细胞运动及迁移检测方法的比较与选择
Transwell是检测细胞侵袭能力的检测方法.
Transwell是检测细胞侵袭能力的检测方法我们所使用的是Chemicon公司的ECM554，基质胶已经包被好了，买来就可以用，很方便,而且我们算过,跟自己买胶来包被价格相差不大。
这种胶4度下很软,37度则变得比较坚硬，因此用前应先放在培养箱中10分钟作用，使胶完全凝固。
该试剂盒对穿过膜的细胞进行荧光染色，再用裂解液裂解细胞后检测荧光值。
我们在实际使用的时候对穿过膜的细胞采用1%结晶紫染色,镜下计数细胞数目.结晶紫也可以用33%醋酸溶解,再用酶标仪570nm检测，同样可以反应穿过细胞数因为基质胶的厚度直接影响穿过膜的细胞数，因此建议有条件的话还是买这类已经铺好胶的试剂盒,比较可靠。
说明书该公司网上可以下载，对原理也有比较详细的阐述，可以去查一下.我们做的时候，上室用0.5％BSA的培养液，下室用5%血清的培养液,下室血清的浓度可根据细胞类型的不同进行调整,如果细胞侵袭能力强,可适当降低血清浓度,否则可适当提高血清浓度。
需要注意的是：1。
上室内的细胞数目要适当，过多,穿过膜的细胞会过多过快，如果用计数法的话将难以计数；最少也要保证在收样的时候，上室内还要有细胞存在。
具体细胞密度需要自己摸索。
2。
细胞计数的准确性对结果影响很大，各组间最好不要分开计数.尽量用同一密度的细胞悬液给予不同处理,保证各组细胞量一致3.对细胞的处理不可影响细胞生存。
否则难以肯定是细胞量的改变还是侵袭能力改变侵袭小室其实不止是transwell的,其它像Boyden chamber、Thincert也挺好用的。
我用过Thincert,个人感觉不错,而且价格便宜,是grelner的,孔径8微米用于24孔板的一个才45块人民币，而且可以零买,不想transwell,总是一箱一箱的卖,实在是太贵了!侵袭实验要结合实验目的,不一定非要包被的。
下面奉上用Thincert做侵袭实验的步骤(摘自《A quantitative cell migration assay using ThinCert™ cell culture inserts》，大家如需要,可用google搜之：1. Prepare cell cultures according to standard cell culture procedures2。
Transwell 使用介绍
1. Transwell关于Transwell这个词该如何解释，查了很多资料也未见准确的注解，我觉得可以这么理解吧，trans-这个词根有转移、转运、穿过等意思，well有小室的意思，可以从字面上理解，这是一类有通透性的杯状的装置，根据Corning公司的Transwell说明书中的介绍，可以认为这是一种膜滤器（Membrane filters），也可认为是一种有通透性的支架（perme able supports）。
更准确地说，Transwell应该是一种实验技术，这项技术的主要材料是Transwell小室（Transwell chamber，Transwell insert），其外形为一个可放置在孔板里的小杯子，不同厂家对Transwell会有不同的命名，而不同型号也可有不同形状，不同大小，根据实验需要，可有不同选择。
但无论是何种外形，其关键部分都是一致的，那就是杯子底层的一张有通透性的膜，而杯子其余部分的材料与普通的孔板是一样。
这层膜带有微孔，孔径大小有0.1－12.0µm，根据不同需要可用不同材料，一般常用的是聚碳酸酯膜（polycarbonate membrane）。
下图是一个Transwell装置的纵切面将Transwell小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上室内盛装上层培养液，下室内盛装下层培养液，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔。
我们将细胞种在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，从而可以研究下层培养液中的成分对细胞生长、运动等的影响。
应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜，就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。
（1）共培养体系：小于3.0um孔径条件下，细胞不会迁徙通过，因此，若研究不涉及细胞运动能力，不需要细胞穿过聚碳酸酯膜，则应选择3.0µm以下孔径。
常用0.4、3.0µm。
细胞生物学实验教程：细胞运动性检测实验详细介绍
一、细胞生物学实验教程：细胞运动性检测实验详细介绍细胞的运动是机体新陈代谢与基本生命特征之一。
在低等生物中，原始细胞通过变形与伪足活动趋近食物与远离伤害。
在高级生物体的生命活动中，细胞的定向迁移与胚胎形成、神经发育、免疫应答、器官成熟等密切有关。
人类的许多重大疾病及其治疗，如肿瘤转移，神经修复、干细胞功能再生等等都与细胞运动息息有关。
细胞的运动依靠于细胞骨架（Cytoskeleton），细胞骨架除了承担胞内的物质运输之外，也是构成细胞运动性的物质基础，比如肌动蛋白是细胞运动伪足中最要紧的结构单位。
当细胞感受到外界的刺激信息（如食物信号等），会伸出扁平的片层伪足，通过其前沿的不断延展与基部的收缩，与细胞与支撑物之间的吸附、解吸附的动态循环，朝向刺激源运动。
细胞的运动还具有粘附性（Adhesion）与趋向性（Polarization）的特点，不一致的粘附因子与细胞外基质（Extracellular Matrix）相互作用一方面决定了细胞运动的分子信号调控，同时与大量的趋化因子共同决定了不一致细胞的特定组织转移与偏好。
图1：细胞的定向迁移运动图2：细胞的运动性与细胞骨架蛋白图3：神经干细胞分化与神经元的定向迁移图4：原生癌细胞的迁移与侵袭图5：一个正在穿孔的肿瘤细胞的运动图6：恶性黑色素瘤细胞侵入机体正常组织图7：上皮细胞在伤口部位增殖，运动迁移，进行组织修复二、细胞运动性常用检测方法细胞运动性研究在发育生物学、神经生物学、癌症与干细胞生物学等诸多前沿科学领域具有重大研究意义。
然而长期以来细胞运动性检测是一个技术难点，目前常规可用于细胞运动性评估的要紧方法有：基于显微镜的形态观察（含荧光标记）、体外组织移植、细胞集落划痕与Boyden Chamber法，这些方法各有千秋，但都无法实现定量检测细胞定向迁移、癌细胞侵袭性与细胞粘附性等，最近罗氏公司推出的基于Boyden Chamber原理的微电子细胞芯片检测技术（xCELLigence）实现了定量、动态、无标记关于大规模细胞迁移、侵袭、粘附性的检测，同时还可同步检测包含细胞增殖、凋亡等多项细胞生理学功能。
生物科学研究中的细胞迁移研究
生物科学研究中的细胞迁移研究细胞迁移是生物科学研究中的一个重要领域。
它涉及细胞的运动、生长、生殖等多个课题，以及很多疾病的形成与发展。
细胞迁移的研究涉及到生物学、化学、物理学等多个学科，因此其研究领域很大，涉及到多个难以解决的科学问题。
1. 细胞迁移的基本概念细胞迁移是细胞运动的一种形式，是细胞膜发生形变后向外膜外发出伪足，并将其拉长，进而使细胞向指向某个方向的方向运动。
细胞迁移是一种非常复杂的过程，其中涉及到细胞骨架的变化、细胞外环境的变化、细胞内部的信号传递等多个方面。
细胞迁移是细胞生长、发育等过程中必须的步骤之一，能够使得细胞到达新的位置，完成新的任务。
2. 细胞迁移的类型细胞迁移的类型很多，其中最重要的是两种类型：穿透性迁移和非穿透性迁移。
穿透性迁移是指细胞的迁移过程中需要穿过一些障碍物，如细胞间隙（细胞与细胞之间的间隔）、基底膜（细胞与基质之间的界面）等等。
非穿透性迁移则是细胞通过渗透或滑动等方式进行迁移，而不需要穿过障碍物。
这两种迁移方式的研究为我们更好地理解细胞生长、发育等过程提供了有益的信息。
3. 细胞迁移的研究领域细胞迁移的研究领域非常广泛，其中包括细胞生长、细胞凋亡、肿瘤形成等多个领域。
研究显示，细胞迁移的机制与如何防止癌症等多种疾病的形成密切相关。
因此，对于细胞迁移的研究具有非常重要的科学价值。
4. 细胞迁移的影响因素细胞迁移的影响因素非常多，其中重要的因素包括细胞因素和环境因素。
细胞因素包括细胞骨架的结构、信号通路的调控等，环境因素则包括温度、pH值、压力等。
在研究细胞迁移的机制的过程中，我们需要同时考虑这些因素对细胞迁移的影响。
5. 海绵微流控芯片在细胞迁移研究中的应用近年来，一种新的技术——海绵微流控芯片技术被广泛应用于细胞迁移的研究。
海绵微流控芯片是利用纳米孔道进行微流控操作的一种技术，它能够实现单个细胞的高精度操纵和分析，被广泛用于生物学、生物化学等多种领域的研究。
细胞因子与细胞黏附因子的测定
细胞因子与细胞黏附因子的测定第一节生物学测定方法常见的生物学测定法包括：基于DNA检测的分子生物学测定法和生物活性测定法。
前者有细胞因子或细胞黏附分子DNA扩增法、RNA印迹法、原位杂交法、核酸酶保护分析等，可定性或定量分析细胞因子和细胞黏附分子的基因或mRNA。
后者则是根据细胞因子特定的生物活性而设计的检测方法，主要用于细胞因子的测定。
生物活性测定法的基本原理，是根据不同细胞因子所具有的某一方面独特的生物学活性，构建发挥这一活性的反应体系，通过观察其活性作用的结果，判断有无相应细胞因子的存在。
有助于细胞因子检测的活性作用大致有以下几类：1.刺激细胞增殖或集落形成的活性；2.维持细胞生长和存活的特性；3.抑制细胞生长或破坏细胞的效应；4.促进细胞趋化或抗病毒作用等。
一、促进细胞增殖和抑制细胞增殖测定法1.直接计数法2.细胞代谢活性测定方法3.细胞代谢产物测定法常用放射性核素掺入法和MTT比色法二、细胞毒活性测定法对指示细胞具有破坏作用的细胞因子，若与细胞共育将会导致细胞死亡。
因此，待测细胞因子做一系列稀释后加至指示细胞培养体系，以检测培养细胞的死细胞数作为判断指标，死细胞数量与细胞因子的活性成正比。
本法常用于TNF等的测定。
三、抗病毒活性测定法抗病毒活性测定法主要用于IFN等细胞因子的检测。
四、趋化活性测定法其诱导细胞迁移的方式包括趋化性和化学增活性。
趋化性可采用琼脂糖和Boyden盲端微孔小室趋化试验测定。
化学增活性可采用琼脂糖小滴化学动力学试验测定。
五、生物学活性测定方法学评价细胞因子生物学活性测定法主要具有以下特点：1.敏感性较高2.特异性不高3.操作繁琐4.易受干扰第二节免疫测定方法一、ELISA方法双抗体夹心法是用于细胞因子测定的最常用方法。
细胞因子测定的标本主要包括两大类，一是血清（血浆）、关节液、胸腔液、脑脊液或腹腔液等体液，可用于细胞因子和可溶性黏附分子的检测；二是细胞体外培养后的培养上清液，只用于细胞因子的检测。
细胞迁移和侵袭实验
细胞迁移和侵袭实验实验准备：细胞，24孔板，transwell小室（8µm，24孔板专用），ECM Gel，10%FBS+培养基，无血清培养基，10 µ、200 µL、1000 µL移液器及配套枪头，1.5 mL EP 管，冰盒实验设计：实验分组一般分为阴性组（上下层均没有趋化因素），实验组（按照实验需要，上层或者下层加入趋化因素），对照组（趋化因素与实验组中的相反）。
如果有特别需要，可以再加上阳性组（上下层都有趋化因素）。
实验操作（请细读注意事项）：一、细胞侵袭实验1.ECM Gel原液提前1 h放在4 ℃冰箱中解冻，实验前转移到冰盒中。
2.将1.5 mL EP、枪头盒、transwell放在24孔板里面后，置于冰上预冷。
3.根据自己的使用量，按照ECM Gel : 无血清培养基=1 : 7.5在冰上稀释成使用液。
4.把枪头剪去一小段（约3 µm）后在冰上吸取40 µL/孔ECM Gel使用液轻轻加入transwell上室中，加入时慢慢移动枪头，保证液体平铺在底部。
5.放在37 ℃孵箱15 min，让胶凝固。
6.消化、离心、计数细胞后，按照2.5x104 / mL用无血清培养基稀释细胞，制成细胞悬液（如果细胞很多，这一步可以提前，在4、5之前做）。
7.按照每孔200 µL，将细胞悬液加入transwell上室，同时在transwell下室加入10%FBS+培养基500 µL，放入37 ℃孵箱培养。
8.若干小时后取出，吸去transwell上室多余液体，用PBS清洗两次，用棉棒在上室中轻轻转动，吸干水分并擦去膜内侧的细胞。
9.在上室中加入结晶紫染液，染色5 min，回收染液，用流水缓缓冲去染液，再次用棉棒在上室中轻轻转动，吸干水分。
10.在正置显微镜上放置一块载玻片，将transwell小孔倒置放在上面，拍照。
11.在100倍视野下，对膜的上下左右及中间计数，做平均数。
METTL5对肺腺癌细胞迁移和侵袭的影响及机制
第59卷 第5期2023年10月青岛大学学报(医学版)J O U R N A LO FQ I N G D A O U N I V E R S I T Y (M E D I C A LS C I E N C E S)V o l .59,N o .5O c t o b e r 2023[收稿日期]2023-02-03; [修订日期]2023-05-25[基金项目]国家自然科学基金资助项目(82072927)[第一作者]彭修法(1995-),男,硕士研究生㊂[通信作者]张春玲(1966-),女,主任医师,硕士生导师㊂E -m a i l :qd z c l 2011@163.c o m ㊂M E T T L 5对肺腺癌细胞迁移和侵袭的影响及机制彭修法1,王蕊红2,王晔2,刘凤娟1,张春玲1(青岛大学附属青岛市中心医院,山东青岛 266042 1 呼吸与危重症医学科; 2 检验科)[摘要] 目的 探讨甲基转移酶样蛋白5(M E T T L 5)基因对肺腺癌细胞迁移和侵袭功能的影响及潜在机制㊂方法 使用基因表达数据集(G E O )数据库分析肺腺癌及癌旁组织中M E T T L 5的表达差异,采用W e s t e r nb l o t 方法检测正常肺上皮B E A S -2B 与肺腺癌A 549㊁H 1975细胞系中M E T T L 5蛋白的表达水平㊂应用L V 3-M E T T L 5-s h R N A 慢病毒感染肺腺癌A 549和H 1975细胞系以敲低其M E T T L 5基因表达,W e s t e r nb l o t 法验证沉默效果㊂成功敲低M E T T L 5基因后,通过T r a n s w e l l T M 实验检测两种细胞系迁移㊁侵袭能力,用W e s t e r nb l o t 法检测上皮间质转化(E M T )标记物E -C a d h e r i n ㊁V i m e n t i n 蛋白表达㊂结果 G E O 数据库分析结果显示,肺腺癌组织M E T T L 5的表达显著高于癌旁正常组织,且高表达的病人预后更差㊂M E T T L 5在肺腺癌A 549和H 1975细胞中表达显著高于正常肺上皮B E A S -2B 细胞系㊂敲低M E T T L 5后A 549和H 1975细胞的迁移㊁侵袭能力显著降低,且间质标记物V i m e n t i n 表达显著下调,上皮标记物E -C a d h e r i n 表达显著上调㊂结论 M E T T L 5可能通过促进E M T 过程促进肺腺癌细胞的迁移和侵袭㊂[关键词] 肺腺癌;蛋白甲基转移酶类;上皮-间质转化;细胞运动[中图分类号] R 734.2;R 329.28 [文献标志码] A [文章编号] 2096-5532(2023)05-0645-06d o i :10.11712/jm s .2096-5532.2023.59.163[开放科学(资源服务)标识码(O S I D )][网络出版] h t t ps ://l i n k .c n k i .n e t /u r l i d /37.1517.R.20231128.1537.003;2023-11-30 09:44:17R O L EO F M E T T L 5I N M I G R A T I O N A N DI N V A S I O N O F L U N G A D E N O C A R C I N O M A C E L L SA N D M E C H A N I S M S P E N G X i u f a ,WA N GR u i h o n g ,WA N GY e ,L I UF e n g j u a n ,Z HA N GC h u n l i n g (D e p a r t m e n t o fR e s p i r a t o r y a n dC r i t i c a l C a r eM e d i -c i n e ,T h eA f f i l i a t e dC e n t r a lH o s p i t a l o fQ i n g d a oU n i v e r s i t y ,Q i n gd a o 266042,C h i n a )[A B S T R A C T ] O b je c t i v e T o i n v e s t i g a t e t h e r o l e of t h em e t h y l t r a n s f e r a s e -l i k e p r o t e i n5(M E T T L 5)g e n e i n th emi g r a t i o n a n d i n v a s i o no f l u n g a d e n o c a r c i n o m a c e l l s a n d t h e p o t e n t i a lm e c h a n i s m s . M e t h o d s M E T T L 5e x p r e s s i o n l e v e l s i n l u n g a d e n o c a r -c i n o m a a n d p a r a c a n c e r o u s t i s s u e sw e r e c o m p a r e d t h r o u g ht h eG e n eE x p r e s s i o n O m n i b u s (G E O )d a t a b a s e .M E T T L 5p r o t e i ne x -p r e s s i o n l e v e l s i n n o r m a l l u n g e p i t h e l i a l c e l l s (B E A S -2B )a n d l u n g a d e n o c a r c i n o m a c e l l l i n e s (A 549a n dH 1975)w e r e d e t e r m i n e d b y W e s t e r nb l o t .A 549a n dH 1975c e l l l i n e sw e r e i n f e c t e dw i t h t h eL V 3-M E T T L 5-s h R N Al e n t i v i r u s t ok n o c k d o w n t h e e x pr e s s i o no f t h e M E T T L 5g e n e ,w h i c hw a s v e r i f i e db y W e s t e r nb l o t f o r t h e s i l e n c i n g e f f e c t s .A f t e r s u c c e s s f u l l y k n o c k i n g do w n t h e M E T T L 5g e n e ,t r a n s w e l l a s s a y w a s u s e d t od e t e r m i n e t h em i g r a t i o na n d i n v a s i o na b i l i t i e s o f t h e t w o c e l l l i n e s .T h e e x p r e s s i o no f e p i t h e l i a l -m e s e n c h y m a l t r a n s i t i o nm a r k e r s (E -C a d h e r i n a n dV i m e n t i n p r o t e i n s )w a sm e a s u r e d b y W e s t e r nb l o t . 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I-1640)购自G i b c o公司;胎牛血清(F B S)购自E x c e l l公司;磷酸盐缓冲液(P B S)购自索莱宝公司;青链霉素混合液㊁2.5g/L胰蛋白酶溶液购自H y c l o n e公司;一步冻存液购自海星公司; 2ˑ蛋白上样缓冲液(2ˑl o a d i n g b u f f e r)㊁电泳转移缓冲液(即转膜液)㊁聚丙烯酰胺凝胶电泳(S D S-P A G E)缓冲液㊁T B S T缓冲液购自S o l a r b i o公司; 40g/L多聚甲醛固定液㊁结晶紫染液购自碧云天公司;M a t r i g e l基质胶购自美国C o r n i n g公司;A n t i-h u m a n M E T T L5多克隆抗体㊁H R P标记的羊抗兔I g G购自武汉爱博泰克公司;兔抗人E-C a d h e r i n㊁V i m e n t i n㊁G A P D H抗体购自美国C e l lS i g n a l i n g T e c h n o l o g y公司;M E T T L5的干扰慢病毒购自上海吉玛公司㊂1.2实验方法1.2.1生物信息学分析首先在基因表达数据集(G E O)数据库中搜索肺腺癌数据,下载数据集,分析M E T T L5的表达情况㊂利用G E P I A软件根据M E T T L5的表达差异对肺腺癌病人进行生存分析,绘制K a p l a n-M e i e r生存曲线㊂1.2.2细胞培养㊁转染及稳转株筛选 A549及H1975细胞系使用R P M I-1640完全培养液(内含体积分数0.10F B S和体积分数0.01的青链霉素双抗)培养,培养箱条件为37ħ㊁内含体积分数0.05的C O2㊂当细胞汇合度达到90%左右并处于对数生长期时,消化并重悬两种细胞后接种于6孔板中,分别使用C o n t r o l及L V3-M E T T L5-s h R N A干扰慢病毒按照说明书进行转染,分为C o n t r o l组及s h M E T T L5组,72h后通过荧光显微镜观察荧光㊂重新铺板,加入嘌呤霉素使终质量浓度为5m g/L,筛选M E T T L5敲低的稳转株㊂1.2.3W e s t e r nb l o t法检测取经嘌呤霉素筛选后㊁镜下可见荧光的两组细胞,使用蛋白裂解液2ˑl o a d i n g b u f f e r裂解细胞提取蛋白样品,并在95ħ条件下金属浴10m i n使蛋白变性㊂吸取8μL的样品加入上样孔中,140V电泳60m i n,200m A转膜90m i n,用50g/L脱脂牛奶进行封闭㊂1h后以T B S T清洗P V D F膜3次,分别与一抗A n t i-h u m a n M E T T L5多克隆抗体(1ʒ1000)和A n t i-h u m a n G A P D H单克隆抗体(1ʒ2000)室温孵育2h㊂用T B S T清洗3次后将P V D F膜放于H R P标记的A n t i-r a b b i t I g G二抗(1ʒ2000)中孵育1h㊂以T B S T清洗后使用超敏发光液进行显影㊂1.2.4 T r a n s w e l l T M实验检测在检测迁移能力时,将处于对数生长期的C o n t r o l组㊁s h M E T T L5组A549和H1975细胞消化并离心重悬,计数并将细胞密度调至1ˑ108/L,向上室中每孔加入200μL 细胞悬液,并在下室中加入800μL的R P M I-1640 (含体积分数0.20F B S),置于培养箱中培养24h㊂弃上层液体,以P B S清洗2次,用棉签拭去上室内的细胞,将小室置于多聚甲醛固定液中固定20m i n,弃去固定液㊂清洗后将小室置于1g/L结晶紫染液中染色15m i n,再次清洗并晾干,放于显微镜下拍照计数㊂检测侵袭能力时,先将M a t r i g e l基质胶与R P M I-1640培养液以1ʒ20均匀混合后,向上室内每孔加入100μL混合液,置于培养箱中过夜㊂其他条件同迁移能力检测㊂1.3统计学方法采用G r a p hP a dP r i s m8.0.2软件进行统计学分析㊂W e s t e r nb l o t检测所得的平均灰度值比值及T r a n s w e l l T M实验所得的细胞数均以xʃs表示,两组均数比较采用t检验;多组均数比较采用单因素方差分析,两两比较采用T u k e y检验㊂以P<0.05为差异有统计学意义㊂2结果2.1生物信息学分析对提取的G E O数据库数据进行分析,结果显示,肺腺癌组织中M E T T L5的表达显著高于癌旁正常肺组织,差异具有统计学意义(P<0.05)(图1A)㊂使用G E P I A绘制K a p l a n-M e i e r曲线,分析结果显示,M E T T L5表达水平高的病人具有更短的生存期(P<0.05)(图1B)㊂2.2 M E T T L5在肺腺癌细胞系中的表达W e s t e r nb l o t检测结果表明,B E A S-2B㊁A5495期彭修法,等.M E T T L 5对肺腺癌细胞迁移和侵袭的影响及机制647及H 1975细胞中M E T T L 5蛋白表达水平差异具有统计学意义(F =16.53,P <0.05)㊂与B E A S -2B 细胞相比,A 549及H 1975细胞中M E T T L 5蛋白表达水平升高,差异有统计学意义(P <0.05);而A 549细胞和H 1975细胞中M E T T L 5蛋白表达水平差异无统计学意义(P <0.05)(图2)㊂A :M E T T L 5在肺腺癌组织和癌旁正常组织中的表达;B :M E T T L 5表达与肺腺癌病人生存之间的关系㊂图1 M E T T L 5在肺腺癌组织中表达及其与病人预后关系的生物信息学分析A :3种细胞系中M E T T L 5蛋白表达的W e s t e r nb l o t 检测;B :3种细胞系M E T T L 5蛋白相对表达量比较㊂图2 M E T T L 5在肺腺癌细胞系中的表达2.3 敲低M E T T L 5表达对肺腺癌细胞迁移和侵袭的影响为研究M E T T L 5在肺腺癌细胞中的作用,使用慢病毒敲低A 549及H 1975细胞中M E T T L 5基因(图3A )㊂W e s t e r nb l o t 检测显示,M E T T L 5敲低后s h M E T T L 5组两种细胞M E T T L 5蛋白表达水平较C o n t r o l 组显著下调(t =8.403㊁4.222,P <0.05)(图3B ㊁C )㊂细胞迁移和侵袭实验结果显示,M E T T L 5敲低后s h M E T T L 5组两种细胞迁移细胞数和侵袭细胞数均较C o n t r o l 组明显减少(t =7.803~14.430,P <0.05),表明M E T T L 5显著促进A 549㊁H 1975细胞的迁移㊁侵袭(图3D~G )㊂2.4 敲低M E T T L 5对肺腺癌细胞V i m e n t i n 和E -C a d h e r i n 表达的影响本文W e s t e r nb l o t 检测结果显示,C o n t r o l 组和s h M E T T L 5组两种肺腺癌细胞V i m e n t i n 蛋白表达差异具有显著性(F =155.40,P <0.05);与C o n t r o l组相比,s h M E T T L 5组两种肺腺癌细胞V i m e n t i n 蛋白表达水平显著降低(P <0.05)㊂C o n t r o l 组和s h M E T T L 5组两种肺腺癌细胞E -C a d h e r i n 蛋白表达差异具有显著性(F =73.75,P <0.05);与C o n -t r o l 组相比较,s h M E T T L 5组两种肺腺癌细胞的E -C a d h e r i n 蛋白表达显著升高(P <0.05)㊂见图4㊂3 讨 论近年来随着肺癌筛查手段㊁靶向及免疫治疗的不断进步,肺癌病人的生存不断改善,但肺癌病人死亡数仍高居恶性肿瘤死亡数之首,且转移和复发的肺癌病人预后更差[8-9]㊂到目前为止,手术仍然是根治早期肺癌的唯一方法[10]㊂随着分子生物学及靶向治疗的发展,针对k i r s t e n 大鼠肉瘤病毒原癌基因(K r a s )㊁表皮生长因子受体(E G F R )㊁间变性淋巴瘤激酶(A L K )㊁c -r o s 肉瘤致癌因子-受体酪氨酸激酶(R O S 1)等靶点突变及程序性死亡受体1(P D -1)/程648青岛大学学报(医学版)59卷A:慢病毒转染后荧光效果图;B:A549和H1975细胞的M E T T L5蛋白表达;C:慢病毒转染后各组细胞M E T T L5蛋白相对表达量;D: T r a n s w e l l T M迁移实验用于验证两种肺腺癌细胞(A549㊁H1975)的迁移能力(结晶紫染色);E:A549和H1975细胞迁移能力的半定量分析;F: T r a n s w e l l T M侵袭实验用于验证两种肺腺癌细胞(A549和H1975)的侵袭能力(结晶紫染色);G:A549和H1975细胞侵袭能力的半定量分析㊂图3敲低M E T T L5对肺腺癌细胞迁移和侵袭的影响A:各组两种细胞V i m e n t i n和E-C a d h e r i n蛋白表达的W e s t e r nb l o t检测;B:各组两种细胞V i m e n t i n和E-C a d h e r i n蛋白相对表达量比较㊂图4敲低M E T T L5对各组肺腺癌细胞V i m e n t i n和E-C a d h e r i n表达的影响5期彭修法,等.M E T T L5对肺腺癌细胞迁移和侵袭的影响及机制649序性死亡受体-配体1(P D-L1)通路的新型靶向药物层出不穷,肺癌的治疗取得了长足进步[11-14]㊂但肺腺癌的靶向治疗仍处于发展阶段,因此寻找肺腺癌治疗的新靶点具有重要意义㊂m6A R N A甲基化作为一种表观遗传修饰方式,是真核生物中最丰富的R N A修饰[15]㊂该修饰早在20世纪70年代就被发现,但其确切功能和调控机制在很大程度上仍然不清楚[6]㊂研究发现, m6A修饰在各种R N A中均丰富而保守,表明它能够广泛调控基因表达[16-17]㊂随着研究的深入,m6A 修饰在肺腺癌进展中的作用及机制也逐渐被揭示㊂Y I N等[18]发现,线粒体R N A核糖核酸内切R N A 组分(R M R P)在N S C L C中高表达,M E T T L3通过提高R M R P R N A的m6A水平增强其稳定性,通过调节转化生长因子β受体1(T G F B R1)/S MA D 蛋白2(S MA D2)/S MA D蛋白3(S MA D3)途径促进N S C L C进展㊂因此,识别m6A相关基因㊁阐明它们在肺腺癌发生发展中的作用及调控机制对于肺腺癌治疗至关重要㊂M E T T L5是m6A甲基转移酶家族中新发现的一个成员,与其他家族成员参与m R N A甲基化修饰不同,M E T T L5可以与t R N A甲基转移酶112 (T R MT112)结合形成异二聚体以获得代谢稳定性,负责18S r R N A1832位腺苷甲基化[19]㊂R O N G 等[20]应用公开数据库及乳癌样本分析M E T T L5表达与乳癌病人生存之间的关系,结果显示乳癌病人M E T T L5高表达与较差的生存之间存在显著相关性㊂M E T T L5基因敲除的乳癌细胞中多聚核糖体形成减少,细胞整体翻译能力减弱,细胞周期发生停滞,细胞凋亡增加,表明M E T T L5可促进乳癌细胞生长㊂HU A N G等[21]研究发现,M E T T L5可通过调节c-M y c水平提高胰腺癌细胞迁移㊁侵袭能力从而促进胰腺癌恶性进展㊂P E N G等[22]的研究表明, M E T T L5通过靶向酰基辅酶A合成酶长链家族成员4(A C S L4)促进肝细胞肝癌(H C C)细胞从头脂肪生成并导致游离脂肪酸水平增加,使H C C细胞发生代谢重编程而促进H C C进展㊂然而,M E T T L5在肺腺癌中发挥的作用仍不清楚㊂我们在前期生物信息学分析中,通过对T C G A数据库中肺腺癌的差异表达m R N A进行分析,筛选出与肿瘤分期相关枢纽基因M E T T L5,首次发现M E T T L5在肺腺癌组织中高表达并与肺腺癌病人的不良预后显著相关㊂本研究结果显示,M E T T L5在肺腺癌细胞系中的表达水平明显高于正常肺上皮B E A S-2B细胞系,提示M E T T L5在肺腺癌中发挥促癌作用㊂为进一步探究M E T T L5在肺腺癌中的作用,本研究使用s h M E T T L5慢病毒转染肺腺癌A549和H1975细胞系,检测肺腺癌细胞的行为㊂体外细胞实验结果显示,转染s h M E T T L5的肺腺癌细胞迁移㊁侵袭能力显著降低,表明敲低M E T T L5基因能明显抑制肺腺癌的进展㊂E MT过程与癌症进展密切相关,E MT发生时上皮细胞形态改变,细胞间连接消失,细胞失去极性转变为具有转移和侵袭能力的间质细胞,促进肿瘤的转移与复发并使肿瘤细胞表现出明显的治疗抗性[23-24]㊂E MT过程中细胞发生了特征性的分子变化,具体表现为上皮标记物E-C a d h e r i n表达降低,间质标记物V i m e n t i n表达上调[25-26]㊂本文研究结果显示,敲低M E T T L5基因表达能够显著抑制肺腺癌细胞的E MT,表明M E T T L5通过促进肺腺癌细胞E MT进程促进肺腺癌进展㊂在后续研究中我们将探讨M E T T L5促进肺腺癌细胞E MT进程的具体分子机制㊂综上所述,M E T T L5在肺腺癌中高表达,其表达水平与病人预后呈明显负相关;敲低M E T T L5基因表达可显著抑制肺腺癌细胞迁移㊁侵袭,其机制可能是M E T T L5促进肺腺癌细胞E MT进程㊂本研究结果表明,M E T T L5可能在肺腺癌进展中发挥重要作用㊂因此,M E T T L5有望成为肺腺癌治疗的潜在靶点及评估肺腺癌发生发展的重要标志物㊂[参考文献][1]S U N G H,F E R L A YJ,S I E G E LRL,e t a l.G l o b a l c a n c e r s t a-t i s t i c s2020:G L O B O C A Ne s t i m a t e s o f i n c i d e n c e a n dm o r t a l i t yw o r l d w i d e f o r36c a n c e r s i n185c o u n t r i e s[J].C A:aC a n c e r J o u r n a l f o rC l i n i c i a n s,2021,71(3):209-249.[2]S I E G E L R L,M I L L E R K D,J E MA L A.C a n c e rs t a t i s t i c s,2016[J].C A:AC a n c e r J o u r n a l f o rC l i n i c i a n s,2016,66(1):7-30.[3]S U C C O N YL,R A S S LD M,B A R K E R AP,e t a l.A d e n o c a r-c i n o m a s p e c t r u ml e s i o n s o f t h e l u n g:de t e c t i o n,p a t h o l o g y a n dt r e a t m e n ts t r a t e g i e s[J].C a n c e r T r e a t m e n tR e v i e w s,2021, 99:102237.[4]Y IM,Z H E N GXL,N I U M K,e t a l.C o m b i n a t i o n s t r a t e g i e sw i t hP D-1/P D-L1b l o c k a d e:c u r r e n t a d v a n c e s a n d f u t u r e d i r e c-t i o n s[J].M o l e c u l a rC a n c e 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transwell实验(整理版)
第一节概念这里想明确两个概念，一个是Transwell，另一个是肿瘤细胞侵袭模型。
1．Transwelltrans-这个词根有转移、转运、穿过等意思，well有小室的意思，可以从字面上理解，这是一类有通透性的杯状的装置，根据Corning公司的Transwell说明书中的介绍，可以认为这是一种膜滤器（Membrane filters），也可认为是一种有通透性的支架（permeable supports）。
更准确地说，Transwell应该是一种实验技术，这项技术的主要材料是Transwell小室（Transwell chamber，Transwell insert），其外形为一个可放置在孔板里的小杯子，不同厂家对Transwell会有不同的命名，而不同型号也可有不同形状，不同大小，根据实验需要，可有不同选择。
Fig1但无论是何种外形，其关键部分都是一致的，那就是杯子底层的一张有通透性的膜，而杯子其余部分的材料与普通的孔板是一样。
这层膜带有微孔，孔径大小有0.1－12.0µm，根据不同需要可用不同材料，一般常用的是聚碳酸酯膜（polycarbonate membrane）。
下图是一个Transwell装置的纵切面Fig2将Transwell小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上室内盛装上层培养液，下室内盛装下层培养液，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔。
我们将细胞种在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，从而可以研究下层培养液中的成分对细胞生长、运动等的影响。
Fig3应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜，就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。
下面参考guxuefeng战友和cosmosci战友的帖子具体来谈谈孔径的选择，当然不同细胞其体积不同，具体选择时要考虑到细胞大小。
这里主要谈几种大家常用的实验：(1).共培养体系：小于3.0um孔径条件下，细胞不会迁徙通过，因此，若研究不涉及细胞运动能力，不需要细胞穿过聚碳酸酯膜，则应选择3.0µm以下孔径。
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细胞运动及迁移检测方法的比较与选择关键词：细胞仪器分析仪试剂标准物质北京标准物质网
一.transwell试验
transwell技术是检测细胞运动能力的经典方法，由于其原理简单、操作相对简便，该法目前已被广泛用于检测不同类型细胞的运动能力。
内室底部的薄膜是整个实验装置的核心部分，待测细胞的直径决定了薄膜孔径的选择。
通常情况下，薄膜的孔径应略小于细胞的直径以防止细胞直接漏入到外室。
transwell试验对细胞运动和迁移能力的评价主要依赖于对转移至底膜外侧细胞的染色和计数。
甲紫是transwell试验中常用的细胞染料，在染色前需要使用棉签将底膜内侧的细胞拭去以免残余的细胞着色后影响最终的细胞计数和统计。
然而，通常使用棉签很难将膜内侧的细胞全部拭去，因此这是制约本试验精确度的主要因素之一。
同时，甲紫染色后的细胞计数常由操作者在显微镜下完成，导致实验的最终结果缺乏稳定性和准确度。
此外，该方法只适宜于终点检测法，难以实时检测细胞的运动变化。
目前已有改良的方法或实验装置可弥补以上几点不足。
如在对发生迁移的细胞进行定量分析时，可以荧光染料将细胞着色，而后将底膜外侧的细胞经处理(如胰酶等)转移至计数板内，使用电子计数器对细胞总数进行定量分析。
又如Roche 和AceaBio公司联合开发的xcELLigenee系统，将经典的transwell实验装置与微电子阻抗感应系统整合，实现了对细胞运动的实时监测。
微电子阻抗系统所检测到的微电阻与细胞的数量，伸展状态，贴壁紧密程度等多项生理指标密切相
关，将其整合于内室底部微孔膜的下表面上，当细胞迁移至微孔膜底面时，则可引起细胞微电阻的升高，通过记录微电阻的变化可精确的反映细胞的运动状态。
该系统提高了传统transwell的精确度，同时可以获取细胞运动的实时动态数据。
然而，由于该系统需要借助于特殊的仪器设备，且成本相对较高，因此常应用于大规模及高通量的筛选工作。
二、二维平面内细胞运动的检测方法
1.划痕试验原理简单，操作便捷，不需要借助特殊的实验仪器，适用于任何具有贴壁特性的细胞，因此在细胞运动的检测中应用广泛。
本方法中，细胞运动的能力反映为划痕宽度的变化，通常情况下划痕由实验操作者以移液器的吸管端划出，导致划痕的宽度并不均一，因此在一定程度上影响了划痕愈合度的评估。
同时，有观点认为超过24小时的检测并不能排除细胞增殖对划痕愈合的影响，尽管在实验过程中通过降低培养基的血清浓度可在一定程度上削弱细胞增殖的影响，但划痕试验中观察时间点的设置仍宜控制在24小时以内。
此外，在人为制造划痕时可对周围细胞产生一定的机械损伤，可能会影响划痕边界周围细胞的活性和运动潜能。
同时，脱落的部分细胞可能在培养板静置后重新在无细胞区域定植和迁移，从而制造划痕愈合的假象。
目前，Applied BioPhysics公司推出了基于微电阻感应系统的划痕试验装置。
借助于整合在细胞培养板l的电极，通过电流的脉冲刺激可产生宽度恒定均一的无细胞区域。
同时通过检测无细胞区域的微电阻的增加，可以判断细胞向内迁移的数量。
这种改良后的装置实现了实验条件的标准化和实验结果统计的精准化，但其对设备器材的要求和成本均相对较高。
2.细胞排斥区检测该方法适宜于贴壁细胞运动能力的检测。
与划痕试验相比，由于阻碍物事先已置于细胞培养板中，因此该方法中形成的无细胞区域的边界清晰，大小相对恒定，具有良好的重复性和准确性。
目前，已有商品化的高通量实验装置可供选择。
3.栅栏式检测该方法的原理与间隙封闭法极为相似，仅仅是在种植细胞时的操作有所不同。
其优势与不足与间隙封闭法相似。
4.微球载体检测该方法的核心技术是将待测细胞均匀包被于微球载体之上。
因此，包被的成功率是制约该方法准确度的主要原因。
在实际操作中，应对每个包被过的微球载体进行细致的镜下检查以防止包被不充分的载体进入实验体系。
该方法的优势显而易见，由于微球载体的表面积局限且恒定，因而当细胞附着于载体上时其总数相对稳定。
同时，包被于载体上的单层细胞排列紧密，可在一定程度上模拟体内细胞的紧密连接状态。
但是该方法中用到的微球载体成本非常之高，因此目前该法仅用于极少数类型细胞运动能力的检测中。
5.细胞球迁移检测本方法与微球载体检测法的原理类似，其不同在于不使用任何载体而构建具有一定三维结构的由多层细胞构成的细胞球，因此适用于此法的细胞必须具备形成细胞球的能力。
细胞球由多层细胞由内向外依次组成，这可以更好地模拟生理状态下细胞之间的连接与微结构。
同时，细胞球中不同层次的细胞处于相对不同的微环境中，这也与体内环境下的状态相类似，特别是在模拟肿瘤细胞从原发灶中逐渐游离出来而发生转移中具有明显的优势。
此外，在细胞培养板中预铺基质细胞(如纤维细胞等)后可以模拟肿瘤细胞球与基质细胞相互作用而发生迁移和转移。
6.微流体小室迁移检测本方法最早见于白细胞运动能力的检测中。
该方法中所用的两个相互连接的小室容量较小，因此该方法特别适合涉及稀有类型细胞或珍贵物化材料的实验。
同时，小室本身较小的容量会给实验带来诸多不便之处，如操作中需要注意液体的蒸发，小室内的液体需高频率地更换以保证细胞的生长环境相对稳定。
7.毛细管迁移检测本方法适宜于白细胞运动的粗略检测，目前已被多种更为精确的检测手段所取代。
8.琼脂糖白细胞迁移试验该方法的成本低廉，试验结果的记录和分析较为简单，仅适用于白细胞运动能力的检测。
9.单细胞运动检测该方法最大的优势在于可实现对单细胞运动的追踪。
通过记录每个细胞的运动路径可以计算出细胞运动的速率。
然而，由于该体系内的细胞数极少，难以完成涉及细胞数较多的实验。
同时，实现对细胞的实时追踪依赖于全自动的数字分析记录系统，且其中获得的信息量相对较多，因此该方法的成本较高，对实验操作者的要求也相对较高。
三、依附于活细胞工作站的荧光显微镜记录技术
该方法最显著的优势在于可在活细胞状态下对细胞运动的相关信息进行直观而详尽的分析。
由于活细胞工作站整合了显微镜技术，可对细胞的运动轨迹进行记录。
特别是在共聚焦显微镜下，配合荧光染色技术，可咀实时观察细胞发生运动时形态与微结构的变化。
然而，该法的优势基于精密的实验体系，因此其成
本较高。
同时，传统的活细胞工作站更适宜于单个细胞的观察，难以获得细胞群落运动或迁移的信息。
高内涵细胞分析仪的出现解决了上述问题。
高内涵细胞分析仪保留了活细胞工作站的优点，借助于多通道的成像技术可以实现对多重荧光标记细胞的实时检测。
同时，高内涵细胞分析仪可完成高通量的实时检测，对单个细胞和细胞群落的运动均可进行分析。
借助于多重分析模块，可将实验周期内所有细胞的数据进行全记录与分析。