HPLC测定18种氨基酸
PITC柱前衍生HPLC氨基酸比值测定
PITC柱前衍生高效液相法测定缩宫素氨基酸比值.、八、-一. 刖言目前，氨基酸检测主要应用氨基酸自动分析仪和HPLC随着HPLC勺发展，使用HPLC技术分析氨基酸获得迅速发展。
HPLC已成为一种较为理想的检测氨基酸的方法。
HPLC检测氨基酸时，使用不同衍生剂反应后产生不同的衍生物，不同的衍生物所需色谱条件也有差别。
查阅相关的研究报告，所使用的衍生剂及色谱条件也不尽相同。
每种方法各有自己的优缺点，应根据所测样品的特性和仪器、试剂条件作出选择，最后选择异硫氰酸苯酯（PITC）柱前衍生法测定缩宫素氨基酸比值。
二•准备工作主要设备和试剂1.氨基酸分析专用柱（ 4.6 X 250，5um) 1支Agela 公司2.咼效液相检测仪 1 台安捷伦3.十八种氨基酸 1 套中检所4.异硫氰酸苯酯10 瓶Agela 公司5.三乙胺2 瓶Agela 公司试剂配制1.三乙胺乙腈溶液：取三乙胺1瓶，加乙腈8.6ml，混匀。
2.异硫氰酸苯酯乙腈溶液：取异硫氰酸苯酯1瓶，加乙腈2ml，混匀。
4 C 3天3.流动相A:称取三水醋酸钠25.3g （或无水醋酸钠15.2g ），加水1400ml，用冰醋酸调节pH6.5，用水使成1860ml，再加乙腈140ml，使成2000ml，0.45um醋酸纤维膜过滤。
4.流动相B: 80汇腈，0.45um有机膜过滤。
5.氨基酸标准贮备液中检所十八种氨基酸，105C 3小时。
使用十万分子一天平。
半胱氨酸是以胱氨酸折算成两份半胱氨酸进行计算。
用0.1mol/L盐酸溶解至250ml。
衍生方法取标准品（样品）0.2ml，力卩100mmol/L异硫氰酸苯酯乙睛溶液0.1ml，力卩1mol/L三乙胺乙睛溶液0.1ml，混匀，室温放置1小时，加入0.4ml正己烷，振摇，放置10分钟，取下层清液过滤后进样。
三•实验部分1.色谱条件选择1.1精密量取2ml氨基酸标准储备液，至20ml容量瓶，加0.1mol/L盐酸溶液至刻度。
一种C57小鼠脑组织和血浆中18种氨基酸测定的前处理方法[发明专利]
![一种C57小鼠脑组织和血浆中18种氨基酸测定的前处理方法[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/563a963102d8ce2f0066f5335a8102d276a261b6.png)
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010726469.9(22)申请日 2020.07.25(71)申请人 重庆医科大学地址 400016 重庆市渝中区医学院路1号(72)发明人 蒋心惠 李建沙 张静 龚涛 (51)Int.Cl.G01N 1/28(2006.01)G01N 21/31(2006.01)G01N 30/06(2006.01)G01N 30/74(2006.01)(54)发明名称一种C57小鼠脑组织和血浆中18种氨基酸测定的前处理方法(57)摘要本发明公开了一种C57小鼠脑组织和血浆中18种氨基酸测定的前处理方法，属于生物样品内源性物质前处理领域。
该方法使用紫外分光光度计和高效液相色谱仪，对采取液液萃取结合蛋白质沉淀法处理脑组织匀浆和血浆的方法进行考察，主要考察了样品前处理方法对样品中蛋白质去除量、总脂质去除量、18种氨基酸提取量的影响，进一步优化得到一种C57小鼠脑组织和血浆中18种氨基酸测定的最佳前处理方法。
权利要求书1页 说明书4页 附图5页CN 111829851 A 2020.10.27C N 111829851A1.一种C57小鼠脑组织和血浆中18种氨基酸测定的前处理方法，其特征在于，包括如下步骤：第一步，制备脑组织匀浆与血浆精密称定C57小鼠脑组织，按1：5～1：20(脑组织重量:超纯水＝mg：μL)的比例加入超纯水，以手持匀浆器匀浆30～90s，得到脑组织匀浆，将从眼眶取血得到的样品，离心取上清，得到待处理血浆；第二步，样品处理取100μL～300μL样品，加入100μL～300μL的甲基叔丁基醚，经涡旋震荡、离心、弃上层，以除去样品中的脂质；取100μL～300μL的上述去脂质样品，加入100μL～300μL的蛋白沉淀剂，经涡旋震荡、离心、取上清，以除去样品中的蛋白质；第三步，样品处理后总蛋白质和总脂质含量考察取100μL～300μL经处理后的样品，使用紫外分光光度计在280nm处测定样品的吸光度，考察经处理后的脑组织样品中总蛋白质含量；取100μL～300μL上述经处理后的样品于玻璃试管内，挥干溶剂，加入200μL浓H 2SO 4(96％)，涡旋，90℃水浴加热20min后迅速冷却至室温，再加入200μL 1mg ·mL -1香草醛溶液(17％的磷酸溶液配制)，常温下避光反应后，在500nm～550nm波长下测定吸光度；第四步，HPLC二极管阵列检测器切换荧光检测器考察杂质去除量和氨基酸提取量HPLC的液相条件包括色谱柱、流动相A和流动相B，其中色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶柱，流动相A为甲醇，流动相B为30mmol ·L -1和pH为6.20的乙酸钠缓冲溶液，脑组织和血浆样品中的氨基酸通过邻苯二甲醛衍生后测定，进样量为20μL，流速为0.9mL ·min -1，柱温为30℃，PDA检测器的检测波长选取230nm，荧光检测器的激发波长为340nm，发射波长为450nm；第五步，确定样品前处理条件经第四步的结果选择前处理方法，选择直接采用0.1～0.5mol ·L -1的高氯酸溶液去除样品中的脂质和蛋白质，为进一步优化样品前处理方法，对高氯酸的用量进行优化，按照1：3～1：9(样品：高氯酸溶液＝μL：μL)比例处理样品，按不同比例的0.1～0.5mol ·L -1高氯酸处理后的样品，经总蛋白质和总脂质含量考察，优化得到样品前处理方法；2.本文中所述的样品是C57小鼠脑皮层和血浆，18种氨基酸是：谷胱甘肽(Gsh)、天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、丝氨酸(Ser)、谷氨酰胺(Gln)、瓜氨酸酸(Cit)、甘氨酸(Gly)、精氨酸(Arg)、牛磺酸(Tau)、酪氨酸(Tyr)、丙氨酸(Ala)、γ-氨基丁酸(GABA)、、色氨酸(Trp)、甲硫氨酸(Met)、缬氨酸(Val)、苯丙氨酸(Phe)、异亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)。
高效液相色谱法测定氨基酸
脑蛋白水解物溶液氨基酸含量分析方法研究方案1、仪器与试药1.1 仪器1525型高效液相色谱仪（美国Waters公司）；Waters1525型泵，Waters2487型检测器，Waters5CH 型柱温箱，WatersBREEZE数据处理软件，水浴恒温器（精度±0.1℃），旋涡器，微量移液器，衍生专用管；CP225D型分析天平（德国）；4umNora-Pak TM C18（3.9mm×150mm，5μm）色谱柱（美国）1.2 药品与试剂16种氨基酸（门冬氨酸、丝氨酸、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、精氨酸、苏氨酸、丙氨酸、脯氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸）由中国药品生物制品检定所提供。
脑蛋白水解物注射液，云南盟生药业有限公司生产，规格10ml/支。
批号：2013、2013、2013.乙腈（HPLC级）；EDTA（分析纯）；磷酸（分析纯）；二乙胺（分析纯）；三水合乙酸钠（分析纯）。
2、方法与结果2.1色谱条件流动相A为AccQTag醋酸—磷酸盐缓冲液；由AccQTagEluent A浓缩制备AccQTag洗脱液,用前稀释10倍（或按以下方法配制：称19.04g三水合乙酸钠，加1000ml纯化水，搅拌，溶解，用50%H3PO4将pH调至5.2，加入1ml 1mg/ml的EDTA溶液，加入2.37ml二乙胺，用50%H3PO4滴定至pH4.95，用水溶性过滤器过滤，超声，脱气，备用。
）；流动相B为60% HPLC级乙腈，按梯度表梯度洗脱；流速1.0ml/min；检测波长为254nm；进样量5μl；柱温38℃。
2.2对照品溶液、供试品溶液的制备分别精密称取16种氨基酸标准品，用纯化水配制成浓度如下表所示的混合溶液。
取上述溶液0.1ml，加纯化水0.9ml，旋涡器混匀，作为对照品溶液；取脑蛋白水解物注射液，加水稀释成含总氮为1mg/ml的溶液，取0.1ml，加纯化水0.9ml,旋涡器混匀，作为供试品溶液。
AccQ-Tag法测氨基酸含量SOP
AccQ-Tag法测氨基酸含量1.所需设备及试剂1.1.设备：a.天平（精度0.1mg）；b.pH计（精度0.01级）；c.单标线吸管（50ml）；d.容量瓶（500ml）；e.溶剂过滤器及滤膜（0.45µm）；f.试管（1.5×15cm，1.5×10cm）；g.样品管（6×50mm）；h.微量进样器（10µl）；i.微量可调移液器（20µl，100µl，1000µl）及吸头；j.旋涡混匀器；k.烘箱（55℃）；l.HPLC系统及AccQ-Tag柱。
1.2.试剂：a.超纯水（≥18MΩ∙cm）；b.乙腈（HPLC级）；c.Waters AccQ-Tag流动相A浓液d.Waters氨基酸水解液标准（H）；e.Waters AccQ-Fluor试剂盒（包括硼酸缓冲液1、衍生剂粉2A、稀释液2B）。
2.流动相A制备：吸取50ml Waters AccQ-Tag流动相A浓液，放至500ml容量瓶中，加超纯水至刻度，用0.45µm滤膜过滤后备用。
3.衍生3.1.标定标准制备3.1.1.1mmol/L色氨酸标准液：称取色氨酸（生化试剂）20.4mg，加超纯水溶解至100ml。
3.1.2.含色氨酸的标定标准：取1支Waters氨基酸水解液标准，打开后吸取1ml，放至一支干净的1.5×15cm试管中，加2.5ml色氨酸标准液，6.5ml超纯水，旋涡混匀，每支Eppendorf 管分装1ml备用。
（此标准含有的色氨酸的浓度与其它氨基酸一样，为0.25mmol/L。
）3.1.3.10倍稀释后的标准可在–20℃保存1个月。
剩余的氨基酸水解液标准可在–20℃保存3个月。
未启封的氨基酸水解液标准可在4℃保存1年。
使用–20℃保存的标准应充分解冻并混匀。
3.2.衍生试剂制备3.2.1.将烘箱预热至55±1℃；3.2.2.取一瓶衍生剂粉2A，轻轻敲动以确保打开前所有粉末落在瓶底；3.2.3.吸取1ml稀释液2B并弃去以冲洗一个干净的微量移液吸头；（警告：稀释液2B为乙腈，可燃且有毒，参考安全数据表。
PITC柱前衍生高效液相色谱法测定接骨木果实中氨基酸含量
PITC柱前衍生高效液相色谱法测定接骨木果实中氨基酸含量于洪超;马荣申;郭庆梅;周凤琴;郭俊国【摘要】为了测定接骨木果实中游离氨基酸和水解氨基酸含量,采用PITC柱前衍生高效液相色谱法(RP-HPLC)以异硫氰酸苯酯(PITC)作柱前衍生试剂,采用RP-HPLC梯度洗脱的方法测定接骨木果实中的游离和水解氨基酸的峰面积并计算其含量.结果表明:接骨木果实中氨基酸和水解氨基酸的含量分别为2.107％和7.297％;18种氨基酸分离良好,线性关系良好,空白无干扰,精密度RSD在0.634％～2.532％,稳定性RSD在0.729％～2.774％,重复性RSD在0.664％～2.884％,平均回收率在95.49％～103.67％,且RSD均小于3％.RP-HPLC法灵敏、简便、快捷,能准确测定接骨木果实中游离氨基酸和水解氨基酸的含量.【期刊名称】《贵州农业科学》【年(卷),期】2015(043)008【总页数】4页(P213-216)【关键词】接骨木;游离氨基酸;水解氨基酸;异硫氰酸苯酯;高效液相色谱法【作者】于洪超;马荣申;郭庆梅;周凤琴;郭俊国【作者单位】山东中医药大学药学院,山东济南250355;济南天红苗木种植技术研发中心,山东济南250400;山东中医药大学药学院,山东济南250355;山东中医药大学药学院,山东济南250355;山东中医药大学眼科研究所,山东济南250002【正文语种】中文【中图分类】S567接骨木（Sambucus williamsii Hance）又名公道老、马尿骚等，为忍冬科（Caprofoliaceae）接骨木属（Sambucus L．）植物［1］。
接骨木的果实是一种具有极高开发利用价值的功能性产品，除含有大量对人体有益的不饱和脂肪酸外，还含有种类丰富的氨基酸［2］。
氨基酸含量是衡量接骨木果实营养价值高低和资源开发利用价值的重要指标。
氨基酸的分析测定多是通过离子交换树脂分离，然后通过柱后衍生化反应，再经紫外检测器检测分析，此方法分析时间长、灵敏度低，且仪器复杂、价格昂贵，严重限制其推广应用。
高效液相色谱法测定氨基酸的研究进展
高效液相色谱法测定氨基酸的研究进展赫欣睿;武中庸;叶永丽;高旭东;陈士恩;马忠仁【摘要】氨基酸是构成生物体的基础物质,氨基酸分析是生命科学研究中最重要的领域之一.高效液相色谱法因分析速度快、操作简便、检测灵敏、适用范围广等优点而广泛应用于食品工业、制药工业、生命科学研究等领域.该文综述了高效液相色谱分析氨基酸的方法,包括柱后衍生法、柱前衍生法、高效阴离子交换色谱-积分脉冲安培检测法和高效液相色谱-蒸发光散射检测法.并对上述方法进行了比较,为日常的氨基酸分析提供了参考.【期刊名称】《分析测试学报》【年(卷),期】2016(035)007【总页数】7页(P922-928)【关键词】氨基酸;高效液相色谱法(HPLC);柱前衍生;柱后衍生;综述;研究进展【作者】赫欣睿;武中庸;叶永丽;高旭东;陈士恩;马忠仁【作者单位】西北民族大学生命科学与工程学院,甘肃兰州730124;西北民族大学生命科学与工程学院,甘肃兰州730124;西北民族大学生命科学与工程学院,甘肃兰州730124;西北民族大学生命科学与工程学院,甘肃兰州730124;西北民族大学生命科学与工程学院,甘肃兰州730124;西北民族大学生命科学与工程学院,甘肃兰州730124【正文语种】中文【中图分类】O657.72;O629.7氨基酸是构成蛋白质大分子的基础物质，与生命活动息息相关。
目前，自然界中发现的氨基酸约有300种，而组成生物体蛋白质的氨基酸约有20种。
氨基酸分析在生物化学、食品科学、临床医学、饲料科学、化工等领域具有重要作用，因此改进和发展氨基酸的分析方法对于人类具有重要意义。
高效液相色谱法(High performance liquid chromatography，HPLC)是在经典液相色谱和气相色谱的基础上发展的新型分离分析技术，具有分离效能高、速度快、操作简便、检测灵敏度好、对样品适用范围广等特点，已广泛应用于各领域。
高旭东等[1]建立了黄芩苷、盐酸小檗碱和大黄素的高效液相色谱检测方法。
色氨酸的检测
色氨酸、含硫氨基酸和18种蛋白水解氨基酸的检测
色氨酸、含硫氨基酸和蛋白水解氨基酸的检测是氨基酸例行分析中的三个重要组成部分。
色氨酸Tryptophan)是一种重要的人体和畜禽、鱼类生长的必需氨基酸，广泛用于医药、食品和饲料添加剂。
色氨酸分析方法有色谱法（离子交换、HPLC）、比色法、荧光法等。
色谱法由于兼有分离和检测双重功能而被广泛采用。
如何一机多用利用已有的氨基酸分析仪取代HPLC仪器完成色氨酸分析，具有实际意义。
含硫氨基酸是指蛋氨酸（Methionine）和胱氨酸（Cystine）。
它们是动物发育的必需氨基酸。
由于常规的酸水解法导致含硫氨基酸的破坏，测定含硫氨基酸时须采用氧化酸水解法。
经氧化水解后蛋氨酸1:1转化为蛋氨砜（Methionine sulphone），胱氨酸1:1转化为磺基丙氨酸(Cysteic acid)。
本文根据阳离子交换分离、柱后茚三酮衍生光度法检测的化学原理， 借助最新型氨基酸分析仪A300的仪器技术，提出了包括色氨酸、含硫氨基酸和蛋白水解氨基酸在内的21种氨基酸的分析方法。
方法操作简便,重现性好, 灵敏度高。
附图1: 蛋白水解氨基酸、含硫氨基酸和色氨酸的标准谱图
蛋白水解氨基酸、含硫氨基酸和色氨酸的标准谱图。
柱后衍生-高效液相色谱法测定青稞黄酒中的18种氨基酸
柱后衍生-高效液相色谱法测定青稞黄酒中的18种氨基酸诸葛庆;李博斌;周牡艳;葛乐勇【摘要】采用茚三酮柱后衍生,高效液相色谱法测定了青稞黄酒中的18种氨基酸.结果表明,18种氨基酸回收率为95.1 %～102.5 %,相关系数0.9962～0.9999,检出限0.25～4.00 μmol/L.在所分析的4种青稞黄酒样品中,氨基酸含量为456.10～760.18 mg/L.青稞黄酒中的呈味氨基酸以甜味氨基酸和涩味氨基酸为主,占76 %以上.【期刊名称】《酿酒科技》【年(卷),期】2010(000)006【总页数】3页(P94-96)【关键词】分析检测;柱后衍生;高效液相色谱法;氨基酸;青稞黄酒【作者】诸葛庆;李博斌;周牡艳;葛乐勇【作者单位】国家黄酒产品质量监督检验中心,浙江,绍兴,312071;国家黄酒产品质量监督检验中心,浙江,绍兴,312071;国家黄酒产品质量监督检验中心,浙江,绍兴,312071;国家黄酒产品质量监督检验中心,浙江,绍兴,312071【正文语种】中文【中图分类】TS261.7;TS262.4;O657.72青稞也叫元麦、淮麦、米麦、米大麦,是大麦的一种特殊类型,因其内外颖壳分离,籽粒裸露,故称裸大麦，青稞主要分布在我国西藏、青海等地高海拔高寒地区[1-2]。
青稞富含蛋白质、碳水化合物，并含有较丰富的矿物质及维生素，是一种很好的酿酒原料,青稞黄酒是以青稞为原料，采用黄酒酿造工艺酿制而成的发酵酒，其酒度低，营养价值丰富，富含多种氨基酸[3-4]。
氨基酸不仅是青稞黄酒的主要营养成分之一，也是酒的风味物质或风味物质的前驱物质，对酒的风味有着重要的贡献[5]，因此，准确测定青稞黄酒中氨基酸的含量对研究黄酒的营养价值和风味及对酒质的控制都具有极其重要的意义。
常用的氨基酸分析方法有离子交换色谱法[6]、氨基酸自动分析仪法[7]、高效液相色谱法[8]、液质联用法[9]。
考虑到成本及一机多用，本研究采用柱后衍生-高效液相色谱法测定青稞黄酒中的氨基酸，其原理是氨基酸经钠离子交换柱分离后与茚三酮反应，在570 nm进行测定。