中谷氨酸浓度的方法。
谷氨酸棒杆菌通常在0-12小时为生长期，12小时后为产酸期，所以应该从12小时以后开始检测谷氨酸的含量，每两个小时取一次样。
原理:谷氨酸棒杆菌在合适的培养基中经摇瓶培养能快速生长，得到大量健壮的种子。
谷氨酸棒杆菌生长速度较快，接种量一般在1-2%。
谷氨酸发酵是有氧发酵，发酵罐由蒸汽管道、空气管道、加料出料管道等组成，在实验之前必须先对发酵罐进行空消。
谷氨酸产生菌是代谢异常化的菌种，对环境因素的变化很敏感，在适宜的培养条件下，谷氨酸产生菌能够将50％以上的糖转化成谷氨酸，而只有极少量的副产物。
如果培养条件不适宜，则几乎不产生谷氨酸，仅得到大量的菌体或者由发酵产生的乳酸、琥珀酸、а－酮戊二酸、丙氨酸、谷氨酰胺、乙酰谷氨酰胺等产物。
生产上的中间分析只测定一些主要数据，只能显示微生物代谢的一般概况而不能反映细微的生化变化。
因此，进一步完善生化分析项目，从生化角度对发酵进行控制，从而确定最适宜的工艺条件是提高发酵水平的重要课题之一。
4谷氨酸发酵控制
由于各种微生物所具有的酶系不同，所 能利用的碳源往往是不同的。目前所发现的 谷氨酸产生菌均不能直接利用淀粉，只有利 用葡萄糖、果糖、蔗糖和麦芽糖等单糖或双 糖，有些菌种能够利用醋酸、乙醇、正烷烃 等。由于国内绝大多数味精厂采用的碳源为 淀粉水解糖，因此这里主要介绍淀粉水解糖 作业碳源的发酵。
培养基中糖浓度对谷氨酸发酵有很大影 响。在一定范围内，谷氨酸产酸率随糖浓 度增加而增加，但当糖浓度过高时，由于 渗透压增大，对菌体生长和发酵均不利， 当工艺条件配合不当时，糖酸转化率相当 低。同时培养基浓度大，氧溶解的阻力也 增大，影响供氧效率。
由于双酶法（高温淀粉酶液化、糖化 酶水解）对原料中生物素等营养因子破坏 很少，因此采用双酶法制糖时，如果采用 生物素亚适量工艺进行谷氨酸发酵，尽量 采用精制淀粉。
4.1.2 氮源
氮源是合成菌体蛋白质、核酸等含氮物 质和合成谷氨酸氨基的来源。同时，在发酵 过程中一部分氨用于调节发酵液pH，形成谷 氨酸铵。因此，谷氨酸发酵需要的氮源比一 般的发酵工业要高，一般发酵工业碳氮比为 100: 0.2～2.0，而谷氨酸发酵的碳氮比为 100: 15～30。
磷酸盐对谷氨酸发酵影响很大。当磷 酸盐偏高时，菌体代谢转向合成缬氨酸； 但如磷酸盐过低，菌体生长也不好，造成 延长发酵时间，影响谷氨酸的合成。
②硫酸镁 Mg2+许多重要酶(如己糖磷酸化酶、异柠 檬酸脱氢酶、羧化酶等)的激活剂。如果Mg2+ 含量太少，就会影响其底物的氧化。一般革 兰氏阳性菌对Mg2+的最低要求为25mg/L；革 兰氏阴性菌为4～5mg/L。 MgSO4· 2O中含Mg2+ 9.87%，发酵培 7H 养基中添加0.5g/L MgSO4· 2O时，Mg2+浓 7H 度约为50mg/L。
谷氨酸发酵工艺流程
目录一、谷氨酸简介 (2)二、谷氨酸发酵的工艺流程 (2)2.1谷氨酸生产菌种 (3)2.2生产原料 (3)2.3培养基制备 (3)2.3.1碳源 (3)2.3.2氮源 (3)2.3.3生物素 (4)2.4种子扩大培养 (4)2.5谷氨酸发酵 (4)三、谷氨酸发酵的工艺控制 (4)3.1环境控制 (4)3.1.1pH (4)3.1.2温度 (4)3.1.3通风量 (5)3.1.4泡沫 (5)3.1.5无菌 (5)3.2.细胞膜渗透性控制 (5)四、小结 (5)五、参考文献 (6)谷氨酸发酵工艺山东农业大学生命科学学院08级生物工程2班邢若枫摘要：众所周知，日常所用调味料味精就是L一谷氨酸单钠盐(monosodiuo gluamate，MsG)。
自1909年日本发明并工业化生产味情以来，几经变迁，已发展成为以谷氨酸发酵为主体的世界性氨基酸发酵工业。
1956年从日本开始，以后先后由面二筋豆粕和废糖蜜浓缩物水解的方向，转向以糖质为原料的细菌发酵法。
生产味精谷氨酸之类氨基酸的发酵，区别于传统的酿酒和抗菌素发游，是一种改变微生物代谢的代谢控制发酵。
本文则就谷氨酸发酵生产过程、谷氨酸发酵机制和研究动向等方面，说明谷氨酸发酵的发展。
[1]关键词：谷氨酸；发酵；工艺；研究；发展一、谷氨酸简介谷氨酸一种酸性氨基酸，分子内含两个羧基，化学名称为α-氨基戊二酸。
为无色晶体，有鲜味，微溶于水，而溶于盐酸溶液，等电点3.22。
大量存在于谷类蛋白质中，动物脑中含量也较多。
分子式C5H9NO4、分子量147.13076。
谷氨酸在生物体内的蛋白质代谢过程中占重要地位，参与动物、植物和微生物中的许多重要化学反应。
谷氨酸可生产许多重要下游产品如L—谷氨酸钠、L—苏氨酸、聚谷氨酸等。
氨基酸作为人体生长的重要营养物质，不仅具有特殊的生理作用，而且在食品工业中具有独特的功能。
谷氨酸钠俗称味精，是重要的鲜味剂，对香味具有增强作用。
谷氨酸钠广泛用于食品调味剂，既可单独使用，又能与其它氨基酸等并用。
谷氨酸发酵过程控制—谷氨酸棒杆菌三角瓶液体培养
2、培养条件 ①温度 种子培养应选择最适温度。 ②通气量 足够的通气量可以提高种子质量。
3、接种量 接种量的大小决定于生产菌种在发酵罐中生长繁
殖的速度。接种量过大会引起溶氧不足，影响产物合 成；接种量过小会延长培养时间，降低发酵罐的生产 率。
通 常 接 种 量 ： 细 菌 1-5% ， 酵 母 菌 5-10% ， 霉 菌 715%，有时20-25%。
请阅读引导文，并回答以下问题：
1、由斜面接种至液体培养基，采用什么接种工具？ 2、无菌操作接种应该在什么环境下进行？ 3、谷氨酸棒杆菌摇瓶种子培养条件和培养时间？
❖ 由斜面接种至液体培养基，采用的接种工具:接种环。 ❖ 接种环境：必须在一个无杂菌污染的环境中进行严格的
无菌操作。
摇瓶培养条件和时间： 培养时间12h; 设置摇床转速100rpm; 培养温度33-34℃。
谷氨酸发酵条件控制-谷氨酸棒杆菌三角瓶液体培养
谷氨酸的生产工艺流程： 一级种子扩大培养
摇瓶培养（三角瓶培养）的目的：
产生大量繁殖活力强的菌体，培养基组分应以少含 糖分，多含有机氮为主，培养条件有利于长菌。
1、培养基 种子培养基要满足以下要求： （1）营养成分适合种子培养的需要； （2）选择有利于孢子发芽和菌体生长的培养基； （3）营养上要易于被菌体直接吸收和利用； （4）营养成分要适当丰富和完全，氮源和维生素 含量要高； （5）营养成分要尽可能与发酵培
谷氨酸发酵
谷氨酸发酵目前工业上应用的谷氨酸产生菌有谷氨酸棒状杆菌、乳糖发酵短杆菌、散枝短杆菌、黄色短杆菌、噬氨短杆菌等。
我国常用的菌种有北京棒状杆菌、纯齿棒状杆菌等。
谷氨酸除用于制造味精外，还可以用来治疗神经衰弱以及配制营养注射液等。
我国的谷氨酸发酵虽然在产量、质量等方面有了较大的提高，但与国外先进水平相比还存在一定差距。
主要表现在：设备陈旧，规模小，自控水平、转化率和提取率低，易受噬菌体污染，废水污染问题尚未完全解决等。
一、菌种的选育主要通过基因突变、基因工程、细胞工程得到优良的菌种。
可以从自然界中先分离出相应的菌种，再用物理或化学的方法使菌种产生突变，从突变个体中筛选出符合生产要求的优良菌种。
在谷氨酸发酵中，如果能够改变细胞膜的通透性，使谷氨酸不断地排到细胞外面，就会大量生成谷氨酸。
研究表明，影响细胞膜通透性的主要因素是细胞膜中的磷脂含量。
因此，对谷氨酸产生菌的选育，往往从控制磷脂的合成或使细胞膜受损伤入手，以提高细胞膜对谷氨酸的通透性，如生物素缺陷型菌种的选育。
1.谷氨酸生产菌的生化特征1. α-酮戊二酸氧化能力微弱: α-酮戊二酸脱氢酶丧失或活性低.2. 谷氨酸脱氢酶活性强.3. 还原性辅酶Ⅱ(NADPH+H+)进入呼吸链能力缺陷或微弱.4. 异柠檬酸裂解酶活力微弱.5. 不利用谷氨酸.6. 耐高糖耐高谷氨酸 .7. CO2固定能力强.8 .解除谷氨酸反馈抑制.9. 具有向胞外分泌谷氨酸的能力.2.谷氨酸产生菌棒杆菌属：北京棒杆菌钝齿棒杆菌谷氨酸棒杆菌短杆菌属：黄色短杆菌产氨短杆菌小杆菌属：嗜氨小杆菌节杆菌属：球形节杆菌3.共同点：1. α-酮戊二酸氧化能力微弱: α-酮戊二酸脱氢酶丧失或活性低.2. 谷氨酸脱氢酶活性强.3. 还原性辅酶Ⅱ(NADPH+H+)进入呼吸链能力缺陷或微弱.4. 异柠檬酸裂解酶活力微弱.5. 不利用谷氨酸.6. 耐高糖耐高谷氨酸 .7. CO2固定能力强.8 .解除谷氨酸反馈抑制.9. 具有向胞外分泌谷氨酸的能力.谷氨酸棒状杆菌谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)是好氧细菌，可用于微生物发酵工程生产谷氨酸来制取谷氨酸钠（味精），谷氨酸棒状杆菌在发酵过程中要不断地通入无菌空气，并通过搅拌使空气形成细小的气泡，迅速溶解在培养液中（溶氧）；在温度为摄氏30到37度，pH为7到8的情况下，经28到32小时，培养液中会生成大量的谷氨酸。
谷氨酸发酵影响因素及控制
生物素对菌体细胞膜通透性的影响
谷氨酸发酵采用的菌种都是生物素缺陷型，而生物 素又是菌体细胞膜合成的必须物质，因此，可以通 过控制生物素的浓度，来实现对菌体细胞膜通透性 的调节。
生物素对细胞膜合成的影响主要是通过对细胞膜的 主要成分——磷脂中的脂肪酸的生物合成来实现的， 当限制了菌体脂肪酸的合成时，细胞就会形成一个 细胞膜不完整的菌体。生物体内脂肪酸的合成途径 如下：
谷氨酸发酵是典型的代谢控制发酵 发酵过程中，谷氨酸的大量积累不是
由于生物合成途径的特异，而是菌体代谢 调节控制和细胞膜通透性的特异调节以及 发酵条件的适合。
整个发酵过程可简单的分为2个阶段: 第1阶段是菌体生长阶段; 第2阶段是产酸阶段,谷氨酸得以大量积累
。
第二节 影响谷氨酸产量的因素及发酵条件控制
NH4+不足：不利于-酮戊二酸的还原氨基化， -酮戊二酸积累，引起反馈调节
影响因素3：NH4+浓度
NH4+的供给方式（流加）： （1）液氨 （2）0.8%尿素
影响因素氨酸的产量随糖含量的增加而增加 ，但糖含量过高，渗透压过大，对菌体生长不利， 谷氨酸对糖的转化率低。
我国使用的生产菌株：
北京棒杆菌(Corynebacterium pekinense) AS1.299
北京棒杆菌D110
钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum) AS1.542
棒杆菌(Corynebacterium sp.)S-914 黄色短杆菌T6~13
生产菌株特点
在己报道的谷氨酸生产菌中，除芽孢杆菌外 ，虽然它们在分类学上属于不同的属种，但都有 一些共同特点: 1. 革兰氏阳性 2. 菌体为球形、短杆至棒状 3. 不形成芽孢 4. 没有鞭毛，不能运动 5. 需要生物素作为生长因子 6. 在通气条件下才能产生谷氨酸。
谷氨酸发酵的工艺流程
谷氨酸发酵的工艺流程
《谷氨酸发酵的工艺流程》
谷氨酸是一种重要的氨基酸，广泛应用于食品、医药和化工等领域。
发酵工艺是生产谷氨酸的主要方法之一，下面将介绍谷氨酸发酵的工艺流程。
1. 选择菌株：选择适合发酵生产的菌株是谷氨酸发酵工艺的第一步。
通常采用属于放线菌属或棒状杆菌属的菌株进行发酵。
这些菌株具有较高的谷氨酸产量和较好的耐受性。
2. 发酵培养基的配制：发酵培养基是支撑谷氨酸发酵的重要基础。
一般包括碳源、氮源、无机盐、生长因子等组成成分。
常用的碳源包括葡萄糖、麦芽糖等，氮源包括氨基酸、尿素等。
3. 发酵条件控制：发酵过程中的温度、pH值、氧气供应等条件都会影响谷氨酸的产量。
通常采用恒温发酵，温度一般控制在28-32摄氏度。
同时控制好培养基的pH值，通常在6.5-7.5之间。
氧气供应也是非常重要的，通过控制搅拌速度和通气量来保证充足的氧气供应。
4. 发酵过程监测：在发酵过程中需要对微生物生长、培养基中各种成分的消耗和产物的生成进行持续监测。
通过检测微生物生长曲线和培养基中各成分的浓度变化来掌握发酵情况，及时调整发酵条件以提高产量。
5. 发酵产物的提取与精制：发酵结束后，需要对发酵产物进行
提取和精制。
通常采用离心、过滤等方法将微生物分离，然后通过酸碱调节、浓缩、结晶等工艺步骤来得到纯净的谷氨酸产物。
通过以上工艺流程，谷氨酸发酵生产可以实现高效、稳定的产量，并且能够得到高纯度的产物，满足市场需求。
氨基酸类药物的发酵生产—谷氨酸的发酵生产
生物素的来源：氨基酸生产上可以作为生物素来源的原料 有玉米浆、麸皮水解液、糖蜜及酵母水解液等，通常选取 几种混合使用。例如，许多工厂选择纯生物素、玉米浆、 糖蜜这三种物质来配制培养基。各种原料来源及加工工艺 不同，所含生物素的量不同。玉米浆含生物素500μg/kg， 麸皮含生物素300μg/kg，甘蔗糖蜜含生物素1500μg/kg。
操作简单 周期长，占地面积大。
直接常温等电点法工艺流程
发酵液
起晶中和点（pH4-4.5) 育晶（2h）
盐酸
菌体及细小的 谷氨酸晶体
等电点搅拌pH3-3.22 静置沉降4-6h 离心分离
成品
母液
干燥
湿谷氨酸晶体
2、离子交换法
可用阳离子交换树脂来提取吸附在树脂上的谷氨 酸阳离子，并可用热碱液洗脱下来，收集谷氨酸 洗脱流分，经冷却、加盐酸调pH 3.0～3.2进行结 晶，之后再用离心机分离即可得谷呈棒形或短杆形； 革兰氏阳性菌，无鞭毛，无芽孢；不能运动； 需氧性的微生物； 生物素缺陷型； 脲酶强阳性； 不分解淀粉、纤维素、油脂、酪蛋白、明胶等；
发酵中菌体发生明显形态变化，同时细胞膜渗透性改变； 二氧化碳固定反应酶系强； 异柠檬酸裂解酶活力欠缺或微弱，乙醛酸循环弱； α-酮戊二酸氧化能力微弱； 柠檬酸合成酶、乌头酸酶、异柠檬酸脱氢酶、谷氨酸脱氢酶活
有机氮丰富有利于长菌，因此谷氨酸发酵前期要 求一定量的有机氮，通常在基础培养基中加入适 量的有机氮，在发酵过程中流加尿素、液氨或氨 水来补充无机氮。
（3）无机盐
磷酸盐 ：工业生产上可用K2HPO4·3H2O、KH2PO4、 Na2HPO4·12H2O、NaH2PO4·2H2O等磷酸盐，也可用磷酸。 过高：代谢转向合成缬氨酸。 过低：菌体生长缓慢。
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种子培养基：每升含葡萄糖60g，KH2PO4 2.5g , MgSO4.7H2O 0.5g (NH4)2SO4 5g ,玉米浆30g ,pH 7.2 115℃ 20min
发酵培养基：每升含葡萄糖70g，KH2PO4 2.5g, K2HPO4 2.5g, MgSO4.7H2O 0.5g, (NH4)2SO4 25g ,玉米浆45g ,pH7.0 （四）罐上的工艺控制
1）预热：打开夹套蒸汽进汽阀，微开排污阀，将罐温加热至100℃2）灭菌：关闭夹套蒸汽进汽阀，开启蒸汽进罐阀，使罐温升至121℃；打开空气管路蒸汽阀门对空气过滤器进行灭菌；调整蒸汽进罐阀、排气阀的开度使罐压保持在0.12MPa左右（如此时温度与121℃相差较大，则可用121℃重新标定罐内温度）；保持30min；关闭所有蒸汽阀门，让罐压下降至0.01MPa，打开空气进气阀，引无菌空气保压（0.03~0.05MPa），确保罐压小于过滤器空气压。
3）发酵准备阶段：开启冷却模式，开启进水阀，快速降温至28℃；退出冷却模式，开启发酵模式，保温运作；开启搅拌器（100rpm），如果排气阀没有过度的逃液，则可加大搅拌速率，或加大空气进气量。
4）发酵：采用火焰法接种，调节排气阀、进气阀开度，还有搅拌器速率，在不过分逃液的前提下，保持较高的DO值；发酵过程中微开取样管路（蒸汽进罐阀紧闭）保持较小的蒸汽排出（时刻保持取样管路无菌）。
5）取样：关闭蒸汽排出阀，关闭蒸汽进汽阀，开启蒸汽排出阀，开启蒸汽进罐阀，并调节该两阀门的开度使发酵液以适宜的流量流出，用三角瓶接约20mL；关闭蒸汽进罐阀门，开启蒸汽进汽阀。
6）放罐：关闭空气进气管路，开启夹套加热管路，关闭冷凝水管路，关闭蒸汽排出阀，引蒸汽进罐，待罐温升至100℃后，计时3min；关闭蒸汽进罐阀，关闭蒸汽进汽阀；开启空气进气管路，开启蒸汽进罐阀，利用压强将液体放出；放完后，关闭空气进气管路；通自来水按以上步骤洗罐3次；通入自来水，待下次发酵开始。