细胞培养基的选择

D-Hanks’ 平衡盐溶液(D-Hanks Balanced Salt Solutions, D-HBSS)
KCl KH2PO4 NaCl NaCO3 Na2HPO4 D-Glucose Phenol Red 0.40g 0.06g 8.00g 0.35g 0.048g 1.00g 0.01g
（三）、消化液——分散组织、细胞 ——
EDTA·4Na 溶液：
一种化学螯合剂，对细胞有一定的离散作用， 而且毒性小，价格低廉，使用方便 常用工作液浓度为0.02%。
注意：使用EDTA 处理细胞后，要用平衡盐液冲洗干 净，因残留的EDTA 会影响细胞生长（E-cadherin)
EDTA 溶液配制：用D-Hanks’ 平衡盐溶液溶解 后，高压蒸汽灭菌，分装成小瓶，4℃冰箱保存
使用终浓度为1-4mmol/L 一般配制为100倍浓缩液，即浓度为200mmol/L （29.22g/L），配制方法为 ： 谷氨酰胺2.922g溶于三蒸水加至100ml即配成 200mmol/L的溶液，充分搅拌溶解后（应加温 30℃），过滤除菌，分装小瓶，-20℃保存， 使用时可向100ml培养液中加入0.5-2ml谷氨酰 胺浓缩液，终浓度为1-4mmol/L
第一部分： 动物细胞用液的制备
细胞培养基本技术
细胞培养用液及培养基
☆ 培养用液——水
平衡盐溶液 消化液 ☆ 培养基——天然培养基 合成培养基
配液前准备：
①滤器、滤膜、磁力搅拌器、天平、烧 杯、量筒、注射器。 贮液瓶（生理盐水瓶）、瓶塞、15磅， 121℃，20分钟蒸气灭菌 ②NaHCO3、NaOH、HCl、胎牛（小牛） 血清、青霉素、链霉素、三蒸水、培养 基粉剂
作用： （1）在进行原代培养过程中需分散组织、细胞。 （2）在传代中要使细胞脱离附着的底物时均需使用消化液。 类型： 组织细胞培养中常用的消化液为胰蛋白酶、二乙烯四乙酸二钠 （EDTA）及胶原酶溶液，可以分别单独使用或混合使用。
胰蛋白酶液(Trypsin)
● 使细胞间的蛋白质水解、细胞分散培养细胞传代。 分离组织、细胞团消化所需时间和浓度与细胞特性相关
抗生素溶液
通常是青霉素和链霉素联合使用，俗称“双抗溶 液”。 青霉素主要是对革兰阳性菌有效，链霉素主要 对革兰阴性菌有效。加入这两种抗生素可预防绝 大多数细菌污染。 培养基内青霉素、链霉素最终使用浓度为每毫升 100单位。 庆大霉素：每毫升100单位
抗菌素液（青、链霉素： ）：
青、链霉素：最终浓度为青霉素 100U/ml，链霉素100U/ml。 一般市售市售链霉素为100万U/瓶，将 其溶解在10ml Hanks液或三蒸水中，取 8ml链霉素液溶解80万U/瓶青霉素，即 成为青霉素、链霉素各1.0×105U/ml的 母液.使用时每100ml培养液中加 0.1ml，即成最终浓度为100U/ml。
NaHCO3 溶液
常用浓度为7.5%。配制时用三蒸水溶解 后，过滤除菌或高压灭菌，分装，4℃保 存
（五）、HEPES溶液：
一种弱酸，中文名字是羟乙基哌秦乙硫磺酸，对细胞无 毒性 主要作用:防止培养基pH迅速变动。在开放式培养条件 下，观察细胞时培养基脱离了5%CO2的环境，CO2气体迅 速逸出，pH迅速升高，若加了HEPES，此时可以维持 pH7.0左右。一般在进行克隆化培养时要添加HEPES 使用终浓度一般为10-50mmol/L（分子量238.31）溶液 50 常配成1M 储存液：用20ml 双蒸水溶解4.76克HEPES， 过滤除菌或高压灭菌，分装小瓶，4℃保存。使用时可 保存。 向100ml培养液中加入2ml HEPES浓缩液，终浓度为 HEPES 20mmol/L
胶原酶液 ：
消化细胞间质，分离上皮细胞与胶原成分。 根据细胞类型选用不同型号胶原酶（Ⅰ-Ⅳ）。 新鲜配制、 37-38oC作用、时间控制。 EDTA不可与胶原酶联用，因胶原酶的消化作用依赖 于钙。 附：细胞外基质成分有胶原、纤粘蛋白（FN）、层粘连蛋 白（LN）、弹性蛋白等）
（四）、pH 调整液：
细胞培养基本技术2
第一部分：细胞培养用液及培养基
☆ 培养用液——水
平衡盐溶液 消化液 ☆ 培养基——天然培养基 合成培养基
第二部分内容：
原代细胞分离、培养（酶消化法和组织块培养法）。 细胞生长状况的观察。 培养细胞一代生长过程。 传代。 冻存与复苏。 细胞培养注意事项（如细胞污染）。 细胞培养的一些专业术语介绍（如细胞株、系， 上皮细胞型、成纤维细胞型）
特点： 1、胰蛋白酶的活力用解离酪蛋白的能力来表示，常用的有1： 125和1：250两种。 2、许多学者认为钙、镁离子和血清的存在都会降低胰蛋白酶的 活力。消化细胞时，加入一些血清（10%）或含血清的培养液，能终止消
化作用。
胰蛋白酶溶液配制： 称取胰蛋白酶粉末置烧杯中，用少许DHanks 平衡盐（或PBS）溶液调成糊状，再 补足D-Hanks 平衡盐溶液，搅拌混匀，置 室温4 小时或冰箱过夜，不断搅拌振荡 次日，过滤除菌，分装入瓶中， -20℃保 存备用（以免分解失效），常用浓度为 0.25% （0.1%-0.5%）。 如果短期内要使用，就放置4℃冰箱。
市场上可提供干粉培养基和液体培 养基
干粉培养基需使用者自己配制并灭菌，其优 点是价格便宜。缺点是配制过程繁琐，质量 不易控制 液体培养基是由专业厂家按标准规模化生 产，不仅质量得到保证，而且使用十分方便
ห้องสมุดไป่ตู้
● 种类 根据细胞特性选择（文献） 199——成分复杂，不常用；改良为109效果较199好 Eagle系列——MEM（Eagle最低必需培养液） BMEM（氨基酸改良） DMEM（增加成分）：高糖、低糖 RPMI1640——常用、悬浮细胞、多种细胞 Ham——F12：加微量元素等，可少用血清 单细胞、克隆化培养，无血清培养
联合使用： 胰蛋白酶和EDTA联合使用可提高消化效 率(细胞与细胞之间的粘附分子需要Ca2+: cadherin, selectin, integrin). 但需注意EDTA不能被血清中和，消化后 要彻底清洗，否则细胞易脱壁。
联合使用： 常用的配制方法（0.25%trypsin0.04%EDTA溶液）： 胰蛋白酶0.25 g，EDTA0.04 g，PBS(-) 液100 mL，烧杯内磁力搅拌充分溶解， 0.22μm滤膜正压过滤，-20℃冰箱保 存。
三、培养基
培养基——维持体外细胞生存和生长的溶液 ● 天然培养基 取自动物 营养成分丰富；来源受限 • 血清： 小牛、胎牛、马、人（市售） 须灭活补体（56oC、30min）、- 20oC保存 质量差异大（无细菌、支原体、病毒） • 血浆 鸡血浆；现少单独使用
•合成培养基：
合成培养基：
合成培养基 一般需加血清等 成分 氨基酸、维生素、糖类、无机离 子、辅助成分
干粉培养基的配制
认真阅读说明书。说明书都注明干粉不包含的成分， 常见的有NaHCO3、谷氨酰胺、丙酮酸钠、HEPES 等。这些成分有些是必须添加的，如NaHCO3、谷氨 酰胺，有些根据实验需要决定。 配制是要保证充分溶解，NaHCO3、谷氨酰胺等物质 都要等培养基完全溶解之后才能添加。 配制所用的水应是三蒸水，离子浓度很低。 所用器皿应严格消毒。 配制好的培养基应马上过滤，无菌保存于4度。
细胞培养基应用选择：
选择培养基没有一定的标准，有几点建议可供参考： (1 ）建立某种细胞株所用的培养基应该是培养这种细胞 首选的培养基。可以查阅参考文献，或在购买细胞株时 咨询。 (2) 其它实验室惯用的培养基不妨一试，许多培养基可 以适合多种细胞。 (3) 根据细胞株的特点、实验的需要来选择培养基。如 小鼠细胞株多选 RPMI1640 。
RPMI1640种类
RPMI—1640（A） （不含谷氨酰胺、可高压灭菌） RPMI—1640（A）无酚红 （不含谷氨酰胺、高压灭菌） RPMI—1640 （含谷氨酰胺、除菌过滤灭菌）
DMEM细胞培养基
是在MEM培养基的基础上研制的 与MEM比较增加了各种成分用量，同时又分为高糖型 （低于4500g/L）和低糖型(低于1000g/L)。 高糖型有利于细胞停泊于一个位置生长，适于生长较 快、附着较困难肿瘤细胞等。 DMEM（A）【不含谷氨酰胺、可高压灭菌】 DMEM（H）【含谷氨酰胺、高糖型、除菌过滤灭 菌】 DMEM（L）【含谷氨酰胺、低糖型、除菌过滤灭 菌】。
超纯净水：
采用进口的RO膜、离子交换膜、离子交换树 脂、抛光核子级树脂、静音高压泵、电磁阀 等，产品性能得到最大化的保证； 分子生物学、生命科学、基因研究、组织培 养、试管婴儿、生物工程、动物细胞培养、培 养基制备、DNA测序、氨基酸分析、疾控中 心、水质检测中心、药检所、质检所、高校科 研等标准实验室及各种高端精密仪器用水。
配液过滤无菌操作要求：
操作前无菌室及无菌操作台以紫外灯照射30 分钟灭菌，以70 % ethanol 擦拭无菌操作抬 面，并开启无菌操作台风扇运转10 分钟 操作时，小心取用无菌之实验物品，避免造 成污染。勿碰触吸管尖头部或容器瓶口。 在整个无菌操作过程中都应该在酒精灯的周 围进行
一、细胞培养用液及培养液——水
PBS（Phosphate-Buffered Sallines）
KCl KH2PO4 NaCl Na2HPO4·7H2O 0.20g 0.20g 8.00g 2.16g
DPBS（Dulbecco’s Phosphate-Buffered Sallines）标准型
CaCl2(anhyd.)(无水氯化钙) KCl KH2PO4 MgCl2·6H2O NaCl Na2HPO4·7H2O 0.10g 0.20g 0.20g 0.10g 8.00g 2.16g
（六）、谷氨酰胺补充液：
谷氨酰胺在细胞代谢过程中起重要作用，合成 培养基中都要添加，由于谷氨酰胺在溶液中很 不稳定容易降解，4℃下放置7天即可分解约 50%，所以都是在使用前添加. 配制好的培养液（含谷氨酰胺）在4℃放置2周 以上时，要重新加入原来量的谷氨酰胺，故需 单独配制谷氨酰胺，以便临时加入培养液内