食物中维生素B12的测定方法
液相色谱法测定软胶囊中的维生素B12
液相色谱法测定软胶囊中的维生素B12摘要：本文建立了软胶囊中水溶性维生素钴胺素的高效液相色谱分析方法，该方法操作简便，耗时短。
取适量软胶囊内容物，加入正己烷涡旋使其充分溶解后，加入适量纯化水振荡提取30分钟，离心后取上清液重复提取一遍，合并提取液于25mL棕色容量瓶中用纯化水定容至25mL，取样液过0.22μm水系膜然后用高效液相色谱-紫外检测器测定。
结果显示，维生素B12的线性相关系数（r2）≧0.999，样品浓度的精密度≦5.0%，加标回收率为90%~100%。
该方法操作简便，分析时间短，回收率高，节省物力财力，稳定，准确，适用于软胶囊样品中钴胺素的检测。
关键词：维生素B12(钴胺素)；软胶囊；高效液相色谱-紫外检测器；Determination of Vitamin B12 in Soft Capsules by Liquid ChromatographyAbstract: This article establishes a high-performance liquid chromatography method for the analysis of water-soluble vitamin cobalamin in soft capsules. The method is simple and time-consuming. Take an appropriate amount of soft capsule content, add n-hexanevortex to make it fully dissolved, add an appropriate amount ofpurified water to shake and extract for 30 minutes, take thesupernatant after centrifugation and extract again, combine theextract solution in a 25mL brown volumetric flask, use purified waterto fix the volume to 25mL, and pass 0.22 for the sample solution μThe water system membrane was then determined using high-performance liquid chromatography ultraviolet detector. The results showed thatthe linear correlation coefficient (r2) of Vitamin B12 was ≥ 0.999,the precision of sample concentration was ≤ 5.0%, and the spiked recovery was 90%~100%. This method is easy to operate, has shortanalysis time, high recovery rate, saves resources and finances, is stable, accurate, and suitable for the detection of cobalamin in soft capsule samples.Key words: Vitamin B12 (cobalamin); Soft capsules; Highperformance liquid chromatography ultraviolet detector.维生素B12，又名钴胺素，是最新型的维生素。
农产品中维生素的测定原理
农产品中维生素的测定原理维生素是人体必需的有机化合物，它在人体内参与多种生化反应，维持正常生理活动。
因此，衡量农产品中维生素含量的准确性对于评估食物的营养价值和制定饮食计划至关重要。
测定维生素的常用方法包括化学方法、微生物发酵法、色谱法和光谱法等。
1.化学方法:化学方法通常基于化学反应原理，通过测定产生的反应物的数量或测定反应物与维生素的摩尔比来确定维生素的含量。
常用化学方法包括氧化-还原法、络合滴定法和显色滴定法。
例如，测定维生素C的浓度可以采用氧化还原反应，生成反应物的数量与维生素C的浓度成正比。
首先，将维生素C溶解于适当的溶剂中，然后用氧化剂如碘溶液滴定样品中的维生素C，直到滴定终点的颜色变化。
将已知浓度的标准溶液也进行同样的滴定，通过比较滴定终点的体积和标准溶液的体积，可以计算出待测样品中维生素C的浓度。
2.微生物发酵法:微生物发酵法利用特定微生物菌种的代谢产物来测定维生素含量。
维生素B族（如维生素B12）的测定通常采用这种方法。
在此方法中，特定菌株依赖特定维生素的辅助生长，测定菌株在不同维生素浓度下的生长情况，然后确定待测样品中维生素的浓度。
3.色谱法:色谱法基于维生素在固定相和流动相之间的相互作用来分离和测定维生素的浓度。
色谱法可以进一步细分为气相色谱法和液相色谱法。
在气相色谱法中，维生素通常首先被蒸发成气体，然后通过柱子中的固定相进行分离。
不同维生素的分子间相互作用和化学性质的不同导致不同维生素在柱子上停留时间的差异，从而实现分离。
液相色谱法则通过利用维生素在固定相（如色谱柱或薄层）和流动相之间的差异来分离不同维生素。
维生素在流动相中的溶解度和相互作用力的差异导致了不同维生素在固定相中的停留时间的差异。
4.光谱法:光谱法是一种通过测量维生素吸收或发射特定波长的光来测定维生素含量的方法。
吸收光谱法和荧光光谱法是常用的光谱法测定维生素的方法。
吸收光谱法通过测量维生素溶液对特定波长光的吸收程度来间接测定维生素的含量。
维生素B12含量测定
B12多少？如果每1ml标示量为1mg，则计 算标示量％
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紫外分光光度法 12
PHARMACEUTICAL COLLEGE
一、实验目的：
• 1、掌握Uvmini-1240型的使用方法。
• 2、掌握维生素B12注射液的紫外分光光度 法鉴别及含量测定。
• 3、掌握吸收系数法定量测定的计算公式。
• 4、熟悉绘制吸收曲线的一般方法。
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紫外分光光度法 5
PHARMACEUTICAL COLLEGE
• 按吸收系数法定量计算： C样品（μg/ml）=A361×48.31
见P92
C=ECL
A样品 B12含量= ———— × 100%
A对照
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取对照品测 A3紫61外做分对光光照度法 11
PHARMACEUTICAL COLLEGE
•
六、思考题
• 如果取注射液水2ml稀释30倍，在361nm处
做光谱图（粗扫描），在278nm，361nm，550nm处 有吸收峰。
• 2、精测：在以上278nm，361nm，550nm波长分别 ±1 范围内测定吸光度（每转换一次波长以水做空白） 记录各最大吸收值。
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紫外分光光度法 8
仪器的使用方法
开机：打开电源，仪器初始化，约3min完成，然后预热 大约0.5h。 方法菜单：
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紫外分光光度法 3
PHARMACEUTICAL COLLEGE
• 维生素B12是含钴的有机药物； • 为深红色结晶，又称为红色维生素B12或
氰钴胺； • 是唯一含有主要矿物质的维生素。 • 分子量：1355.38 • 分子式：C63H88CoN14O14P
维生素b12测定
2 方法与结果2.1 测定波长的选择维生素B12吸收光谱上有三个吸收峰：278 nm、361 nm、550 nm。
维生素B12在361 nm的吸收峰干扰因素少，吸收又最强，中国药典规定以361 nm处吸收峰的比吸光系数E1%1 cm值（207）为计算含量依据［2］。
本实验选择361 nm为测定波长，以标准曲线法为计算含量依据。
2.2 溶液的制备2.2.1 对照品溶液的制备［3］：精密称定对照品维生素B12 0.0025 g，置于25 mL容量瓶中，加水至刻度，摇匀。
将溶解后的溶液放置冰箱中冷藏备用。
2.2.2 供试品溶液的制备：维生素B12片剂为糖衣片，取本品50片，除去糖衣，使其呈现粉红色，研细，精密称定研磨样品，约相当于维生素B12 1.25 mg(每片的标示量为25.0 μg),置50 mL容量瓶中，加水35 mL，充分振摇30 min使其溶解，加水稀释至刻度，密塞，再用力振摇10 min，静置，取上清液，用0.8 μm的微孔滤膜滤过，滤液放置冰箱中冷藏备用。
2.3 线性关系标准曲线的绘制：精取2.2.1项下的储备液，用水分别按1.5、2、4、6、8、10、15、20倍稀释，摇匀。
在361 nm波长处测定吸光度，结果见表1。
表1 100 μg/mL标准品稀释倍数测定结果（略）以吸光度A与质量浓度c绘制标准曲线，得回归方程Y=0.0193X+0.048,r=0.9937。
结果表明维生素B12对照品溶液在5.00 μg/mL～100.00 μg/mL范围内质量浓度与吸收程度呈良好的线性关系。
见图1。
2.4 精密度试验精取浓度为100 μg/mL的对照品溶液在361 nm连续测定5次，测得维生素B12的平均吸光度为2.087，RSD为0.7%（n=5）。
RSD数值较小，说明该方法精密度好。
2.5 稳定性试验取同一供试品溶液，在冰箱中冷藏2 h、4 h、8 h、12 h、24 h后，按2.7项下含量测定法测定，结果见表2，计算得平均吸光度为0.468，RSD为0.99%（n=5）。
超高效液相色谱-串联质谱测定营养强化食品中维生素B12的含量
用 ＨＬ Ｂ（ ｈ ｙ ｄ ｒ ｏ ｐ ｈ ｉ ｌ ｅ — ｌ ｉ ｐ ｏ ｐ ｈ ｉ ｌ ｅ ｂ ａ ｌ ａ ｎ ｃ ｅ ｎ ｕ ｍｂ ｅ ｒ ）固相 萃取柱 进行 富集与 净化， 维生 素 Ｂ１ ２在
０ ． ５ ￣１ ０ ０ ． ０ ｇ ｇ ／ Ｌ浓度范 围内与 其响应值呈 良 好 的线性关系 ， 检 出限为 １ ． ０ ｇ ｇ ／ ｋ ｇ ， 说明该方法
具有分析速度快 、 灵敏度高 、 重复性好的优点， 适用于对营养强化食品 中维生素Ｂ ２ 含量的测定．
关键 词 ：维生素 Ｂ ２ ； 超高效液相色谱一 串联质谱； 营养强化食 品
Ａ ｂｓ ｔ ｒ ａ ｃ ｔ ：Ａ ｓ ｉ ｍｐｌ ｅ ， ｆ ａ ｓ ｔ ａ ｎ ｄ ａ ｃ ｃ ｕ ｒ ａ ｔ ｅ ｍｅ ｔ ｈ ｏ ｄ ｆ ｏ ｒ ｄ ｅ ｔ ｅ ｒ ｍｉ ｎ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｏ ｆ ｖ ｉ ｔ ａ ｍｉ ｎ Ｂ１ ２ ｉ ｎ ｏｒ ｆ ｔ ｉ ｉ ｆ ｅ ｄ ｆ ｏ ｏ ｄ ｓ ｉ ｓ ｄ ｅ ｖ ｅ ｌ ｏ ｐｅ ｄ ｕ ｓ ｉ ｎ ｇ ｕｌ ｔ ｒ ａ ｈ ｉ ｇ ｈ ｐ ｅ ｒ ｆ ｏ ｒ ｍａ ｎ ｃ ｅ ｌ ｉ ｑ ｕ ｉ ｄ ｃ ｈ ｒ ｏ ｍａ ｔ ｏ ｇ ｒ ａ ｐ ｈ ｙ — － ｔ ａ ｎ ｄ ｅ ｍ ｍａ ｓ ｓ ｓ ｐ ｅ ｃ — －
（ １ ． 上海德诺产 品检测有 限公司， 上海 ２ ０ ０ ４ ３ ６ ； ２ ． 上海大学 理学院一 海 ２ ０ ０ ４ ４ ４ ）
（ 本刊 编委 曹卫 国推荐）
摘 要： 采用 固相萃 取（ ｓ ｏ ｌ ｉ ｄ ｐ ｈ ａ ｓ ｅ ｅ ｘ ｔ ｒ ａ ｃ ｔ ｉ ｏ ｎ ， Ｓ Ｐ Ｅ ） 柱对 样品 中维 生素 Ｂ １ ２ 进行浓 缩与净化 ， 提 出了一种可 灵敏 测定营 养强 化食 品中维 生素 Ｂ １ ２ 含 量 的超 高效 液相色 谱一 串联质 谱（ ｕ ｌ ｔ ｒ ａ ｈ ｉ ｇ ｈ ｐ ｅ ｒ ｆ ｏ ｒ ｍ ａ ｎ ｃ ｅ ｌ ｉ ｑ ｕ ｉ ｄ ｃ ｈ ｒ ｏ ｍ ａ ｔ ｏ ｇ ｒ ａ ｐ ｈ ｙ — ｔ ａ ｎ ｄ ｅ ｍ ｍａ ｓ ｓ ｓ ｐ ｅ ｃ ｔ ｒ ｏ ｍ ｅ ｔ ｒ ｙ ， Ｕ Ｐ Ｌ Ｃ — ＭＳ ／ ＭＳ ） 方法 ，
微生食物中维生素B12的测定方法
微生食物中维生素B12的测定方法微生物测定法1.原理维生素B12对于Lactobacillus leichmannii （ATCC 7830）的正常生长是必需的，在一定生长条件下，Lactobacillus leichmannii的生长与繁殖速度和溶液中维生素B12的含量成一定的线性关系，利用浊度法或光密度法测定细菌生长和繁殖的强度可间接地测定食物样品中维生素B12的含量。
本方法最低检出限0.001ng。
2.适用范围本方法参考"Official Methods of Analysis of the Association of official Analytical Chemists"、"Methods of Vitamin Analysis"以及"Methods of the Microbiological Analysis of Selected Nutrients"。
本方法适用于测定食物及饲料中的维生素B12含量。
3.试剂本试验所用水均为蒸馏水，所用试剂均需分析纯试剂。
3.1 甲苯3.2 柠檬酸（C6H8O7·3H2O）3.3 磷酸氢二钠（Na2HPO4）3.4 焦亚硫酸钠（Na2S2O5）3.5 抗坏血酸（生化试剂）3.6 无水葡萄糖3.7 无水乙酸钠3.8 L-胱氨酸（生化试剂）3.9 D,L-色氨酸（生化试剂）3.10 10mol/L氢氧化钠溶液：称取200g氢氧化钠溶于适量水中，定容至500ml。
3.11 （1+4）乙醇溶液：200ml无水乙醇与800ml水充分混匀。
3.12 酸解酪蛋白：称取50g不含维生素的酪蛋白于500ml烧杯中，加200 ml 3 mol/L盐酸，121℃高压水解6小时。
将水解物转移至蒸发皿内，在沸水浴上蒸发至膏状。
加200ml水使之溶解后再蒸发至膏状，如此反复3次，以去除盐酸。
以溴酚蓝作外指示剂，用10mol/L氢氧化钠调节pH至3.5。
食品中的维生素含量测定与分析
食品中的维生素含量测定与分析维生素是人体必需的有机化合物，对人体的正常生长发育和健康维持起着重要作用。
食物是人们获取维生素的主要途径，而了解食品中维生素的含量，则对保持健康和合理膳食具有重要意义。
本文将介绍食品中维生素含量测定与分析的方法。
一、常见维生素及其作用维生素主要分为水溶性维生素和脂溶性维生素两类。
水溶性维生素包括维生素B系列和维生素C，它们在人体内不易储存，需要经常摄入；脂溶性维生素包括维生素A、维生素D、维生素E和维生素K，这些维生素可以在人体内储存，并随需要时释放出来。
维生素对人体的作用非常广泛，如维生素A能维护视力，维生素C有助于提高免疫力，维生素D有助于钙的吸收等。
二、维生素含量测定的方法1. 高效液相色谱法高效液相色谱法是目前常用的测定维生素含量的方法之一。
该方法原理简单、准确度高，能够分析多种维生素同时存在的情况。
通过高效液相色谱仪的分离柱将食品中的维生素分离开来，再利用检测器对其进行检测。
这种方法适用于各类食品的维生素含量测定。
2. 比色法比色法是一种基于化学反应的测定维生素含量的方法。
这种方法基于维生素与某种物质发生化学反应后的颜色变化进行测定。
比如，测定维生素C的含量可以采用二氯苯酚蓝消退法，利用蓝色二氯苯酚蓝与维生素C反应生成无色产物，通过比色测定反应前后的颜色差来计算维生素C的含量。
三、维生素含量测定与分析的实际应用维生素含量的测定与分析在食品加工和营养学研究中具有重要作用。
在食品加工过程中，了解食品中维生素的含量可以帮助生产商控制产品的质量，避免因维生素过多或过少而引起的问题。
在营养学研究中，测定食物中维生素的含量可以帮助人们制定合理的膳食方案，保证各类维生素的摄入，提供身体所需的养分。
另外，对于素食者或者存在维生素缺乏症状的人群来说，维生素含量的测定与分析更显得重要。
素食者由于不摄入动物食品，容易缺乏某些维生素，比如维生素B12。
而对于存在维生素缺乏症状的人群，通过测定其体内维生素的含量，可以了解其维生素摄入是否达标，并对其进行补充。
食品中的维生素的检测
食品中的维生素的检测维生素是人体所需的一类微量营养素，其在不同的食品中也含量不同。
为了确保人们摄取到足够的维生素，对食品中的维生素含量进行检测是非常重要的。
本文将介绍食品中常见的维生素及其检测方法和常见问题。
常见的维生素维生素C维生素C（抗坏血酸）是一种重要的水溶性维生素，对人体有许多好处，包括抗氧化、增强免疫力、促进胶原蛋白的生成等。
许多食物中都含有丰富的维生素C，如柑橘类水果、草莓、番茄、西兰花、绿叶蔬菜等。
维生素D维生素D是一种脂溶性维生素，对人体的钙吸收和骨骼生长发育具有重要作用。
维生素D主要来自阳光照射和食物摄入。
鱼肝油、蛋黄、奶制品等食品中含有较高的维生素D。
维生素B12维生素B12是人体必需的水溶性维生素之一，对于脑部和神经系统的正常功能具有重要作用。
维生素B12主要来自动物性食品，如肉、鱼、奶制品等。
检测方法维生素的检测方法主要是化学分析法和生物分析法。
目前广泛应用的是高效液相色谱法（HPLC）和光度法。
HPLC法HPLC法是一种高效分离技术，它通过溶液在高压作用下通过色谱柱，实现维生素的分离和检测。
该方法具有灵敏度高、准确度高、可靠性高等优点。
同时，该方法还可以同时检测多种维生素，具有较高的经济效益。
光度法光度法是通过分析样本中维生素对光线吸收的程度来测定维生素含量的方法。
该方法简便易行、成本低，但灵敏度相对较低。
常见问题维生素在什么条件下易失活？维生素在高温、酸性环境、阳光照射等条件下易失活，因此在食品贮存和加工过程中需要注意保持低温、避免酸性环境等。
维生素缺乏会导致哪些疾病？不同的维生素缺乏会导致不同的健康问题。
例如，维生素C缺乏可导致坏血病、牙龈出血等；维生素D缺乏可导致佝偻病等。
食品中有哪些因素会影响维生素的含量？食品加工过程中的烹调、存储等因素都会影响维生素的含量。
例如，高温和长时间加热会导致维生素C的流失；光照会导致维生素的降解等。
食品中的维生素含量对人体健康具有非常重要的影响，因此对食品中维生素的检测显得尤为重要。
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食物中维生素B6 的测定方法微生物法1.原理维生素B6在酸性介质中对热比较稳定，但在碱性介质中对热不稳定。
测量维生素B6比较经典的方法是"微生物法"它的优点是：1.特异性高、精密度好、操作简单（不需要特殊设备，易于推广，样品不需要进行一系列的提纯步骤）、准确度高。
它的缺点是：耗时长、必须经常保存菌种、试剂较贵。
2.适用范围GB/T 17407-1998，适用于药物、食物及饲料的检测3.仪器电热恒温培养箱电热手提式压力蒸汽消毒器液体快速混合器离心机722光栅分光光度计硬质玻璃试管4.试剂（1）0.22mol/L硫酸：于2000ml烧杯中加入700ml水，加入12.32ml H2SO4，用水稀释至1000ml。
（2）0.5mol/L硫酸：于2000ml烧杯中加入700ml水，加入28ml H2SO4，用水稀释至1000ml。
（3）10mol/L氢氧化钠：溶200g NaOH于水中，稀释至500ml。
（4）0.1mol/L氢氧化钠：取10ml 10mol/L NaOH，用水稀释至1000ml。
（5）溴甲酚绿：0.04%溶液，称取0.1g溴甲酚绿于研钵中，加1.4ml0.1mol/LNaOH研磨，加少许水继续研磨，直至完全溶解，用水稀释到250ml。
（6）培养基：称取吡哆醇Y培养基5.3g，溶解于100ml蒸馏水中。
（7）100ug/ml吡哆醇标准储备液：称取122mg盐酸吡哆醇标准溶于1L25%乙醇中，保存于4℃冰箱中，稳定1个月。
（8）1ug/ml吡哆醇标准中间液：，取1ml吡哆醇标准储备液，稀释至100ml。
（9）琼脂培养基：吡哆醇Y培养基5.3g，琼脂1.2g，稀释至100ml。
（10）1.5MOL/l生理盐水：取9gNaCl溶于1000ml水中。
5.菌种的制备与保存5.1储备菌种的制备与保存：以卡尔斯伯酵母菌A TCC No.9080简称SC?纯菌种接入2个或多个琼脂培养基管中，在30±0.5℃恒温箱中培养18-20小时，取出后置于冰箱中保存，至多不超过两星期。
保存两周以上的菌种，不能立即用作制备接种用的种子液，一定要在使用前每天移种一次，连续2~3天，方可使用，否则生长不好。
5.2种子培养液的制备：加0.5ml 50ng/ml的VB6标准应用液于尖管中，加入5ml基本培养基，塞好棉塞，于压力蒸汽消毒器内（高压锅）151b压力下消毒10min，取出，置于冰箱中，此管可保留数星期之久。
6.操作步骤整个步骤要避光（1）样品制备：取样0.5~10g（VB6含量不超过10ng）放入100ml三角瓶中，加0.22mol/LH2SO472ml。
放入高压蒸汽锅121℃下水解5个小时，取出，于水中冷却，用10mol/LNaOH和0.5mol/LH2SO4调PH值至4.5，用溴甲酚绿做指示剂。
（指示剂由黄-黄绿色），将三角瓶内的溶液转移到100ml容量瓶中，用蒸馏水定容至100ml，滤纸过滤，保存滤液即样液于冰箱内备测定（保存期不超过36小时）。
（2）接种液的制备：使用前一天，将卡尔斯伯酵母菌菌种由储备菌种管移种于已消毒的种子培养液中，可同时接种两管，在30±0.5℃的恒温箱中培养18-20小时。
取出离心10分钟（3000rpm）倾去上部液体，用已消毒的生理盐水淋洗2次，再加10ml消毒过的生理盐水，将离心管置于液体快速混合器上混合，使菌种成为混悬体，将此液倒入已消毒的注射器内，立即使用。
3.样品标准曲线的测定：取标准储备液2ml稀释至200ml成为中间液，从中间液中取5ml稀释至100ml作为工作液，浓度为50ng/ml，3组试管各加0，0.02，0.04，0.08，0.12，和0.16ml工作液，再加5ml吡哆醇Y培养基，混匀，加棉塞。
（3）试样的测定：在试管中分别加入0.05，0.10，0.20ml样液，再加入5ml吡哆醇Y培养基，用棉塞塞住试管，将制备好的标准曲线和试样测定管放入高压锅（121℃，15磅/英寸2）高压10min，冷至室温备用。
（4）接种和培养：每管接种一滴接种液，于30±0.5℃恒温箱中培养18-22小时（5）测定：从恒温箱中取出后，用722分光光度计测量，用空白管调零。
550nm波长下，测定各管的吸光度值，以标准管所含VB6的浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制VB6标准工作曲线，用测定管得到的吸光度值，在标准曲线上查到测定管内所含VB6的量。
7.计算各样管的吡哆醇含量A为：A（ng/ml）=（x1/V1+x2/V2+x3/V3）/3则样品的吡哆醇含量为：mg/100g=A×V×102/w×106=A×V/W×104每个样品各测定管的吡哆醇含量为x1，x2，x3；取液量分别为V1，V2，V3样品重W（g）取液量V（ml），定容至100ml8.注意事项（1）所有步骤需要避光处理（2）培养时每管必须在同一温度，培养时间以18-24hour为宜。
（3）本实验所有用水皆采用蒸馏水。
食品中维生素B6的测定【GB/T 17407—1998】本标准方法系在参考了美国公职分析家协会分析方法手册（AOAC）公定分析方法及国外有关资料的基础上，经过系统研究而制定出来的。
本方法特异性强、灵敏度高、不需特殊仪器，易于推广应用。
本标准由中华人民共和国卫生部提出。
本标准由中国预防医学科学院营养与食品卫生研究所负责起草；青海省卫生防疫站和昆明医学院参加起草。
本标准主要起草人：周瑞华、杨晓莉、王光亚。
本标准由卫生部委托卫生部食品卫生监督检验所负责解释。
1范围本标准规定了用微生物法测定食品中维生素B6的含量。
本标准适用于各类食品中维生素B6的测定。
2原理卡尔斯伯(Saccharomyces Carlsbrgensis)酵母菌需在有维生素B6存在的条件下才能生长，在一定条件下维生素B6的量与其生长呈正比关系。
用比浊法测定该菌在样品液中生长的混浊度，与标准曲线相比较得出样品中维生素B6的含量。
本方法检出限为0.1ng。
3试剂和培养基本实验所用的水均为蒸馏水。
所用的试剂均需分析纯。
3.10.22mol/L硫酸溶液：取12.3mL相对密度为1.84的硫酸加水稀释至1000mL。
3.24mol/L、1mol/L及0.1mol/L氢氧化钠溶液。
3.325%(V/V)乙醇溶液。
3.4维生素B6标准储备液(0.1mg/mL)：精确称取0.1220g经干燥恒重的盐酸吡哆醇标准品，用25%乙醇定容至1000mL。
冰箱中保存。
3.5维生素B6标准中间液(1.0μg/mL)：吸取5.00mL维生素B6标准储备液于500mL 容量瓶中，用25%乙醇定容。
冰箱中保存。
3.6维生素B6标准应用液(50ng/mL)：临用时吸取5.00mL维生素B6标准中间液于100mL容量瓶中，用蒸馏水定容。
3.7琼脂3.8吡哆醇Y培养基(Pyridoxine Y medium Difc 00951－15－2)：称取5.3g吡哆醇Y 培养基，用水稀释至100mL。
用时现配。
3.9琼脂培养基：称取5.3g吡哆醇Y培养基、1.2g琼脂于烧杯中，加入维生素B6标准中间液2mL(3.5)，加水至100mL，于水浴中加热溶解，趁热尽快分装入试管中，每管3～5mL，塞上棉塞，于121℃高压灭菌5min。
制成的斜面培养基，于4℃冰箱内保存。
3.10生理盐水：称取0.9g氯化钠溶解于100mL水中。
每次使用前，分别倒入2～4支15mL试管中，每支约10mL，塞上棉塞于121℃高压灭菌5min，备用。
3.110.04%溴甲酚绿溶液：称取0.1g溴甲酚绿于小研钵中，加1.4mL 0.1 mol/L氢氧化钠研磨，加少许水继续研磨，直至完全溶解，用水稀释至250mL。
4仪器和设备4.1实验室常用设备。
4.2电热恒温培养箱。
4.3压力蒸气消毒锅。
4.4液体快速混合器。
4.5离心机。
4.6分光光度计。
4.7耐热硬质玻璃试管：12mm(i.d)×160mm。
5菌种与培养液的制备及保存5.1储备菌种的制备：以卡尔斯伯酵母菌纯菌种(Saccharomyces Carlsbrgensis中科院微生物所No.AS：2.1419)接入2～3支琼脂培养基管中，在30℃恒温箱中培养18～20h，取出，于冰箱中保存不超过两周。
保存数周以上的储备菌种，不能立即做制备接种液用，必须在使用前每天移种一次，连续2～3次，才可使用。
5.2种子培养液的制备：加5mL吡哆醇Y培养基及维生素B6标准应用液0.2mL(3.6)于试管中塞上棉塞，于121℃高压灭菌5min，放冷，于冰箱中保存。
每次制备2～4管备用。
6操作步骤6.1种子液的制备：需无菌操作。
用接种环从新鲜琼脂斜面培养基上取下卡尔斯伯酵母菌转种到种子培养液(5.2)中塞上棉塞，以45°倾斜度于30℃温度下培养18～20h，在1500r/min下离心5～10min，弃去上清液，用灭菌生理盐水洗菌种两次，再用灭菌盐水5mL稀释该菌种，使成混浊液，即接种液。
6.2样品提取液的制备称取样品0.5～10g(维生素B6含量不超过10ng)放入100mL三角瓶中，加72mL 0.22mol/L硫酸溶液，用瓷坩埚盖于瓶口，于121℃高压水解样品5h，取出冷却后，加约10mL4mol/L氢氧化钠，以滇甲酚绿作外指示剂，调节pH值至4.5(指示剂由蓝绿色变为黄绿色)。
将三角瓶内容物移至100mL容量瓶中，加水定容至刻度，用滤纸过滤后，滤液于冰箱中保存备用(保存期不宜超过36h)。
6.3样品试液管的制备每支试管中分别加入0.05，0.10，0.20mL的样品提取液，每个样品需做两组，再加入5mL吡哆醇Y培养基。
6.4标准系列管的制备每支试管中分别加入维生素B6标准应用液0，0.02，0.04，0.08，0.12，0.16mL(相当于维生素B60，1.0，2.0，4.0，6.0，8.0ng)，然后各加入5mL吡哆醇Y培养基。
6.5灭菌样品管(6.3)和标准管(6.4)混匀后，塞上棉塞，于121℃高压灭菌5min。
6.6接种和培养待试管冷至室温后，在无菌条件下操作，用注射器在每支试管中接种一滴种子液，混匀后，于30℃温箱内培养18～20h。
6.7测定将培养后的标准系列管和样品管，在液体快速混合器上混匀后立即测定混浊度。
用分光光度计于550nm波长下以标准系列的空白管调零点，分别读取各管的光密度值。
7计算以标准系列的含量(ng)为横坐标，以所对应的标准系列的光密度值为纵坐标，绘制标准曲线。
用样品的光密度值在标准曲线上查出每管中维生素B6含量，再折算成每毫升样品中维生素B6含量。
c＝(u1十u2十u3)/3 (2)式中：X——样品中维生素B6的含量，mg/100g；c——样品提取液中维生素B6的浓度，ng/mL；μ——各样品测定管中维生素B6的浓度，ng/mL；V——样品提取液的定容总体积，mL；m——样品质量，g；100/106——折算成每100g样品中维生素B6毫克数。