实验二 沉淀反应(2015修改)
实验二蛋白质的等电点测定和沉淀反应(精)
现象
解释
5．乙醇引起的变性与沉淀
管号 1 2
3
操作 振荡混匀 加数滴盐酸 振荡混匀 醋酸中和 加数滴盐酸 振荡混匀 碳酸钠中和 加数滴盐酸
现象
解释
思考题
1.鸡蛋清为何可做铅、汞中毒的解素剂？ 2.氯化汞为何能做为杀菌剂？ 3.什么是蛋白质的等电点？ 4.在等电点时，蛋白质溶液为什么容易发生
沉淀 ？
• 本实验通过观察不同pH溶液中的溶解度以测 定酪蛋白的等电点。用醋酸与醋酸钠（醋酸 钠混合在酪蛋白溶液中）配制各种不同pH值 的缓冲液。向诸缓冲溶液中加入酪蛋白后， 沉淀出现最多的缓冲液的pH值即为酪蛋白的 等电点。
• 在水溶液中的蛋白质分子由于表面生成 水化层和双电层而成为稳定的亲水胶体 颗粒，在一定的理化因素影响下，蛋白 质颗粒可因失去电荷和脱水而沉淀。
此时蛋白质分子内部结构发生重大改变， 蛋白质常变性而沉淀，不再溶于原来溶剂 中。加热引起的蛋白质沉淀与凝固，蛋白 质与重金属离子或某些有机酸的反应都属 于此类。
蛋白质变性后，有时由于维持溶液 稳定的条件仍然存在（如电荷），并不 析出。因此变性蛋白质并不一定都表现 为沉淀，而沉淀的蛋白质也未必都已变 性。
蛋白质的沉淀反应可分为 两类。
可逆的沉淀反应
此时蛋白质分子的结构尚未发生显著变 化，除去引起沉淀的因素后，蛋白质的沉 淀仍能溶解于原来的溶剂中，并保持其天 然性质而不变性。如大多数蛋白质的盐析 作用或在低温下用乙醇（或丙酮）短时间 作用于蛋白质。提纯蛋白质时，常利用此 类反应。
不可逆沉淀反应
实验二、蛋白质 等电点测定及沉淀反应
一、实验目的
1、了解蛋白质的两性解离性质 2、学习测定蛋白质等电点的一种方法 3、加深对蛋白质胶体溶液稳定因素的认识。 4、了解沉淀蛋白质的几种方法及其实用意义。 5、了解蛋白质变性与沉淀的关系。
沉淀反应实验报告-沉淀实验实验报告
实验蛋白质的沉淀反应与颜色反应一、实验目的掌握鉴定蛋白质的原理和方法。
熟悉蛋白质的沉淀反应，进一步熟悉蛋白质的有关反应。
二、实验原理蛋白质分子中某种或某些集团可与显色剂作用，产生颜色。
不同的蛋白质由于所含的氨基酸不完全相同，颜色反应亦不完全相同。
颜色反应不是蛋白质的专一反应，一些非蛋白物质也可产生同样的颜色反应，因此不能根据颜色反应的结果来决定被测物是否为蛋白质。
另外，颜色反应也可作为一些常用蛋白质定量测定的依据。
蛋白质是亲水性胶体，在溶液中的稳定性与质点大小、电荷、水化作用有关，但其稳定性是有条件的，相对的。
如果条件发生了变化，破坏了蛋白质的稳定性，蛋白质就会从溶液中沉淀出来。
三、实验仪器1、吸管2、滴管3、试管4、电炉5、ph试纸6、水浴锅7、移液管四、实验试剂1、卵清蛋白液：鸡蛋清用蒸馏水稀释10-20倍，3-4层纱布过滤，滤液放在冰箱里冷藏备用。
2、 0.5%苯酚：1g苯酚加蒸馏水稀释至200ml。
3、millon’s试剂：40g汞溶于60ml浓硝酸（水浴加温助溶）溶解后，冷却，加二倍体积的蒸馏水，混匀，取上清夜备用。
此试剂可长期保存。
4、尿素晶体5、1%cuso：1g cuso晶体溶于蒸馏水，稀释至100ml 446、10%naoh：10g naoh溶于蒸馏水，稀释至100ml7、浓硝酸8、0.1%茚三酮溶液：0.1g茚三酮溶于95%的乙醇并稀释至100ml.9、冰醋酸10、浓硫酸11、饱和硫酸铵溶液：100ml蒸馏水中加硫酸铵至饱和。
12、硫酸铵晶体：用研钵研成碎末。
13、95%乙醇。
14、醋酸铅溶液：1g醋酸铅溶于蒸馏水并稀释至100ml15、氯化钠晶体16、10%三氯乙酸溶液：10g三氯乙酸溶于蒸馏水中并稀释至100ml17、饱和苦味酸溶液：100ml蒸馏水中加苦味酸至饱和。
18、1%醋酸溶液。
五、实验步骤蛋白质的颜色反应（一）米伦（millon’s）反应1、苯酚实验：取0.5%苯酚溶液1ml于试管中，加millon’s试剂0.5ml，电炉小心加热观察颜色变化。
实验二、沉淀反应
实验二沉淀反应一、实验目的1、了解沉淀的生成、溶解和沉淀的转化条件，掌握沉淀平衡，同离子效应以及溶度积原理。
2、学习离子分离操作和同离子效应和电动离心机的使用。
二、实验的内容1、沉淀的生成和溶解①查表得：PbI2的ksp为7.1×10-9取1d 0.1mol/L的Pb（NO3）2+9d水，取1d+9d水，配成1×10-3mol/L的Pb（NO3）2溶液取1d 0.1mol/L的kI+9d水，取其中1d+9d水，再取1d+1d 水+首先配好的1×10-3mol/L的Pb（NO3）2溶液2d→不出现黄色沉淀，溶液无变化。
计算：Q=【pb2+】·【I-】2=25/8×10-11﹤ksp计算值也不应该有沉淀。
反应方程：pb2++ 2I-≒pbI2实验结论：1、计算结果与实际相符，Q﹤ksp，不出现沉淀2、没看到pbI2黄色沉淀，不等于不存在pbI2，溶液中还是存在少量的pbI2②查表得：pbs的ksp=8×10-28 pbcro4ksp=2.8×10-13取1d 0.1mol/L的Na2S+1d0.1mol/L的k2cro4,稀释至2.5mL 取1d上述溶液+1d 0.1mol/L的Pb（NO3）2→有棕黄色的混合沉淀出现。
计算：Q﹙pbs﹚=【S2-】【pb2+】=4×10-6﹥其kspQ﹙pbcro4﹚=【S2-】【cro42-】=4×10-6﹥其ksp反应方程：pb2++ S2-≒pbs pb2++ cro42-≒pbcro4实验结论：只要Q﹥ksp，就会出现沉淀，在同一溶液中也不会因沉淀的ksp的大小而出现沉淀的先后，而是同时沉淀。
如随着某离子的加入，Q先达到某个沉淀的ksp，后达到另一个沉淀的ksp，这是才会出现沉淀的先后之分。
2、沉淀的溶解和转化1d 0.1mol/L Pb（NO3）2+2d 0.1mol/L NaCL→Pbcl2↓（白色）+2d 0.1mol/L kI溶液→pbI2↓(黄色) {离心，去掉上清液→稀释至0.5mL}+饱和Na2so4晶体→ pbso4↓(白色) +0.1mol/L k2cro4→pbcro4↓（黄色）+2~3d 0.1mol/L k2S→pbs↓(黑色) {离心，取上清液，颜色为粉红色}★查表得：ksp（Pbcl2）=1.6×10-5 ksp（pbI2）=7.1×10-9 ksp（pbso4）=1.6×10-8ksp（pbcro4）=2.8×10-13 ksp（pbs）=8×10-28★计算：例Pbcl2转化为pbI2的过程：Pbcl2+ 2I-≒pbI2+2cl-K°=【cl-】2/【I-】2=【pb2+】【cl-】2/【pb2+】【I-】2= ksp （Pbcl2）/ ksp（pbI2）=1.6/7.1×104K°值越大，沉淀转化的越完全，对同一类型的沉淀来说，溶度积越大的沉淀越易转化成溶度积小的沉淀对ksp小→ksp大的方向进行的特例：ksp（pbI2）/ ksp（pbso4）=【pb2+】【cl-】2/【pb2+】【so42-】推出→【so42-】min=0.16/7.1 因此Na2so4晶体或饱和Na2so4溶液满足此条件。
沉淀反应实验报告
沉淀反应实验报告实验目的：通过观察不同物质间的沉淀反应，了解沉淀反应的特点及其影响因素。
实验原理：沉淀反应是指在两种溶液混合时，由于生成了不溶于水的沉淀物而产生的化学反应。
在此类反应中，通常会发生离子之间的置换反应，生成不溶于水的沉淀。
沉淀反应的发生需要满足两种溶液中存在的阳离子和阴离子能够形成不溶于水的盐类化合物，这种反应通常在溶液中加入一种沉淀剂后发生。
实验材料：1. 硝酸银溶液。
2. 氯化钠溶液。
3. 硝酸铜溶液。
4. 碳酸钙溶液。
5. 硝酸钡溶液。
6. 硫酸铜溶液。
实验步骤：1. 取一小部分硝酸银溶液倒入试管中；2. 分别加入少量氯化钠溶液和硝酸铜溶液，观察产生的沉淀情况；3. 取一小部分碳酸钙溶液倒入试管中；4. 加入少量硝酸铜溶液，观察产生的沉淀情况；5. 取一小部分硝酸钡溶液倒入试管中；6. 加入少量硫酸铜溶液，观察产生的沉淀情况。
实验结果：1. 在硝酸银溶液中加入氯化钠溶液后产生了白色沉淀，反应方程式为AgNO3+ NaCl → AgCl↓ + NaNO3；2. 在硝酸银溶液中加入硝酸铜溶液后未观察到明显沉淀产生；3. 在碳酸钙溶液中加入硝酸铜溶液后未观察到明显沉淀产生；4. 在硝酸钡溶液中加入硫酸铜溶液后产生了白色沉淀，反应方程式为Ba(NO3)2 + CuSO4 → BaSO4↓ + Cu(NO3)2。
实验分析：通过本次实验，我们观察到了不同物质间的沉淀反应。
在硝酸银溶液中，氯化钠与硝酸银发生沉淀反应，生成了白色的氯化银沉淀。
而在硝酸银溶液中加入硝酸铜溶液后，并未观察到沉淀的产生。
这是因为硝酸银和硝酸铜在溶液中并没有发生置换反应，因此没有产生沉淀。
在碳酸钙溶液中加入硝酸铜溶液后也未观察到沉淀的产生，这是因为碳酸钙和硝酸铜在溶液中也没有发生置换反应。
最后，在硝酸钡溶液中加入硫酸铜溶液后产生了白色硫酸钡沉淀，这是因为硝酸钡和硫酸铜发生了置换反应，生成了不溶于水的硫酸钡沉淀。
实验总结：通过本次实验，我们对沉淀反应有了更深入的了解。
实验二蛋白质的沉淀反应
实验二蛋白质的沉淀反应一、蛋白质等电点的测定：1.目的：(1)了解蛋白质的两性解离性质。
(2)学习测定蛋白质等电点的一种方法2.原理：蛋白质是两性电解质。
在蛋白质溶液中存在下列平衡：蛋白质分子的解离状态和解离程度受溶液的酸碱度影响。
当溶液的pH达到一定数值时，蛋白质颗粒上正负电荷的数日相等，在电场中，蛋白质既不向阴极移动，也不向阳极移动，此时溶液的pH值称为此种蛋白质的等电点。
不同蛋白质各有其特异的等电点。
在等电点时，蛋白质的理化性质都有变化，可利用此种性质的变化测定各种蛋白质的等电点。
最常用的方法是测其溶解度最低时的溶液pH值。
本实验借观察在不同pH溶液中的溶解度以测定酪蛋白的等电点。
用醋酸与酷酸钠(醋酸钠混合在酪蛋白溶液中)配制成各种不同pH值的缓冲液。
向诸缓冲溶液中加入酪蛋白后，沉淀出现最多的缓冲液的pH值即为酪蛋白的等电点。
3.器材：(1)水浴锅。
(2)温度计。
(3)200毫升锥形瓶。
(4)100毫升容量瓶。
(5)吸管。
(6)试管。
(7)试管架。
(8)乳钵。
4.试剂：(1)0.4％酪蛋白醋酸钠溶液200毫升取0.4克酪蛋白，加少量水在乳钵中仔细地研6，将所得的蛋白质悬波移入200毫升锥形瓶内，用少量40～50℃的温水洗涤乳钵，将洗涤液也移入锥形瓶内。
加入10毫升1当量/升醋酸钠溶液。
把锥形瓶放到50℃水浴中，并小心地旋转锥形瓶，直到酪蛋白完全溶解为止。
将锥形瓶内的溶液全部移至100毫升容量瓶内，加水至刻度，塞紧玻塞，混匀。
(2)1.00当量／升醋酸溶液100毫升(3)0.10当量／升醋酸溶液100毫升(4)0.01当量／升醋酸溶液50毫升5.操作方法：(1)取同样规格的试营4支，按下表颠序分别精确地加入各试剂，然后混匀。
(2)向以上试管中各加酪蛋白的醋酸钠溶液1毫升，加一管，摇句一管。
此时1、2、3、4管的pH值依次为5.9、5.3、4.7、3.5。
观察其混浊度。
静置10分钟后，再观察其混浊度。
蛋白质的沉淀反应剖析
3．有机酸沉淀蛋白质： 取1支试管，加入2mL蛋白质溶液，再加 入1mL5%三氯乙酸溶液，振荡试管，观察 沉淀的生成。
4．有机溶剂沉淀蛋白质： 取1支试管，加入2mL蛋白质溶液，再加 入2mL95%乙醇。混匀，观察沉淀的生成。
5、乙醇引起的变性与沉淀： 取3支试管，编号。依下表顺序加入试剂：
试剂（mL）
试管编号
1
2
3
蛋白质溶液
1.0
1.0
1.0
pH4.7醋酸-醋酸钠缓冲溶液
1.0
—
—
0.1mol/L氢氧化钠溶液
—
1.0
—
0.1mol/L 盐酸溶液
—
—
1.0
95%乙醇
2.0
2.0
2.0
摇匀后，观察是否有沉淀生成。放置片 刻，向各管内加水4mL，然后在2，3号管中 各加1滴甲基红，观察颜色的变化。 接着2 号管用0.1mol/L醋酸溶液中和， 3号管用 0.05mol/L碳酸钠溶液中和，观察颜色的变 化和沉淀的生成。最后各管再加0.1mol/L盐 酸溶液数十滴，观察沉淀的再溶解。
观察沉淀是否溶解，为什么？ 向另一离心管的上清液添加硫酸铵粉末，边
加边搅，直至硫酸铵粉末不再溶解达到饱和为 止，此时析出的沉淀为清蛋白。静置5min 后， 离心（3000r/min） 10min，倒去上清液，向 沉淀中加少量水，观察沉淀是否溶解。
2．重金属盐沉淀蛋白质： 取1支试管，加入2mL蛋白质溶液，再加入 2滴3%硝酸银溶液，振荡试管，观察沉淀的 生成。
可分为两类。 （1）可逆的沉淀反应 指蛋白质分子的结
构尚未发生显著变化，除去引起沉淀的因素 后，蛋白质的沉淀仍能溶解于原来的溶剂中， 并保持其天然性质而不变性。例如大多数蛋 白质的盐析作用或在低温下用乙醇（丙酮） 短时间作用于蛋白质等。提纯蛋白质时，常 用此类反应。
《兽医免疫学》实验课件：实验二 沉淀反应
B
B
A
A抗体中针对B抗原 的抗体可以 跨越透过C抗原来自BCA
二、双向琼脂扩散试验
实验材料：
1、鸡传染性法氏囊病毒标准抗原； 2、鸡传染性法氏囊病毒标准阳性血清； 3、待检血清：来自受检鸡的新鲜血清； 4、平皿（Φ6cm）、打孔器、微量加样器等；
二、双向琼脂扩散试验
5、琼脂凝胶板： 将琼脂糖1.0克、NaCl 8.0克、蒸馏水100ml装
入三角烧瓶，煮沸，然后用吸管吸取7ml加入平皿 内（勿有气泡）使成约3mm厚的凝胶，待冷却凝 固后按如下图方式打孔。 注意:孔间距为孔的直径大小,打孔完毕要封底）
二、双向琼脂扩散试验
实验步骤：
中间孔加标准抗原， 外周孔加被检血清及阳性 血清（如要测被检血清的 效价，外周孔可倍比稀释 后依次加入）。加样后盖 上皿盖，37℃扩散24小时， 观察结果。
实验二 沉淀反应
一、环状沉淀反应 二、双向琼脂扩散试验
一、环状沉淀反应
目的：以炭疽环状沉淀反应为例，掌握 沉淀反应原理、操作方法及结果 的判定方法。
原理：将可溶性抗原层积于抗体之上，如 果二者相应，则可在抗原、抗体两 液接触界面形成白色的沉淀环。
一、环状沉淀反应
实验材料：
1．被检抗原（沉淀原）的制备： （1）热浸法 取可疑材料约1克，研碎，加入510mL生理盐水混合，转至试管内，煮沸30min，取出 冷却，用滤纸过滤，滤液即为被检的沉淀原。 （2）冷浸法 取疑为炭疽的皮革和兽毛，高压灭 菌后，取1cm2或兽毛数克浸于5-10倍的0.5%石炭酸生 理盐水中，4℃浸渍18-24小时，同上法过滤。
原理：
可溶性Ag与Ab在含有电解质的半固体（1%）琼 脂内进行自由扩散，当两者由高浓度向低浓度扩散相 遇时，如果二者相对应而且比例适当，则可在相遇处 形成白色的沉淀线，为阳性反应。另外，沉淀带对于 组成它的Ag、Ab具有特异地不可透过性，而对其它 的Ag与Ab是可透过的，所以一条沉淀带仅代表一种 AgAb系统的沉淀物。
实验二凝集沉淀反应
材料：
待测血清、 AFP阳性血清、AFP诊断血清（兔抗人AFP ）、 生理盐水、琼脂板、打孔器、针头、毛细滴管、酒精灯。
.
15
双向扩散法测血清中AFP操作步骤
1、制备琼脂板：
1%盐水琼脂加热溶化，取5ml均匀铺与载玻片上。
2、打孔：
琼脂凝固后，用打孔器打孔成梅花型，针头取出孔中琼脂。
3、封底：
用酒精灯轻烤平皿底部至琼脂刚刚要熔化为止，封闭孔的底部，以防侧漏。
应用:
检测 AFP 、HBsAg, 协助疾病诊断.
.
14
双向琼脂扩散法测血清中AFP
甲胎蛋白（AFP）：
是一种在胚胎期由肝细胞和卵黄囊合成的α球蛋白， 存在于胎儿血清中，出生后血清中AFP几乎消失。正常 成人血清中仅含极微量的AFP，经典的免疫学方法检测 不出。
当肝细胞发生癌变时，AFP含量增高，测血清中AFP， 可协助诊断原发性肝癌。
本试验方法简单，容易观察结果，可测定抗原的灵敏度 约为10～20μg／ml.
应用:
人血清中IgG、IgM、IgA和C3的定量检测。
.
12
单向琼脂扩散实验:
琼脂中含抗体
Ag
Ag
Ag
Ag
Ag
1:80
1:40 1:20
1:10
未知
沉淀环直径平方
抗原浓度
.
13
（二）双向琼脂扩散试验 （操作）
原理:
将可溶性抗原与相应抗体两种溶液置于琼脂糖凝胶的不 同位置，使两者在凝胶中各自向四周扩散,抗原与抗体相遇并 在比例合适处形成可见的乳白色沉淀线。
伤寒血清 ＋
待测菌液
阴性
.
？
8
直接凝集反应玻片法--菌种鉴定
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一、环状沉淀反应
2．炭疽标准抗原 3、炭疽阴性抗原（健康组织浸出液） 4．阳性、阴性炭疽沉淀素血清
5．毛细吸管
沉淀反应管（Φ 0.3-0.4cm ）
一、环状沉淀反应
实 验 步 骤
设 阳 性 、 阴 性 静 用另一支毛细吸管吸取被检 对 置 材料，插入离沉淀管底近1/3 照 5 处，沿管壁缓慢加入到沉淀 － 10 素的上面，边注边提使达到 2/3高度处即可。 min 用毛细吸管吸取炭疽沉淀 素，插入沉淀反应管底部， 缓慢注入到距管底的1/3 处。
沉淀线，并对其进行简要说明。
ห้องสมุดไป่ตู้
阳性对照沉淀线融合。
阴性：受检孔与中央孔之间无沉淀线。
带现象（zone
phenomenon）
一种抗原-抗体反应的现象。在凝集反应或沉淀 反应中，由于抗体过剩或抗原过剩，抗原与抗 体结合但不能形成大的复合物，从而不出现肉 眼可见的反应现象。 抗体过剩：前带现象；
抗原过剩：后带现象。
作业：
完成实验报告，画出你所观察到的
结 果 观 察
一、环状沉淀反应
试验组
阳性对照组
阴性对照组
一、环状沉淀反应
结果判定：
两液面交界处出现清晰、致密
如线的白轮，是炭疽阳性。
无此现象为炭疽阴性。
二、双向琼脂扩散试验
目的：掌握双向琼脂扩散试验的原理、
操作方法及结果判定方法。
二、双向琼脂扩散试验
原理：
可溶性Ag与Ab在含有电解质的半固体（1%）琼 脂内进行自由扩散，当两者由高浓度向低浓度扩散 相遇时，如果二者相对应而且比例适当，则可在相 遇处形成白色的沉淀线，为阳性反应。另外，沉淀 带对于组成它的Ag、Ab具有特异地不可透过性，而 对其它的Ag与Ab是可透过的，所以一条沉淀带仅代 表一种AgAb系统的沉淀物。
二、双向琼脂扩散试验
实验材料：
1、鸡传染性法氏囊病毒标准抗原；
2、鸡传染性法氏囊病毒标准阳性血清；
3、待检血清：来自受检鸡的新鲜血清；
4、平皿（Φ6cm）、打孔器、微量加样器等；
二、双向琼脂扩散试验
5、琼脂凝胶板： 将琼脂糖1.0克、NaCl 8.0克、蒸馏水100ml装 入三角烧瓶，煮沸，然后用吸管吸取7ml加入平皿 内（勿有气泡）使成约3mm厚的凝胶，待冷却凝固 后按如下图方式打孔。
注意:孔间距为孔的直径大小,打孔完毕要封底）
二、双向琼脂扩散试验
实验步骤：
中间孔加标准抗原， 外周孔加被检血清及阳性 血清（如要测被检血清的 效价，外周孔可倍比稀释 后依次加入）。加样后盖 上皿盖，37℃扩散24小时， 观察结果。
Ag
生理 盐水
? Ab
二、双向琼脂扩散试验
结果判断：
阳性：标准对照孔之间有明显的沉淀线时， 受检孔与中央孔之间形成沉淀线并与
实验二 沉淀反应
一、环状沉淀反应 二、双向琼脂扩散试验
一、环状沉淀反应
目的：以炭疽环状沉淀反应为例，掌握 沉淀反应原理、操作方法及结果 的判定方法。
原理：将可溶性抗原层积于抗体之上，如
果二者相应，则可在抗原、抗体两 液接触界面形成白色的沉淀环。
一、环状沉淀反应
实验材料：
1．被检抗原（沉淀原）的制备： （1）热浸法 取可疑材料约1克，研碎，加入510mL生理盐水混合，转至试管内，煮沸30min，取出 冷却，用滤纸过滤，滤液即为被检的沉淀原。 （2）冷浸法 取疑为炭疽的皮革和兽毛，高压灭 菌后，取1cm2或兽毛数克浸于5-10倍的0.5%石炭酸生 理盐水中，4℃浸渍18-24小时，同上法过滤。