D7172%20cDNA第二链合成试剂盒pdf
cDNA双链合成
cDNA第二链的合成
1)离心沉淀cDNA第一链，并重悬在50μl水中，加50μl 2×第二链缓冲液(0.2mol／L Hepes，pH6.9，20m mol／L MgCl2，5 m mol／L DTT，0.14 mol／L KCl，1 m mol／L 4种Dntp)，混合均匀。
2)每微克底物加大肠杆菌DNA聚合酶K1enow片段20～50单位，15℃反应20小时，此酶能识别cDNA 3’末端发卡环，并以其为引物，cDNA第一链为模板，开始第二链的合成。
3)加0.5 mol／L EDTA 2μl终止反应。
取样电泳，以提取第一链同样的方法分离沉淀dsDNA。
对于这样合成的dsDNA不是全长的DNA分子，所以，需要进一步用逆转录酶合成。
4)溶解上述dsDNA在20μl水中，再加入：1mol／L Tris.HCl pH8.3)5μl，1 mol／L KCl 7μl,250m mol／L MgCl2 2μl，20m mol／L 4种‘dNTP各2.5μl,700m mol／L β-MCE 2μl，加重煎水到48μl，加逆转录酶2μl (40单位)、42℃保温反应1小时。
5)加0.5 mol／L EDTA 2μl终止反应，取样电泳，以同样方法抽提，分离沉淀dsDNA。
6)用两次合成的双链cDNA和单链cDNA在1.4％碱性琼脂糖凝胶上电泳，放射自显影后观察，如果dsDNA片段的长度是第一链cDNA的两倍，那么，合成便是成功的。
7)用核酸酶S1消化dsDNA，除去连接两条链的发卡环。
cDNA-AFLP实验流程v2.0
不同发育期油菜种子cDNA-AFLP实验流程Ver 2.0一、总RNA提取1. 采集花后不同日期的油菜种子2. 用具RNase灭活处理（玻璃器皿：160℃烘烤2h；塑料制品：DEPC水浸泡过夜，高压灭菌）3. 液氮下研磨样品，分装100mg/管，-80℃保存4. 每100mg样品加入1ml Trizol，混匀，室温温育5min5. 加入200μl氯仿，剧烈震荡6. 4℃，12000rpm离心15min，上层水相转移至新管7. 加入0.5倍体积异丙醇，室温静置10min8. 4℃，12000rpm离心15min，弃上清，加入200μl 75%乙醇，重悬洗涤沉淀2次9. 4℃，12000rpm离心15min，弃上清，吸尽乙醇，超净台内吹干（不要干透）10. 加入50μl水溶解，-80℃保存。
1%琼脂糖凝胶电泳检测提取结果注：若Trizol对种子RNA提取效果不佳，考虑改用CTAB提取二、RNA结合磁珠1.取20ul总RNA（约2ug），65℃温育10min2.加入1ul 生物素化oligo(dT)引物（700ug/ul），1.1ul 20×SSC，轻轻混匀至完全冷却至室温3.重悬磁珠，磁力架收集，弃上清。
4.用300ul 0.5×SSC重悬磁珠，磁力架收集，弃上清。
洗三次5.将清洗后的磁珠重悬于100ul 0.5×SSC中6.取10ul磁珠，置于管中，加入结合oligo(dT)引物的RNA，室温温育10min，保持磁珠悬浮7.磁力架收集磁珠，100ul 0.1×SSC清洗四次三、cDNA合成1. cDNA第一链合成：按下表加样，42℃温育2h磁珠--- biotinylated oligo(dT) primer (700μg/μl)1μl H2O 24μl 5× First Strand Buffer 8μl0.1M DTT 4μleach 10mM dNTP mix 2μl 2.5mM Superscript II (200U/μl) 1μl M-MLV RTase, RNase H-Final V olume 40μl 或20ulT10E0.1重悬磁珠，H2O 4ul5× First Strand Buffer:(-20℃)250mM Tris-HCl (pH 8.3)15mM MgCl2375mM KCl2. 磁力架收集磁珠，仔细吸弃上清，用5×第二链buffer平衡磁珠，磁力架收集，弃上清3. cDNA第二链合成：按下表加样，12℃温育1h，22℃温育1h磁珠--- 5× Second Strand Buffer 20μl 10×buffer：10μl10mM dNTP mix 2μl0.1M DTT 4μlE.Coli DNA ligase (10U/μl) 1μl 10UDNA Polymerase I (10U/μl) 3μl 30U RNase H (5U/μl) 1μl 5U H2O 69μl Final V olume 100μl或20ulT10E0.1重悬磁珠，H2O 49ul5× Second Strand Buffer: (-20℃)7.0)(pH100mMTris-HCl20mM MgCl2450mMKCl750μM NAD+50mM (NH4)2SO44. 磁力架收集磁珠，仔细吸弃上清，用1×RL-Buffer清洗磁珠，磁力架收集（或20ulT10E0.1清洗）四、Bst YI 酶切1. 向磁珠加入10U BstYI (1μl，10U/μl)，4μl 10×RL-Buffer，35μl H2O，共40μl，混匀。
cDNA文库构建
cDNA文库构建cDNA文库[原理]：cDNA文库不同于基因组文库，被克隆DNA是从mRNA反转录来源的DNA。
CDNA 组成特点是其中不含有内含子和其他调控序列。
从而做cDNA克隆时应是先从获得mRNA 开始，在此基础上，通过反转录酶作用产生一条与mRNA相互补的DNA链，然后除掉mRNA，以第一条DNA链为模板复制出第二条DNA链（双链）；再进一步把此双链插入原核或真核载体。
cDNA文库的构建分为六个阶段：阶段1：反转录酶催化合成cDNA第一链阶段2：cDNA第二链的合成阶段3：cDNA的甲基化阶段4：接头或衔接子的连接阶段5：Sepharose CL-4B凝胶过滤法分离cDNA阶段6：cDNA与λ噬菌体臂的连接[阶段1：反转录酶催化合成cDNA第一链]1．在置于冰上的无菌微量离心管内混合下列试剂进行cDNA第一链的合成：poly(A)+RNA (1μg/μl) 10μl寡核苷酸引物(1μg/μl) 1μl1mol/L KCl 3.5μl250 mmol/L MgCl22μldNTP溶液（含4种dNTP，每种5mmol/L）10μl0.1 mol/L DTT 2μlRNase抑制剂（选用）25单位加H2O至48μl2．当所有反应组在0℃混合后，取出2.5μl反应液转移到另一个0.5ml微量离心管内。
在这个小规模反应管中加入0.1μl [α-32P] dCTP（400 Ci/mmol, 10mCi/ml）。
3．大规模和小规模反应管都在37℃温育1h。
4．温育接近结束时，在含有同位素的小规模反应管中加入1μl 0.25mol/L EDTA，然后将反应管转移到冰上。
大规模反应管则在70℃温育10 min，然后转移至冰上。
5．参考《分子克隆实验指南》第三版附录8所述方法，测定0.5μl小规模反应物中放射性总活度和可被三氯乙酸（TCA）沉淀的放射性活度。
此外，用合适的DNA分子质量参照物通过碱性琼脂糖凝胶电泳对小规模反应产物进行分析是值得的。
cdna_synthesis_kit
0.2-2 μg 1 μl 1 μl 4在PCR仪上按以下条件进行反转录反应:
30°C
5min
42°C 30-40min
95°C
5min
4°C
产品组分
组分名称 M-MuLV 反转录酶 (200 U/μl) 5XRT PCR Buffer dNTP Mixture (10 mM each) Rnase Inhibitor (40 U/μl) Oligo (dT)15 Primer (20 μM)
cDNA 第一链合成试剂盒 1st cDNA Synthesis Kit
使用说明书
Cat. No.: D0401 包装量：50次
产品说明
本试剂盒采用莫洛尼氏鼠白血病病毒反转录酶M-MuLV ，该酶通过点突变使RNase H活性缺失，而保持完全的 mRNA-directed DNA多聚合活性，有效增强了cDNA的 合成效率、增加了该酶与模板/引物的亲和力, 从而增 加了酶的活性和持续合成能力。本试剂盒优化了反应 Buffer，能使反应的模板量（Total RNA）可在0.2-2 μg 范围之间进行逆转录反应。cDNA合成后进行PCR扩增 既可检测到长cDNA（>10 kb）片段，也可检测到低丰 度cDNA样品。本试剂盒提供了由Total RNA或mRNA合 成cDNA第一链所需要的全部试剂，并提供两种cDNA合 成引物。合成的第一链cDNA可广泛用于2nd Strand的合 成、杂交、PCR扩增、Real-Time PCR反应等。
Rnase Free H2O
储存条件
-20°C保存，避免反复冻融。
数量 50 μl 250 μl 50 μl 25 μl 50 μl
1 ml
操作方法
1．按以下组分配制反转录反应液
31cDNA第一链的合成
3.1 cDNA第一链的合成1)在0.5ml经DEPC处理过的离心管中分别加入tester和driver的mRNA各2ug(2-4ul)，然后加入1ul(10uM) 随机引物(9mer)，70℃温浴2min,然后迅速置于冰上放置2min，然后在每管中加入如下混合物：5×First-strand Buffer 2uldNTPs Mix(10mM) 1ulsterile H2O 1ulAMV Reverse Transcriptase(20U/ul) 1ul2)42℃反应1.5hr.，然后将离心管置于冰上,终止cDNA第一链的合成,然后马上进行第二链的合成。
3.2cDNA第二链的合成1)在已经合成好cDNA第一链的离心管中每管加入如下反应物，16℃反应2hr：sterile H2O 48.4-50.4 ul5×Second-strand Buffer 16.0uldNTPs Mix(10mM) 1.6ul20×Second-strand Enzyme Cocktail 4.0ul2) 混匀, 16℃反应2hr3)加入2ul(6U)T4 DNA Polymerase，16℃反应30min。
4)加入20×EDTA/Glycogen Mix 4ul，以终止反应。
5)加入100ul 苯酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)抽提,离心14000rpm/10min,吸取上清到一新的1.5ml的离心管中,加入100ul氯仿:异戊醇(24:1)离心 14000rpm/10min,吸取上清到一新的1.5ml的离心管中,加入40ul4MNH4Oac和300ul95%的乙醇离心14000rpm/20min倒去上清,向离心管中加入500ul的乙醇, 离心 14000rpm/10min 倒去上清,放置10min,使剩余的乙醇挥发调,溶解于50ul双蒸水中。
3.3cDNA质量检测根据目的基因Ccl1(GI:1694628)的cDNA序列设计特异性引物（CF：5′-…………………-3′ CR：5′-…………………….-3′），目标片段大小为nbp。
BeyoRT cDNA第一链合成试剂盒(RNase H-) 说明书
BeyoRT cDNA第一链合成试剂盒(RNase H-)产品编号产品名称包装cDNA第一链合成试剂盒(RNase H-) 10次D7166 BeyoRT产品简介：¾BeyoRT cDNA第一链合成试剂盒(RNase H-)，即BeyoRT First Strand cDNA Synthesis Kit (RNase H minus)是一种采用了经过改造和优化的BeyoRT M-MuLV反转录酶(RNase H-)，用于在总RNA、mRNA等RNA模板的基础上反转录产生cDNA第一链的试剂盒。
本试剂盒包含了进行cDNA第一链合成所需的各种试剂。
¾采用本试剂盒可以合成长达13kb的cDNA第一链。
在采用BeyoRT M-MuLV反转录酶(RNase H-)的情况下，由于缺失了RNase H，RNA和DNA双链复合物中的RNA不会被降解，这样反转录出来的cDNA的长度就会更长，并且产量更高。
¾试剂盒中提供了RNase Inhibitor，确保在反转录过程中的RNA不会被RNA酶所降解并取得较好的反转录效果。
¾试剂盒还提供了Oligo(dT)18和random hexamer这两种引物，前者适合用于带有Poly(A)尾的mRNA的反转录，后者进行反转录时不需要poly(A)尾。
也可以自行采用基因特异性引物进行cDNA第一链的合成。
¾试剂盒中提供的Control Primer为17聚，即引物的长度为17个碱基。
试剂盒中提供的Control RNA为带有3’ poly(A)的1.1kb RNA。
¾使用本试剂盒合成的第一链，可以直接用于后续的常规PCR、real-time PCR、cDNA第二条链的合成等。
¾本试剂盒用于体积为20微升的cDNA第一链合成反应时足够进行10个cDNA第一链样品的合成。
包装清单：产品编号产品名称包装D7166-1 BeyoRT M-MuLV反转录酶(RNase H-) 2000UD7166-2 Reaction Buffer (5X) 50µlD7166-3 RNase Inhibitor (20U/µl) 10µlD7166-4 dNTP Mix (10 mM each) 20µlD7166-5 Oligo(dT)18 Primer (0.5µg/µl) 10µlD7166-6 Random Hexamer Primer (0.2µg/µl) 10µlD7166-7 Control RNA (20ng/µl) 6µlD7166-8 Control Primer (5pmol/µl) 6µlD7166-9 DEPC-treated Water 0.2ml－说明书1份保存条件：-20℃保存。
cdna第二条链的合成方法
cdna第二条链的合成方法一、引言。
cDNA第二条链的合成可是分子生物学研究中的一个重要环节呢。
这就像是搭建一座大厦，第一条链是基础，第二条链则是让这个大厦更加稳固完整的关键部分。
1.1 重要性。
如果把cDNA比作是生命密码的一种特殊记录形式，那第二条链的合成就是让这个记录完整呈现的必要步骤。
没有它，我们对基因表达等众多研究就像是看一本缺页的书，总是不完整的。
二、合成方法。
2.1 自身引导法。
这是一种比较经典的方法。
首先呢，第一条cDNA链合成之后，它会形成一个特殊的发夹结构。
这个发夹结构就像是一个小挂钩，为第二条链的合成提供了一个起始的“把手”。
然后呢，在DNA聚合酶的作用下，就像建筑工人按照图纸施工一样，以第一条链为模板开始合成第二条链。
不过呢，这个方法也有点小麻烦，就像走一条有点崎岖的路，它的效率有时候不是很高，而且后续还得把那个发夹结构去掉，就像解开一个小疙瘩一样。
2.2 置换合成法。
这个方法就有点巧妙啦。
它是利用RNA酶H来对杂交分子中的RNA进行切割，就像一把小剪刀，把RNA剪成一段一段的。
然后呢，这些被剪开的RNA片段就可以作为引物，在DNA聚合酶的作用下合成第二条链。
这就好比是给了DNA聚合酶一些小路标，告诉它从哪里开始合成。
这种方法相对自身引导法来说，就像是开了一条捷径，效率会更高一些。
2.3 引物衔接头法。
这是一种比较现代、比较灵活的方法。
我们先把特定的引物或者衔接头连接到第一条cDNA链上，就像给它戴上了一个特殊的帽子或者挂上了一个特殊的牌子。
然后呢，再利用这个引物或者衔接头来启动第二条链的合成。
这个方法就像是给了我们一把万能钥匙，可以根据不同的研究需求来设计引物或者衔接头，灵活性很强。
不过呢，这也需要我们更加小心谨慎，就像走钢丝一样，因为引物或者衔接头的设计要是出了问题，那整个合成可就乱套了。
三、总结。
3.1 各方法的选择。
在实际的研究中，选择哪种方法就像是在菜市场买菜一样，得根据自己的需求和实际情况来决定。
cDNA第二链合成
cDNA 第二链的合成
即将上一步形成的mRNA-cDNA 杂合双链变成互补双链cDNA 的过程。
cDNA 第二链合成的方法有四种，自身引导合成法，置换合成法，引导合成法和引物－衔接头合成法。
1．自身引导法：
首先用氢氧化钠消化杂合双链中的mRNA 链，解离的第一链cDNA 的3'-末端就会形成一个发夹环（发夹环的产生是第一链cDNA 合成时的特性，原因至今未知，据推测可能是由帽子的特殊结构相关），并引导DNA 聚合酶复制出第二链，此时形成的双链之间是连接在一起的，再利用S1 核酸酶将连接处（仅该位点处为单链结构）切断形成平端结构可以进行连接。
2.置换合成法：
它是由一组酶共同控制，包括RNA 酶H 、大肠杆菌DNA 聚合酶Ⅰ和DNA 连接酶。
mRNA－cDNA 杂合双链中的mRNA 链在RNA 酶H 作用下先形成很多切口，mRNA 链就被切割成很多的小片段，这些小片段为大肠杆菌DNA 聚合酶Ⅰ提供了合成第二链的引物。
大肠杆菌DNA 聚合酶Ⅰ以第一链cDNA 为模板合成一段段互补的cDNA 片段。
这些cDNA 片段进而在DNA 连接酶的作用下连接成一条链，即cDNA 的第二链。
遗留在5'-末端的一段很小的mRNA 也被大肠杆菌DNA 聚合酶Ⅰ的5'--3' 核酸外切酶和RNA 酶H 降解，暴露出与第一链cDNA 对应的3'-端部分序列。
同时，大肠杆菌DNA 聚合酶Ⅰ的3'--5' 核酸外切酶的活性可将暴露出的第一链cDNA 的3'-端部分消化掉，形成平端或差不多的平端。
这种方法合成的cDNA 在5'-端存在几个核苷酸缺失，但一般不影响编码区的完整。
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cDNA第二链合成试剂盒
产品简介：
cDNA第二链合成试剂盒，Second Strand cDNA Synthesis Kit是一种在合成了cDNA第一链的基础上去除RNA-DNA杂合链中的RNA链并合成cDNA第二链，最终形成双链cDNA的试剂盒。
本试剂盒包含了进行cDNA第二链合成所需的各种试剂。
本试剂盒采用RNase H使RNA-DNA杂合链中的RNA产生切口，此时DNA Polymerase I可以通过切口平移(nick translation)反应催化形成cDNA第二链。
使用本试剂盒合成的双链cDNA，可以直接用于后续的常规PCR、real-time PCR、cDNA文库的构建等。
本试剂盒用于体积为20微升的cDNA第一链合成反应的后续反应时，足够进行20个cDNA第二链样品的合成。
保存条件：
-20℃保存。
注意事项：
进行第二链合成时，dNTP比较适当的最终浓度约为0.2mM。
如果最终浓度过低，在反应体系中需要适当补充dNTP。
如果希望获得平末端的双链cDNA，可以用T4 DNA Polymerase (D7051)或DNA末端平滑试剂盒 (D7012)处理。
酶使用时宜存放在冰盒内或冰浴上，使用完毕后宜立即放置于-20℃保存。
本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。
为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
使用说明：
1.用反转录酶，例如BeyoRT TM II M-MLV反转录酶(RNase H-) (D7160/D7161/D7162)或BeyoRT TM II cDNA第一链合成试剂盒
(RNase H-) (D7167/D7168)合成cDNA第一条链，70℃孵育10分钟终止反应。
2.
3.按上述体系配好之后，轻轻混匀(可以用移液器吹打混匀或用 V ortex在最低速度轻轻混匀)，随后离心沉淀液体。
4.15℃孵育2小时。
(注意：反应温度不能超过15℃)
5.加入5μl 0.5M EDTA(pH8.0)混匀，以终止反应。
6.后续可以使用酚氯仿抽提、乙醇沉淀等方法纯化合成的双链cDNA，也可以使用适当的DNA纯化试剂盒进行纯化。
DNA纯
化试剂盒(D0033)可以向碧云天订购。
使用本产品的文献：
1. Yu K, Zhang T.
Metagenomic and metatranscriptomic analysis of microbial community structure and geneexpression of activated sludge.
PLoS One. 2012;7(5):e38183.
2. Ren H, Zhu F, Zheng C, Sun X, Wang W, Shu H.
Transcriptome analysis reveals genes related to floral development in chrysanthemum responsive tophotoperiods.
Biochem Genet. 2013 Feb;51(1-2):20-32. doi: 10.1007/s10528-012-9541-1. Epub 2012 Sep 30.
3. Cai L, Yu K, Yang Y, Chen BW, Li XD, Zhang T.
Metagenomic exploration reveals high levels of microbial arsenic metabolism genes in activated sludge andcoastal sediments.
Appl Microbiol Biotechnol. 2013 Jan 23. [Epub ahead of print].
Version 2016.03.19。