基于核酸的分析方法
核酸的提取与鉴定实验报告
核酸的提取与鉴定实验报告核酸的提取与鉴定实验报告引言：核酸是生命的基础，它存在于细胞的核内，承载着遗传信息的传递和表达。
在现代生物学研究中，核酸的提取与鉴定是非常重要的实验步骤。
本实验旨在探究核酸提取的方法以及鉴定核酸的质量和纯度。
一、核酸提取方法核酸的提取方法有多种，本实验采用了常用的酚-氯仿法。
首先，将待提取的细胞或组织样品加入细胞裂解液中，通过离心将细胞碎片沉淀下来。
然后，使用酚和氯仿进行提取，酚层中含有核酸和脂质，氯仿层中含有蛋白质。
通过离心将酚层和氯仿层分离，进一步提取纯净的核酸。
二、核酸的鉴定1. 纯度检测核酸的纯度是指核酸溶液中核酸与其他杂质的比例。
常用的纯度检测方法有比色法和光谱法。
本实验中使用了光谱法，即通过测量核酸溶液的吸光度来评估其纯度。
纯度越高，吸光度比值（A260/A280）越接近1.8。
实验结果显示，所提取的核酸样品的纯度在可接受范围内。
2. 浓度测定核酸的浓度是指单位体积核酸溶液中核酸的含量。
浓度测定常用的方法有比色法和荧光法。
本实验中采用了比色法，即通过比较核酸溶液的吸光度与标准曲线的关系来确定核酸的浓度。
实验结果显示，所提取的核酸样品的浓度为Xμg/μl。
3. 碱基组成分析核酸的碱基组成是指核酸中腺嘌呤（A）、胸腺嘧啶（T）、鸟嘌呤（G）、胞嘧啶（C）的相对含量。
碱基组成分析可以通过核酸测序技术来完成。
本实验中使用了Sanger测序技术，通过测序结果可以确定所提取核酸的碱基组成。
4. 凝胶电泳分析凝胶电泳是一种常用的核酸分析方法，可以根据核酸的大小和电荷来分离核酸。
本实验中使用琼脂糖凝胶电泳，将提取的核酸样品与DNA分子量标准品一同加载到琼脂糖凝胶槽中，通电分离。
通过观察凝胶上的DNA条带，可以初步判断核酸的大小和纯度。
结论：通过本实验，我们成功提取了核酸样品，并进行了一系列的鉴定实验。
通过纯度检测、浓度测定、碱基组成分析和凝胶电泳分析，我们确定了所提取核酸的质量和纯度。
核酸的定量分析方法
主要有紫外-可见光谱法、荧光光谱法、红外光谱法、拉曼光谱法等。
基于光谱学的定量分析方法的优缺点
优点
操作简单，适用范围广，无需使用放射性同位素标记，可用于多种类型核酸的定量。
缺点
易受样品中杂质的影响，准确性较低，重现性较差。
光谱学定量分析的实例和应用领域
实例
紫外-可见光谱法定量分析DNA和RNA样品中的浓度和纯度。
VS
应用领域
基因组学、蛋白质组学、生物医药、环境 科学、法医学和化学计量学等领域。
05
基于生物芯片的定量分析方 法
生物芯片的原理及定量分析方法
生物芯片原理
生物芯片是一种高通量的生物分析技术，通过将生物分子固定在固相基质上 形成微阵列，然后利用特异性探针进行检测和定量分析。
定量分析方法
通常采用荧光标记或化学发光标记的核酸探针与生物芯片上的核酸序列进行 杂交，然后通过荧光信号或化学发光信号的强度来检测和定量分析目标核酸 序列的浓度。
VS
同位素标记法
通过在标准品和未知品中加入不同量的同 位素标记物，利用凝胶电泳将核酸分子分 离，再通过同位素检测器检测标准品和未 知品中同位素标记物的含量，从而计算未 知核酸浓度。该方法操作简便，但同位素 标记物具有放射性，对环境和人体健康可 能产生影响。
凝胶电泳定量分析的优缺点
优点
凝胶电泳具有高分辨率、可重复性好、操作简便、成本低廉 等优点，是核酸分子定量分析的常用方法之一。
缺点
需要使用较多的试剂和操作步骤，可能会受到非特异性杂交和酶抑制物的影响， 同时也存在一定的误差率。
循环酶放大技术定量分析的实例和应用领域
实例
采用循环酶放大技术对细菌、病毒、基因组、mRNA等多种 类型的核酸进行了定量分析，取得了较好的结果。
核酸琼脂糖凝胶电泳原理
核酸琼脂糖凝胶电泳原理核酸琼脂糖凝胶电泳是一种常用的核酸分析方法。
它通过核酸分子在琼脂糖凝胶上的迁移速度，实现对核酸分子的大小分离和纯化。
这种方法被广泛应用于DNA和RNA的分离和检测，可用于研究生物学中许多问题，如基因组分析、DNA测序、PCR产物分析、RNA剪接等。
核酸琼脂糖凝胶电泳的原理是基于核酸带电分子在电场作用下在琼脂糖凝胶中迁移，由此分离不同大小的分子。
琼脂糖凝胶是一种多孔性的凝胶材料，它可以通过孔径大小的不同选择不同大小的核酸分子。
琼脂糖凝胶存在于不同的浓度（即凝胶密度）中，根据不同的要求选择不同的密度，可以得到分离效果更好的凝胶。
在电泳前，琼脂糖凝胶被浸泡在缓冲溶液中，以保持凝胶的稳定性和适宜pH值。
核酸的分离和检测是通过核酸电泳仪来实现的。
核酸电泳仪由外部电源、电泳仪仪器、电容器、多通道探针等组成。
核酸试样通过特定方法加入到琼脂糖凝胶的槽内，接下来加入电泳缓冲液，使缓冲液和试样混合均匀。
然后将电泳仪按需要设置电泳时间、电场强度等，并且使缓冲液移动到大夹板中。
通过施加特定电场，核酸分子被迫移动，最终到达琼脂糖凝胶的底部。
在电泳结束时，用染料对琼脂糖凝胶进行染色，以使DNA或RNA带能够被清晰地观察到。
核酸琼脂糖凝胶电泳的准确性取决于许多因素，如电场强度、凝胶浓度、琼脂糖凝胶孔径和核酸带电质量等。
如果核酸分子太大，可能会受到凝胶的限制，从而无法被完全分离。
另一方面，如果核酸分子太小，可能会被快速通过凝胶而无法被分析。
因此，实验者需要逐步优化核酸琼脂糖凝胶电泳条件，以获得最佳的分离效果。
总之，核酸琼脂糖凝胶电泳是一种可靠的核酸分离和检测方法。
它适用于许多生物学研究领域，是现代分子生物学中不可缺少的技术。
核酸的定量分析方法
光
分
析
DNA
法
AO-ST体系能 量发生荧光猝 灭
DNA浓度与荧光 猝灭强度呈线性 关系
检出限 2.6× 10-7mol/L
线性范围为 0～ 1.1× 10-6mol/L
1.DNA促进AO-ST间的荧光能量转移
下图表明ST的电子吸收光谱与AO的荧光发射光谱重叠。AO的荧
光在ST存在时明显地被淬灭，说明两者在水溶液中存在能量的转
准确、分析适应性广等特点。
DNA电化学生物传感器：基本原理
电
电压
ssDNA
化
（单链DNA）
学 法
杂交反应
电流
待测溶液
（样品中与之互补 的另一条DNA）
电导
样品中DNA的结构 和含量的测定
差分脉冲和方波伏安法研究亲和素-生物素固载ssDNA的生物传感器
Pt电极预 处理（抛光）
ssDNA在铂 电极表面的 固定化
核酸(DNA或RNA)在中性至碱性介质中由于核苷酸上磷酸基的离 解而能以有机 离子形式存在，因此能用某些碱性染料对其加以 测定。
定
以后所测得的含磷量，以及该样品的无机磷含量，即样品未经消化
磷
法
直接测得的含磷量。将总磷量减去无机磷才是该有机磷物质的含磷
量。
定磷法简单、快速、灵敏度高，但是受蛋白质和核苷酸的影响。
核苷、核苷酸、核酸的组成成分中都有嘌呤、嘧啶碱基，这些碱基
紫
都具有共轭双键 （ -C-C=C-C=C-），在紫外光区的250-280nm处有强烈
紫 外
RNA的质量浓度(mg/L)＝ A260nm 稀释倍数
吸
0.024 L
收
DNA的质量浓度（mg / L) A260nm 稀释倍数
核酸的定量分析方法
其他比值法
总结词
除了染料法和酶法之外，还有一些其他的比值法用于 核酸的定量分析。
详细描述
这些方法包括荧光定量PCR法、基因芯片法、数字 PCR法等。荧光定量PCR法是一种实时定量PCR技术 ，通过在反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的 积累与核酸浓度之间的线性关系来实现对核酸的定量 分析
06
基于荧光染料的方法
。
优点
简单易行，对样品预处理要求 较低，定量准确度高。
荧光光谱法
原理
荧光光谱法是通过特定波长的激发光激发核酸分子中的荧光基团，产生荧光信号，通过测量荧光信号的强度，对核酸进行定 量分析。
应用范围
该方法主要应用于低浓度核酸样品的定量分析，如基因芯片、蛋白质芯片等。
优点
灵敏度高，可实现多通道检测，特异性较强。
应用
核酸质谱法在基因突变筛查、基因表达差异分析、基因测序 等方面有广泛的应用。
基质辅助激光解吸/电离质谱
原理
基质辅助激光解吸/电离质谱是一种将样品固定在某种基质上，再用激光束照 射，使样品瞬间气化并离子化的方法。
应用
基质辅助激光解吸/电离质谱在蛋白质组学、代谢组学、生物医药等领域有广 泛的应用。
同位素标记法
原子光谱法
01
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原理
原子光谱法是通过原子能 级跃迁时吸收或发射特定 波长的光，对核酸中的元 素进行定量分析。
应用范围
该方法主要应用于分析核 酸中的元素种类和含量， 如P、S等。
优点
可同时检测多种元素，灵 敏度高，精密度高。
04
基于质谱的方法
核酸质谱法
原理
核酸质谱法利用质谱技术，将核酸分子离子化并分离出不同 质量的离子，从而实现对核酸的定量分析。
新冠核酸检测原理和方法
新冠核酸检测原理和方法
新冠病毒核酸检测是目前常用的诊断方法之一，通过检测人体样本中的病毒核酸来确认感染情况。
这种检测方法的原理基于核酸的特异性反应。
核酸检测的基本步骤是：收集样本、提取病毒核酸、核酸逆转录（如果是RNA病毒）、扩增特定基因片段、检测扩增产物。
首先，医务人员会采集患者咽拭子、鼻拭子、唾液、血液等样本，并将其置于含有保护剂的管子中，以防止病毒核酸的降解。
其次，对样本进行核酸提取，目的是分离病毒核酸以便后续检测。
核酸提取的方法主要有有机物法和离心柱法两种。
有机物法通过酚/氯仿提取样本中的核酸，离心柱法则利用特制柱子
中的膜，通过离心操作将核酸捕获至膜上。
对于RNA病毒（如新冠病毒），还需要进行核酸逆转录。
逆
转录酶可以将RNA模板逆向转录为相应的DNA，这样可以将RNA转化为DNA，便于后续操作。
接下来，利用聚合酶链反应（PCR）技术扩增病毒核酸中的特定基因片段。
PCR是一种体外扩增技术，其基本原理是利用DNA聚合酶在特定反应条件下，通过多次循环反复复制靶序列。
这种扩增使得原本只含有少量病毒核酸的样本中的目标序列扩增至可以被检测的程度。
最后，对PCR扩增产物进行检测。
目前常用的检测方法有荧
光定量PCR（qPCR）、实时荧光定量PCR（RT-qPCR）和基因测序等。
这些方法都能够通过检测病毒核酸的特定序列来确认感染情况。
总结起来，新冠病毒核酸检测通过核酸提取、逆转录、PCR 扩增和检测等步骤来确认感染情况。
这种方法具有高灵敏度和特异性，因此被广泛应用于疫情防控和个体诊断。
核酸电泳的名词解释
核酸电泳的名词解释核酸电泳是一种常见且广泛应用的生物技术手段，用于分离和分析核酸分子。
它基于核酸分子在电场作用下的迁移速度不同的原理，可以快速、准确地判断核酸样品的组成和结构。
核酸电泳已经成为生物学、医学和法医学等领域中不可或缺的重要工具，进一步推动了科研和医学领域的发展。
核酸电泳的原理是基于核酸分子的带电性质。
DNA(脱氧核糖核酸)和RNA(核糖核酸)都是带有负电荷的大分子，当电场施加在核酸样品上时，核酸分子会根据它们的大小和形状的不同而在电场中迁移。
一般来说，较小的核酸分子迁移速度较快，较大的核酸分子迁移速度较慢。
核酸电泳有不同的类型，其中最常见的是琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳。
琼脂糖凝胶电泳是一种传统的电泳方法，适用于较大的核酸片段分析。
而聚丙烯酰胺凝胶电泳则更为常用，可用于分离和定量分析较小的核酸片段。
在核酸电泳过程中，核酸样品首先被加入凝胶槽中，通常是通过挤压或吸引的方式。
然后，电泳槽两端施加电场，使核酸分子在凝胶矩阵中迁移。
迁移过程中，核酸分子被分离并形成带状图谱。
为了可视化这些分子，可以使用荧光染料或与核酸分子结合的放射性标记物。
核酸电泳的结果可以通过观察凝胶图谱来解读。
图谱上的距离信息表示了核酸分子的大小，从而可以确定样品中核酸片段的分布情况和含量。
通过与已知大小的标准分子进行比较，可以快速确定未知核酸片段的大小。
核酸电泳在生物学研究中有广泛的应用。
例如，在基因测序中，核酸电泳可以分析DNA样品中的碱基序列。
在基因突变分析中，核酸电泳可以识别和分离突变的DNA片段。
此外，核酸电泳还可以用于研究基因表达的变化、DNA指纹鉴定等应用领域。
尽管核酸电泳是一种非常有用的技术，但它也存在一些局限性。
首先，核酸电泳只能提供关于核酸分子大小的信息，对于其他结构信息，如二级结构和序列信息，无能为力。
其次，核酸电泳对于较小的核酸片段分析具有局限性，特别是在高分辨率分析中。
此外，在分离过程中，核酸分子可能出现与凝胶交互作用而使迁移速度减慢的情况。
260nm吸光度
260nm吸光度的原理和应用简介260nm吸光度是指在260纳米波长处的物质吸光度。
吸光度是常用的分析化学参数之一，它是描述物质对于特定波长光的吸收程度的量度。
260nm吸光度常常用于核酸分析和测定。
原理核酸（DNA和RNA）是由核苷酸（包含脱氧核糖核酸或核糖核酸）组成的生物大分子。
核酸具有吸收紫外光的特性，其吸收峰位于260nm附近。
核酸中的嘌呤基（如腺嘌呤和鸟嘌呤）和嘧啶基（如胸腺嘧啶和尿嘧啶）对紫外光有很强的吸收能力，因此核酸具有较高的吸光度。
在核酸分析中，常使用260nm吸光度对核酸进行浓度测定。
核酸浓度与其吸光度之间存在一定的线性关系，通过对核酸溶液在260nm处的吸光度进行测定，可以计算出核酸的浓度。
这种测定方法称为260nm吸光度法，通常使用紫外光分光光度计进行测量。
应用1.核酸浓度测定：核酸是生物学研究中常见的分子，通过使用260nm吸光度法可以快速准确地测定核酸的浓度。
这对于核酸的纯化、定量以及在实验和工业生产中的应用都非常重要。
2.分子生物学研究：260nm吸光度法可用于核酸样品的质量控制和纯度评估。
在核酸提取和酶联免疫吸附测定（ELISA）等实验中，通过测量核酸样品的吸光度可以判断样品中的杂质或其他污染物的存在情况。
3.组织工程和药物开发：在组织工程和药物开发过程中，需要测定细胞培养物中核酸的含量以评估细胞生长的情况。
260nm吸光度法可用于监测细胞培养物中DNA或RNA含量的变化，从而控制和优化细胞生长的条件。
4.病理学诊断：在临床诊断中，某些疾病（如肿瘤）会导致细胞核DNA含量的异常增加。
通过使用260nm吸光度法，可以对组织样本中的核酸进行测定，从而为病理学诊断提供参考。
总结260nm吸光度法是一种常用的核酸测定方法，它基于核酸对于260nm紫外光的吸收特性。
通过测量核酸样品在260nm处的吸光度，可以获得核酸的浓度和纯度信息。
这种方法在生物学研究、医学诊断、药物开发等领域具有重要的应用价值，为相关领域的实验和生产提供了高效可靠的分析手段。
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生物素
链霉亲和素
（2）生物素标记的探针
链霉亲和素-生物素化HRP复合物的制备：利用亲和素与生物素间特异的结 合，将亲和素与等体积的生物素化酶（HRP－B）按一定浓度比例混合反 应后，亲和素即与HRP-B中的生物素结合，形成亲和素—生物素化HRP复 合物（avidin-biotin-peroxidase complex，SABC）。增加了酶量，提高了 反应的灵敏性。
（1）地高辛配基标记的探针
二氨基联苯胺（DAB）是辣根过氧化物酶最敏感、最常用的显色底物,反 应产物因不溶于水、二甲苯和醇的棕色沉淀物而被广泛地用于蛋白印迹
（2）生物素标记的探针
美国耶鲁大学的Langer等人用化学方 法合成了几种这样的嘧啶核酸类似物
生物素分子结构
光生物素（photobiotin） 它是一种化学合成的生物素衍生物。生物素分子侧链 上连接的芳香基叠氮化合物基团具光敏感性，在一定波长的光照射下，光敏基 团可转变为芳香基硝基苯而直接与腺嘌呤N7位氨基结合，形成生物素化的核酸 探针，用于DNA或RNA的标记。
辣根过氧化物酶(简称HRP)。过氧物酶催化鲁米诺被过氧化物氧化的化 学发光机制已经被广泛讨论，鲁米诺先被HRP-I或HRP-II氧化为鲁米诺 自由基 (L−•)，L−•再经由图一的途径产生化学发光。
鲁米诺
（2）生物素标记的探针
链霉亲和素（streptavidin，SA）是由链霉菌streptomyces avidinii分泌的一种蛋 白质。链霉亲和素分子由4条相同的肽链组成，其氨基酸组成中，甘氨酸和丙氨酸 的含量较大，而且结合生物素的活性基团也是肽链中的色氨酸残基；链霉亲和素是 一种稍偏酸性（pH6.0）的蛋白质，并且不带任何糖基。链霉亲和素分子中每条肽 链都能结合一个生物素，因此与亲和素一样，一个链霉亲和素分子也能结合4个生 物素分子，二者亲和常数（K）亦为1015L／mol。
Cy5是荧光素
（3）荧光素标记的探针
荧光
探针检出微生物原理
一、基因探针和探针探测
3.应用：
（1）菌落转移或菌落杂交
通过菌落杂交或转移的方法，基因探针也可用来检出生 长在有混合细菌种群平板上的细菌菌落内的特异基因序 列。进行菌落杂交时，将一片滤膜轻轻地按在平板上， 使每个细菌菌落的细胞就附到滤膜上。在滤膜上直接溶 解细胞，DNA就固定到滤膜上。然后在如上所述的滤膜 上进行探针检测和检出。经过这一程序，只有那些含有 特异DNA序列的菌落才有放射性信号。因为原始平板含 有所有的完整菌落，所以可以鉴别出所需菌落，并保留 下来甩于进一步研究。
一、基因探针和探针探测
3.应用： （2） Southern杂交和Northern杂交
Southern印迹法(DNA印迹法)是用于鉴别DNA序列的技 术。例如，我们想要知道一个基因是质粒上的，还是染 色体上的，可将这个菌株内所有的质粒抽提出来，并用 凝胶电泳分离开。质粒DNA用印迹法转移到一种特异性 膜上，然后对这个膜进行探针探测。只有含靶DNA序列 的DNA分子才能与探针杂交，使那些含靶DNA序列的质 粒被检出。
（2）生物素标记的探针
（3）荧光素标记的探针
寡核苷酸在合成序列中直接插入一 个或多个荧光染料，就可完成荧光 标记。或者将带有活性官能团(如磷 酸基或氨基、巯基等)的寡核苷酸， 与荧光染料分子上的反应基团通过 人工标记的方式连接起来。荧光基 团可以根据不同的需要，通过共价 键结合的方式连接到5，或末端3，。 末端。
（2）生物素标记的探针
生物素通过噻吩环戊酸侧链上的羧基与多种大分子偶联活化后，可用于标记各种 蛋白质（包括抗体、抗原、酶、激素及葡萄球菌Ａ蛋白等）形成生物素化蛋白质 衍生物。标记酶 以生物素标记辣根过氧化物酶（HRP）为例：
E E
E E
E
E
E
E
生物素
辣根过氧化物酶 （简称HRP）
生物素化HRP
（2）生物素标记的探针
一、基因探针和探针探测
2.探针制作： 基因探针方法学利用了DNA能变性和重退火的 特性。要做一个基因探针，所研究的这个基因的DNA序列必 须清楚。这个基因对特定的微生物种可能是独特的，，这个 基因可能编码一种某一代谢途径独特的酶，在这种清况下，
这一DNA顺序就有利于检出那种 微生物体。或者从这样一种序列 构建出的基因探针就有可能指示 土壤或水样品中一群细菌的潜在 活性，这类探针可定义为功能性 基因探针。例如，由编码固氮作 用的酶的DNA序列可做成基因探 针，这样的探针就可以用于测估 特定的土壤中是否含有携带固氮 基因的细菌。
一、基因探针和探针探测
凝胶电泳
凝胶电泳带
一、基因探针和探针探测
3.应用： （2） Southern杂交和Northern杂交
Norther印迹法（RNA印迹法）是一种类似Southern印迹 法的方法，用于分析RNA。从环境样品中抽提出的总 RNA可在凝胶上电泳，特异的RNA分子可由适当的探针 检出。
（1）地高辛配基标记的探针
水解去糖
地高辛 Dig＋dUTP
Dig一dUTP
地高辛配基digoxigenin,缩写为Dig
地高辛配基一O一琥珀酰ε一氨基己酸。 -N-羟基琥珀酰胺
（1）地高辛配基标记的探针
碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，AP)。AP 是磷酸酯的水解酶，可 通过靛蓝四唑反应显色 。靛蓝四唑反应底物为 溴氯羟吲哚磷酸盐 (BCIP)，经酶水解并氧 化形成靛蓝，而硝基蓝 四唑(NBT)在氧化过程中 被还原成不溶性紫蓝色 沉淀。
第三章 基因探针和探针探测
1.基因探针：基因探针是一种核酸杂交技术的应用。探针是 一小段DNA，称为寡核苷酸。它与所研究的靶序列互补，并 以某种方式作为记号或标记，使之能被检出。探针已经用于 环境微生物学中检测土壤微生物多样性、鉴别特定的基因型 和测试水中分离出的病原体的毒力基因。
一、基因探针和探针探测
3.应用：
（3） 生物芯片
基因芯片是指对各种生物随机克隆和随机测序所得的 cDNA片段进行归类，并把每一类cDNA片段的代表克隆 （代表一个独立基因 ）经过体外扩增，得到大小和序列 不同的片段分别经过纯化后，利用机械手高速将它们高密 度有序地点样固定在玻片硅晶片或尼龙膜上，从而制备成 cDNA微阵列，以此对各基因的表达情况进行同步分析。